Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.

Methodenartikel

Opstellen van in-vitromodellen van dorsale wortelgangliacultuur: complementaire benaderingen voor het onderzoeken van overspraak tussen kanker en zenuw

2.7K weergaven

⸱

DOI:

10.3791/68552

⸱

11 juli 2025

 ,  ,  ,  ,  , 
1Division of Cancer Biology and Genetics, Sinclair Cancer Research Institute, and Department of Pathology and Molecular Medicine, Queen's University, 2Laboratory of Mutagenesis and Oncogenetics, Department of General Biology - Center for Biological Science, State University of Londrina

In dit artikel

Samenvatting

Dit protocol beschrijft methoden voor het vaststellen van hele berg en gedissocieerde culturen van muis Dorsal Root Ganglia (DRG) en hun gebruik om tumor-zenuwinteracties te beoordelen.

Samenvatting

De bijdrage van het zenuwstelsel aan de micro-omgeving van de tumor en het belang van neurale invasie als route voor de verspreiding van kanker worden steeds meer erkend. Interacties van kankercellen met neuronen kunnen hun invasie rond en in zenuwen bevorderen, een kenmerk van veel kankers met slechte klinische resultaten. In vitro modellen om wederzijdse interacties tussen neuronen en kankercellen te bestuderen, bieden waardevolle hulpmiddelen voor het begrijpen van de verspreiding van kanker en het identificeren van benaderingen om deze te verminderen.

Hier beschrijven we een protocol voor isolatie van muizen dorsale wortelganglia (DRG) en het opzetten van zowel hele berg als gedissocieerde monolaagculturen die kunnen worden gebruikt om de morfologie van neuronen en de uitgroei van neurieten in de loop van de tijd te visualiseren. Hele DRG's die in Matrigel zijn gemonteerd, behouden de zenuwarchitectuur en reacties op stimuli in een heterogene omgeving die meer lijkt op de in vivo zenuw, terwijl gedissocieerde zenuwculturen een nauwkeurigere beoordeling van directe cel-celinteracties mogelijk maken. Zodra DRG-culturen zijn vastgesteld, kunnen kankercellen worden toegevoegd om co-culturen te genereren die kunnen worden gebruikt om veranderingen in de uitgroei van neurieten en zenuwmorfologie te visualiseren als reactie op kankercellen. Groei of beweeglijkheid van kankercellen als reactie op zenuwsignalen in de loop van de tijd of onder omstandigheden van groeistimulatie of -remming kan worden beoordeeld, evenals het visualiseren van de effecten van direct contact tussen kankercellen en zenuwextensies.

Aangezien beide co-cultuurmodellen tegelijkertijd kunnen worden gegenereerd, biedt dit protocol een uitgebreider beeld van de impact van kanker-neuroninteracties en vergemakkelijkt het vergelijkingen van behandelingscondities en integratie van informatie van cellulair niveau en hele ganglia. Dit protocol zal de studie van zenuw-tumorinteracties vergemakkelijken en kan worden gebruikt voor een breed scala aan toepassingen, waaronder studies naar celsignalering, screening van geneesmiddelen of onderzoek naar de heterogeniteit van de tumor-zenuwomgeving en de mechanismen van tumorverspreiding langs zenuwen.

Inleiding

Tumorverspreiding, door lokale invasie en regionale of verre metastase, is de primaire doodsoorzaak door kanker. Hoewel het onderzoek zich heeft gericht op vasculaire of lymfatische verspreidingsroutes, wordt neurale invasie van tumorcellen vaak waargenomen bij veel solide tumoren, waaronder pancreas 1,2, prostaat3, hoofd en nek4, borst5 en colorectale6 kankers. In de afgelopen jaren hebben talrijke onderzoeken de opkomende rol van zenuwen benadrukt bij het bevorderen van tumorgroei en -progressie, en als verspreidingsroutes, die de ontwikkeling van metastasen stimuleren 7,8. In deze context is de kankerneurowetenschap naar voren gekomen als een prominent onderzoeksgebied, dat nieuwe perspectieven biedt in de oncologie door de interacties tussen tumorcellen en de fundamentele componenten van het perifere zenuwstelsel (PNS) op te helderen die kunnen bijdragen aan deze processen 8,9.

Het PZS bestaat uit zowel perifere zenuwen als ganglia, dit zijn heterogene structuren die zijn samengesteld uit verschillende celtypen, waaronder neuronen van verschillende grootte en functies, Schwann en andere gliacellen, fibroblasten, macrofagen, mestcellen, melanocyten en vasculaire endotheelcellen die de lokale vasculatuur vormen10. Het PNS is een cruciaal onderdeel van de micro-omgeving van de tumor (TME), en wederzijdse communicatie tussen kankercellen en zenuwen, hetzij direct door fysiek contact of indirect door de afgifte van neurotrofe factoren, neurotransmitters, groeifactoren en andere signalen, kan neurale invasie vergemakkelijken en agressievere fenotypes bevorderen8.

In vitro modellen kunnen worden gebruikt om de processen te karakteriseren die bijdragen aan zenuwonderhoud en -herstel en worden steeds vaker gebruikt om cellulaire interacties tussen zenuwen en kankercellen te onderzoeken11,12. Een veelgebruikt in vitro model betreft geëxtraheerde dorsale wortelganglia (DRG) van muizen die samen met tumorcellenzijn gekweekt 11. Deze modellen gebruiken vaak tweedimensionale (2D) monolaagcultuur van gedissocieerde DRG-cellen om neuronale biologie in vitro te bestuderen en zijn gebruikt om cellulaire interacties in het PNS te modelleren13,14. 2D-culturen missen echter de complexiteit van de micro-omgeving van de zenuw en geven de in vivo architectuur slecht weer. Driedimensionale (3D) hele reeksen perifere neuronen of ganglia bieden een alternatief dat de perifere zenuwfysiologie effectiever recapituleert om de interacties tussen zenuw en omgeving holistischer weer te geven 15,16,17,18. De heterogeniteit van dit model beperkt echter het vermogen om cel-celinteracties te visualiseren of te kwantificeren, en deze modellen zijn effectiever voor het observeren van algemene perifere zenuwreacties dan voor het onderzoeken van specifieke cellulaire interacties en mechanistische reacties op stimuli. Het is dus duidelijk dat gedissocieerde en hele mount neuronale culturen complementair zijn en dat evaluatie van 2D- en 3D-modellen parallel optimaal is om zowel de algehele effecten als de individuele celreacties op stimuli te beoordelen.

Dit protocol beschrijft methoden voor het genereren van complementaire gedissocieerde (2D) en hele mount (3D) zenuwculturen die kunnen worden gebruikt om zenuw- en kankercelinteracties op zowel cellulair als weefselniveau te evalueren, waardoor een uitgebreider beeld van deze interacties wordt geboden dan methoden die slechts één type cultuur gebruiken 1,13. Deze modellen kunnen worden gebruikt om cellulaire processen te visualiseren en te beoordelen, waaronder de morfologie van zenuwcellen en de uitgroei van neurieten, evenals tumorcelreacties op door zenuwen uitgescheiden chemotactische middelen, zoals neurotrofe factoren, en overspraak tussen sensorische neuronen en tumorcellen. Het maakt het ook mogelijk om mogelijke interacties tussen tumorcellen en andere componenten van de neurale micro-omgeving, zoals immuuncellen, fibroblasten en glia, te onderzoeken. We benadrukken de toepassing van deze modellen om zenuw-kankercelinteracties in de loop van de tijd te bestuderen, gevisualiseerd door levende celkleuring of immunofluorescentie, als voorbeelden van benaderingen om celinteracties en -responsen te beoordelen of te kwantificeren. Samen kunnen de resultaten van het gebruik van deze methoden ons begrip vergroten van hoe het zenuwstelsel de groei en verspreiding van kanker bevordert, en ons helpen strategieën te ontwikkelen om deze mechanismen aan te pakken.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

Al het muizenwerk werd beoordeeld en goedgekeurd door het Office of the University Animal Care Committee van Queen's University (protocolnummer 2524). Dieren werden gehouden en geëuthanaseerd voor weefselafname in overeenstemming met de ethische richtlijnen van de Canadian Council on Animal Care en het National Centre for the Replacement, Refinement & Reduction on Animals in Research (VK). In dit protocol hebben we weefsel gebruikt dat is geïsoleerd uit C57BL/6-dieren, maar ook met succes andere genotypen gebruikt, waaronder Rag2IL2Rγc KO-dieren. Secties 1-6 kunnen worden uitgevoerd in een schone omgeving op een met oppervlak gesteriliseerde laboratoriumbank (zie figuur 1), terwijl secties 7-9 moeten worden uitgevoerd in een biologische veiligheidskast. Voor een beter begrip zijn schematische weergaven van de genoemde stappen gemaakt (Figuur 1).

1. Bereiding van voorraadoplossingen

  1. Bereid Papaïne oplossing en Collagenase IV/Dispase II oplossing. Los papaïne op in steriel PBS (fosfaatgebufferde zoutoplossing) in een concentratie van 30 E/ml; bewaren in 1 ml aliquots bij -20 °C. Los Collagenase Type IV op bij 1,25 mg/ml en Dispase II bij 2,5 mg/ml in PBS. Bewaren in hoeveelheden van 1 ml bij -20 °C.
  2. Bereid Neurobasale kweekmedia (F12) aangevuld met 2% B27-supplement (50x stockoplossing), 10% foetaal runderserum (FBS) en 1% penicilline-streptomycine (Pen-Strepto) (100x stockoplossing).
  3. Bereid Hank's Balanced Salt Solution (HBSS) met 1% penicilline-streptomycine (100x voorraadoplossing).
    OPMERKING: Om de initiële overleving en hechting van de cellen te ondersteunen, wordt F12-media aangevuld met 10% FBS gebruikt om de vestiging van de culturen te verbeteren. FBS bevordert echter ook de proliferatie van niet-neuronale cellen, waaronder fibroblasten. Verminderde of serumvrije mediacondities (bijv. F12 alleen aangevuld met B27) kunnen worden gebruikt om niet-neuronale celgroei in de DRG-cultuur en co-cultuur van kanker te minimaliseren, maar kunnen de overleving beïnvloeden, met name van gedissocieerde neuronculturen. Serumvrije media moeten ook worden overwogen bij het verzamelen van DRG-geconditioneerde media om de effecten op het gedrag van kankercellen te beoordelen.

2. Voorbereiding van reagentia en materialen voor de dissectie van DRG's (figuur 1A)

  1. Autoclaaf chirurgische instrumenten. Steriliseer de snijmicroscoop met 70% ethanol en zet hem op een schone bank.
  2. Voeg 6-8 ml HBSS-Pen-Strep (stap 1.3) toe aan twee kweekplaten van 10 cm en leg op ijs.
    OPMERKING: Deze platen worden gebruikt om wervelkolommen te verzamelen na dissectie. Afhankelijk van het aantal ruggenmerg dat wordt ontleed, kunnen extra platen nodig zijn.
  3. Voeg 8-10 ml HBSS-Pen-Strep toe aan een conische buis van 15 ml en plaats op ijs.
  4. Voeg 3 ml HBSS-Pen-Strep toe aan een kweekplaat van 3 cm en leg op ijs.
    OPMERKING: De buis van 15 ml die in stap 2.3 is voorbereid, wordt gebruikt om DRG's te verzamelen voor dissociatie, terwijl de kweekplaat van 3 cm (stap 2.4) wordt gebruikt om DRG's te verzamelen voor het model met volledige montage.

3. Reagentia en materialen voorbereiden voor DRG-cultuur op de hele berg

OPMERKING: Voor sommige stappen in dit gedeelte moet je je misschien een nacht voorbereiden. Hoewel elk type weefselkweekplaat kan worden gebruikt voor DRG-culturen, zijn de volumes en instructies in dit protocol geoptimaliseerd voor objectglaasjes met 8 putjes met glazen bodem, wat een optimale beeldvormingskwaliteit voor onze analyses opleverde. Houd de schuif met 8 putjes met glazen bodem, de pipetpunten en Matrigel altijd op ijs.

  1. Ontdooi de Matrigel-oplossing een nacht (of ten minste 3 uur) bij 4 °C voor gebruik. Zorg ervoor dat Matrigel te allen tijde bedekt is met ijs.
  2. Koel de pipetpunten en de 8-puts glazen bodem een nacht af bij -20 °C om te voorkomen dat Matrigel aan de punten blijft plakken en om voortijdige Matrigelpolymerisatie in de plaat te voorkomen.
  3. Verwarm aangevulde media (stap 1.2) tot 37 °C in een waterbad.

4. Bereiding van reagentia en materialen voor gedissocieerde DRG-cultuur

  1. Ontdooi de papaïneoplossing en de collagenase IV/Dispase II-oplossing (stap 1.1) in een waterbad bij 37 °C tot ze klaar zijn voor gebruik.
    OPMERKING: Gebruik voor elke ontlede muis 1 aliquoot (1 ml) Papaïne en Collagenase IV/Dispase II-oplossing.
  2. Warm aangevuld met kweekmedia (stap 1.2).

5. Oogsten van de wervelkolom (Figuur 1B) en ontleden van de DRG's (Figuur 1C)

  1. Euthanaseer 4-8 weken oude muizen door een overdosis isofluraan gevolgd door cervicale dislocatie. Leg het geëuthanaseerde dier op zijn buik en scheer zijn vacht, met de nadruk op het gebied boven de wervelkolom (Figuur 1B, stappen 1,2).
  2. Spuit de rug van het dier in met 70% ethanol en verwijder eventuele losse vacht, veeg deze af met keukenpapier van staart tot schedel om te voorkomen dat de vacht de dissectie besmet.
  3. Maak met een gesteriliseerde schaar een rechte incisie langs het geschoren dorsale oppervlak, van de staart tot de schedel. Trek de huid aan beide zijden van de incisie terug met een stompe tang om de wervelkolom bloot te leggen (Figuur 1B, stap 3).
  4. Gebruik een nieuwe tang en schaar om besmetting met de vacht te voorkomen en maak een horizontale incisie aan de basis (staartuiteinde) van de wervelkolom (Figuur 1B, stap 4).
  5. Maak twee parallelle longitudinale incisies aan elke kant van de wervelkolom om deze los te maken. Gebruik een tang om de wervelkolom voorzichtig op te tillen om het omliggende bindweefsel te verwijderen (Figuur 1B, stap 5).
  6. Om de wervelkolom volledig los te laten, maakt u een incisie aan de bovenkant van de wervelkolom (proximaal van de schedel). Breng de wervelkolom over naar de voorgekoelde platen van 10 cm met HBSS-Pen-Strep op ijs (stap 2.2) (figuur 1C, stap 6).
    OPMERKING: Het is handig om alle wervelkolommen in dezelfde plaat van 10 cm te verzamelen en de afzonderlijke kolommen één voor één naar een aparte plaat te verplaatsen voor verdere dissectiestappen.

6. Ontleden van de dorsale wortelganglia (DRG's)

  1. Verwijder met een veerschaar eventueel achtergebleven bindweefsel rond de wervelkolom, waardoor de wervels bloot komen te liggen (Figuur 1C, stap 7). Dit zorgt voor een duidelijkere visualisatie van de wervel en vergemakkelijkt het snijden langs de middellijn. Verzamel bijgesneden kolommen in een verse, voorgekoelde plaat van 10 cm (stap 2.2).
  2. Breng het bijgesneden ruggenmerg één voor één over naar het microscoopstadium voor dissectie. Splits de wervelkolom in het sagittale vlak voorzichtig met behulp van een veerschaar (Figuur 1D, stap 8).
  3. Verwijder met een tang met een fijne punt het ruggenmerg uit de wervelkolom, waardoor de DRG's bilateraal langs de wortels van de ruggenmergzenuwen worden blootgelegd (Figuur 1D, stap 9).
    OPMERKING: Bij deze stap moet extra voorzichtigheid worden betracht, aangezien DRG's met het ruggenmerg kunnen worden verwijderd als er te ruw mee wordt omgegaan.
  4. Knip de ruggenmergzenuwen door met een veerschaar en verwijder het bindweefsel rond de DRG's (Figuur 1D, stap 10).
    OPMERKING: Door in deze stap bindweefsel te verwijderen, wordt vuil in de DRG-culturen geminimaliseerd.
  5. Trek met een tang met fijne punt voorzichtig aan de DRG om deze uit de dorsale wortel te halen. Voor de hele montuurcultuur plaatst u de DRG's in de plaat van 3 cm (voorbereid in stap 2.4) (Figuur 1D, stap 11). Verzamel de resterende DRG's in een conische buis van 15 ml (bereid in stap 2.3) om te worden gebruikt voor dissociatie.
    NOTITIE: Houd platen en buizen tijdens het dissectieproces op ijs.
  6. Herhaal stap 6.4 tot en met 6.5 totdat alle DRG's zijn geëxtraheerd. Herhaal alle bovenstaande stappen voor eventuele extra wervelkolommen.
    OPMERKING: Muizen hebben 30-31 paar DRG, afhankelijk van de stam, waardoor tot 60 DRG's van elk dier kunnen worden verzameld. Als DRG's alleen uit het lumbale deel van het ruggenmerg worden verzameld, kunnen 10 DRG's worden geëxtraheerd. Het gebruik van DRG's van hetzelfde dier om beide kweekmodellen vast te stellen, vermindert de intra-experimentele variabiliteit en zorgt voor consistente en vergelijkbare resultaten tussen complementaire experimenten.
    OPMERKING: Alle stappen na de extractie van de DRG's moeten worden uitgevoerd in een biologische veiligheidskast.

7. DRG-cultuur op de hele berg (Figuur 2)

  1. Gebruik de voorgekoelde tips (stap 3.2) om 2 μL gekoelde Matrigel te pipetteren om een druppel te vormen in elk putje van een op ijs geplaatste dia met 8 putjes met glazen bodem (Figuur 2A, stap 1). Om te voorkomen dat Matrigel voortijdig polymeriseert voordat de DRG wordt toegevoegd, pipetteert u slechts één druppel per keer. Om krassen op het glijvlak te voorkomen, plaatst u de glijbaan in een plaat van 10 cm voordat u deze op ijs plaatst.
  2. Breng met behulp van een tang met fijne punt een DRG over op een droge plaat en beweeg deze voorzichtig rond om overtollige HBSS te verwijderen, waardoor verdere verdunning van de Matrigel wordt voorkomen wanneer de DRG aan de Matrigel-druppel wordt toegevoegd. Breng de DRG over naar de Matrigel-druppel (Figuur 2A, stap 2).
    NOTITIE: Gebruik een tang met fijne punt om de DRG voorzichtig in de Matrigel-druppel te duwen, waarbij u ervoor zorgt dat de DRG volledig is ondergedompeld en centraal in de druppel is geplaatst.
  3. Herhaal de stappen 7.1 tot en met 7.2 voor elke DRG die aan een Matrigel-druppel wordt toegevoegd.
  4. Incubeer de glazen bodemplaat met 8 putjes gedurende 5 minuten bij 37 °C in een bevochtigde incubator om de Matrigel te laten polymeriseren (Figuur 2A, stap 3).
  5. Voeg voorzichtig 200 μL warme gesupplementeerde voedingsbodem toe aan elk putje en incubeer bij 37 °C met 5% CO2 (Figuur 2B, stap 4). Vervang de media elke 72 uur door vers gesupplementeerde kweekmedia.
  6. Bewaak de DRG met behulp van helderveldmicroscopie om de levensvatbaarheid en neuronale uitgroei elke 24 uur te beoordelen (Figuur 2C en Figuur 3).
    OPMERKING: Levensvatbaarheid kan worden aangegeven door een toename in lengte en dichtheid van neurieten. Beelden kunnen in de loop van de tijd worden vastgelegd om de ontwikkeling van de DRG-celextensies aan te tonen (Figuur 3).

8. Gedissocieerde DRG-cultuur (figuur 4)

OPMERKING: Elke multiwell-plaat kan worden gebruikt om de gedissocieerde DRG-neuronen te zaaien. In dit protocol werden echter 8-putjes met glazen bodem gebruikt omdat deze een betere celconfluentie en beeldvormingskwaliteit boden voor immunofluorescentieanalyses.

  1. Coating van kweekplaten met collageen
    1. Bereid een 50 μg/ml werkoplossing van aangezuurd collageen I in steriel 0,01 M HCl in een biologische veiligheidskast.
    2. Pipetteer 100 μL collageen I-oplossing in elk putje van de glazen bodemplaat met 8 putjes. Kantel en draai de schuif voorzichtig om ervoor te zorgen dat de collageenoplossing het hele bodemoppervlak van elke put gelijkmatig bedekt. Incubeer het objectglaasje gedurende 1 uur bij 37 °C in een bevochtigde incubator om de polymerisatie van collageen I te garanderen.
      OPMERKING: Ga tijdens de incubatietijd verder met stap 8.2 en 8.3.
    3. Na de incubatie wordt voorzichtig alle resterende niet-gepolymeriseerde collageen I-oplossing uit elk putje afgevoerd. Spoel elk putje af met 100 μL PBS. Pipetteer overtollig PBS weg en laat een dun restlaagje achter om te voorkomen dat het collageen uitdroogt.
      OPMERKING: De schuif met glazen bodem met 8 putjes kan in de biologische veiligheidskast blijven totdat de gedissocieerde DRG's klaar zijn voor de zaaistap.
  2. Enzymatische spijsvertering
    1. Centrifugeer de buis van 15 ml met geëxtraheerde DRG's (stap 6.5) voorzichtig gedurende 5 minuten bij 200 × g bij kamertemperatuur om de DRG's te pelleteren. Verwijder de HBSS voorzichtig met een pipet.
    2. Spoel DRG's af in voorverwarmde gesupplementeerde media, tik zachtjes op de buis om ervoor te zorgen dat alle inhoud wordt gewassen en centrifugeer gedurende 5 minuten op 200 × g om de DRG's te pelleteren.
    3. Pipetteer het medium af en voeg 1 ml papaïneoplossing toe (Figuur 4A, stap 1). Meng voorzichtig en incubeer gedurende 20 minuten bij 37 °C in een weefselkweekincubator. Schud de tube voorzichtig om hem elke 5 minuten te roeren.
    4. Voeg na 20 minuten 4,5 ml gesupplementeerde media toe en meng voorzichtig om papaïne te neutraliseren. Centrifugeer de buis gedurende 5 minuten bij 400 × g om DRG's te pelleteren. Verwijder het bovenstaande voorzichtig met behulp van een pipet.
    5. Voeg 1 ml Collagenase IV/Dispase II-oplossing toe en incubeer gedurende 20 minuten bij 37 °C in de incubator. Schud de tube elke 5 minuten voorzichtig (Figuur 4A, stap 1).
    6. Voeg na 20 minuten 4,5 ml gesupplementeerde media toe en meng voorzichtig om de Collagenase IV/Dispase II-oplossing te neutraliseren. Centrifugeer de buis gedurende 5 minuten bij 400 × g om DRG's te pelleteren. Verwijder het bovenstaande voorzichtig met een pipet.
    7. Voeg 2 ml gesupplementeerde media toe en voeg DNase I toe tot een eindconcentratie van 0,2 mg/ml. Op dit punt zijn de DRG's grondig verteerd en kunnen ze verschijnen als een losse klomp (Figuur 4A, stap 2).
  3. Mechanische dissociatie
    1. Tritureer de DRG voorzichtig en pipuleer 4-5x op en neer met behulp van een 1000 μL filterpipetpunt (Figuur 4A, stap 2).
    2. Voer een tweede trituratiestap uit met behulp van een 200 μL pipetpunt 4-5x. Na deze stap ziet het monster er troebel uit en blijven er enkele zichtbare klonten weefsel achter (Figuur 4A, stap 2).
    3. Filtreer de celsuspensie door een celzeef van 70 μm in een conische buis van 50 ml. Spoel de zeef geleidelijk af met 10 ml media om volledige filtratie van de cellen door de zeef te garanderen (Figuur 4A, stap 3).
    4. Centrifugeer de buis gedurende 5 minuten bij 1.000 × g tot pelletcellen. Verwijder de media uit de pellet en suspendeer deze opnieuw in 500 μl gesupplementeerde media (Figuur 4A, stap 4).
    5. Verwijder eventuele resterende PBS uit de putjes van de 8-gaats glazen bodemschuif. Verdeel de gedissocieerde DRG-suspensie over de met collageen beklede putjes. Incubeer de objectglaasjes bij 37 °C in een bevochtigde broedstoof met 5% CO2 . Voeg indien nodig meer media toe en vervang de media elke 48 uur door vers aangevulde kweekmedia (Figuur 4B, stap 5).
      OPMERKING: DRG-gedissocieerde cellen kunnen worden geteld met behulp van een hemocytometer of celtelkamer en trypanblauwe kleuring om een consistent aantal cellen per putje te garanderen. Voor dit protocol werden in elk putje ongeveer 1 × 105 cellen gezaaid.
    6. Bewaak DRG-afgeleide cellen met behulp van helderveldmicroscopie om de levensvatbaarheid en neuronale uitgroei te beoordelen (Figuur 4C en Figuur 5).
      OPMERKING: Neuronen verschijnen als afgeronde cellichamen met gedefinieerde grenzen en het kan 24 uur of langer duren voordat ze zich hechten, terwijl niet-neuronale cellen zich doorgaans voor de neuronen nestelen. Enige uitgroei van neurieten kan na 24 uur worden waargenomen en neemt in de loop van de tijd toe tot 7 dagen in de cultuur. Gedissocieerde DRG-afgeleide cellen en DRG in de hele berg worden 72 uur gepre-geïncubeerd voordat kankercellen worden toegevoegd en co-culturen worden opgezet.

9. Bereiding van kankercelsuspensies en het tot stand brengen van co-culturen

OPMERKING: Aanhangende kankercellen van vele soorten kunnen worden gebruikt. Groeimedia en celaantallen voor co-culturen zullen cellijnafhankelijk zijn. We raden aan om vóór het experiment vooraf te testen om de timing voor het verzamelen van cellen en het optimale aantal cellen te bepalen. Het hier beschreven protocol was gebaseerd op het gebruik van menselijke alvleesklierkankercellijnen PanC1 en MiaPaCa2, en prostaatkankercellijn DU-145.

  1. Was de cellen met serumvrije media en trypsiniseer ze ongeveer 3 minuten met 2 ml trypsine/10 cm plaat.
  2. Neutraliseer de trypsine door 6 ml gesupplementeerde media toe te voegen en pipetteer voorzichtig op en neer om een eencellige suspensie te garanderen. Tel de cellen met behulp van een hemocytometer en trypanblauwe kleuring.
  3. Suspendeer de kankercellen in een concentratie van 2 × 105 cellen/ml in gesupplementeerde media (stap 1.2).
    OPMERKING: De optimale celdichtheid kan variëren afhankelijk van de celgrootte, de verdubbelingstijd en de duur van de co-cultuur en kan indien nodig worden aangepast.
  4. Whole-mount DRG en co-cultuur van kankercellen (Figuur 6B)
    1. Zuig de media van de hele berg DRG-culturen op in de 8-well glazen bodemschuif.
    2. Pipetter voorzichtig 200 μL van de kankercelsuspensie (stap 9.3) bovenop de Matrigel-druppel die de hele DRG-berg bevat.
      LET OP: Dit zorgt voor een gelijkmatige verdeling van kankercellen rond de druppel. Zorg ervoor dat u de Matrigel-druppel niet verstoort met de pipetpunt.
    3. Incubeer het co-cultuurglaasje in een bevochtigde broedmachine bij 37 °C met 5% CO2 . Ververs de media dagelijks door één keer te wassen met 200 μl verwarmde gesupplementeerde media en vervolgens 300 μl toegevoegde media aan elk putje toe te voegen.
      OPMERKING: Zuig de media voorzichtig op met een pipet om verstoring van de co-cultuur tussen DRG-kankercellen te voorkomen. In de loop van de tijd, naarmate de co-culturen complexer en georganiseerder worden, worden ze ook vatbaarder voor verstoringen die van invloed kunnen zijn op cellulaire interacties en de integriteit van de co-cultuur.
    4. Bewaak de co-cultuur met behulp van een helderveld- of fluorescentiemicroscoop met tussenpozen van 24 uur om het gedrag van kankercellen en neuronale interacties te beoordelen (Figuur 6B).
      OPMERKING: De observatiefrequentie kan worden aangepast op basis van de experimentele tijdlijn en interessante celinteracties.
  5. Gedissocieerde DRG en co-cultuur van kankercellen (Figuur 6C)
    1. Zuig de media op van de gedissocieerde culturen in de 8-putjes met glazen bodem.
    2. Verdeel voorzichtig 200 μL van de kankercelsuspensie (stap 9.3) in elk putje. Volg dezelfde stappen voor incubatie, mediaverversing en monitoring als beschreven voor co-culturen voor de hele berg (stappen 9.4.3 en 9.4.4).
      OPMERKING: Voor een betere visualisatie van cellulaire processen en interacties tussen kankercellen en neuronen, kunnen fluorescerende celtrackers aan de cultuur worden toegevoegd, volgens het protocol van de fabrikant.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

Ons protocol beschrijft de isolatie van primaire DRG-afgeleide cellen van muizen en het opzetten van twee complementaire kweekmodellen: gedissocieerde DRG en volledig gemonteerde DRG-culturen, die ons in staat stellen om zenuw-kankercelinteracties op verschillende niveaus van complexiteit te onderzoeken. Een belangrijk voordeel van dit protocol is dat beide soorten kweek kunnen worden gegenereerd met behulp van DRG's geïsoleerd van hetzelfde dier, waardoo...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

Het hier gepresenteerde protocol beschrijft verbeterde methoden om 2D- en 3D-DRG-primaire zenuwculturen tot stand te brengen en hun toepassing in co-cultuur met kankercellen. Dit protocol bouwt voort op eerdere methoden door de twee modellen parallel te zetten. Omdat 2D- en 3D-modellen tegelijkertijd worden opgesteld, met behulp van primaire zenuwen die van dezelfde dieren zijn geïsoleerd, wordt interdierlijke en interexperimentele variatie geminimaliseerd en kunnen gegevens van beide mo...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

De auteurs hebben geen belangenconflicten te onthullen.

Dankbetuigingen

Dit werk werd ondersteund door exploitatiesubsidies van de Canadian Institutes for Health Research (PJT-178274) (LMM), en door een Ontario Graduate Scholarship (LCBO), en door een beurs van de Coördinatie voor de Verbetering van Personeel in het Hoger Onderwijs - Brazilië (CAPES) - Finance Code 001 (ERP). LMM is de Bracken Chair in Genetics and Molecular Medicine aan de Queen's University. Sommige afbeeldingen zijn gedeeltelijk gegenereerd met behulp van Biorender.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
Hulpmiddelen
70 µm Cell StrainerProgene71-229483-ULTGebalikt voor het filteren van celsuspensie
8-well glazen bodem dia'sIBidi, München, Duitsland80807
Dumont #5 - Fijne pincetFine Science Tools, Foster City, USA11254-20
Dumont #5 pincetFine Science Tools, Foster City, USA11252-20
Fijne schaarFine Science Tools, Foster City, USA91460-11
Patronen pincetFine Science Tools, Foster City, USA91121-12
Veder schaarFine Science Tools, Foster City, USA91500-09
Reagentia
1x Fosfaat gebufferde zoutoplossingSigma, St. Louis, USAD8662-500MLGebalikt voor het oplossen van enzymen
B-27 Supplement (50x)Thermo Fisher Scientific, Massachusetts, USA17504044Gebalikt bij 2% concentratie in F12 media
Bovine Type I CollageenCorning Incorporated, New York, USA354231Gebalikt voor het coaten van platen, werkoplossing 50 µg/mL in 0,01 M HCl
Collageenase Type IVSigma-Aldrich, St. Louis, USAC4-BIOCOplossen in PBS bij 1,25 mg/mL, verdelen in aliquoten, bewaar bij -20 °C
Dispase IIRoche, Bazel, Zwitserland4942078001Oplossen in PBS bij 2,5 mg/mL, verdelen in aliquoten, bewaar bij -20 °C
DNase IRoche, Basel, Zwitserland.11284932001Toegevoegd bij een uiteindelijke concentratie van  0,2 mg/mL tijdens dissociatie
Fetal Bovine Serum (FBS)Sigma-Aldrich, St. Louis, USAF1051Gebalikt bij 10% concentratie in F12 media
HBSS (Hank's Balanced Salt Solution)Sigma, St. Louis, USAH6648-500MLBereid met 1% Penicilline-Streptomycine
Matrigel Growth Factor ReducedCorning Incorporated, New York, USA356231Ontdooi bij 4 °C overnacht, houd op ijs
Nutrient Mixture F-12 HamSigma-Aldrich, St. Louis, USAN6658-500MLBasis medium voor bereiding van aangevuld kweekmedium
PapaïneRoche, Bazel, Zwitserland.10108014001Oplossen in PBS bij 30 U/mL, verdelen in aliquoten, bewaar bij -20 °C
Penicilline-Streptomycine (100x)Sigma-Aldrich, St. Louis, USAP4333-100MLGebalikt bij 1% concentratie in media
Trypan Blauw OplossingSigma-Aldrich, St. Louis, USAT8154-100MLOm celviabiliteit te beoordelen
TrypLE ExpressThermo Fisher Scientific, Massachusetts, USA12605-028Voor het oogsten van kankercellen
Antilichamen
β-Tubuline III antilichaamAbcam (Cambridge, UK)AB15568Verdunning 1:200
Alexa Fluor 488Thermo Fisher Scientific, Massachusetts, USAA-11008Verdunning 1:2000
Alexa Fluor 594Thermo Fisher Scientific, Massachusetts, USAA-21442Verdunning 1:2000
Alexa Fluor 647Thermo Fisher Scientific, Massachusetts, USAA-21245Verdunning 1:2000
NeuN antilichaamSigma-Aldrich, St. Louis, USAMAB377Verdunning 1:100
Fluorescente kleurstoffen & sondes
ActinGreen 488 ReadyProbes Reagens (Faloïdin)Thermo Fisher Scientific, Massachusetts, USAR37110Verdunning 1:40
CellTrace Calcein Red-OrangeThermo Fisher Scientific, Massachusetts, USAC34851Celtracker gebruikt om neuronen onder fluorescentiemicroscoop te visualiseren
Hoechst 33342Thermo Fisher Scientific, Massachusetts, USAH3570Verdunning 1:5000

Referenties

  1. Thiel, V., et al. Characterization of single neurons reprogrammed by pancreatic cancer. Nature. 640 (8060), 1042-1051 (2025).
  2. Zhu, M., Luo, F., Xu, B., Xu, J. Research progress of neural invasion in pancreatic cancer. Curr Cancer Drug Targets. 24 (4), 397-410 (2024).
  3. Zareba, P., et al. Perineural invasion and risk of lethal prostate cancer. Cancer Epidemiol Biomarkers Prev. 26 (5), 719-726 (2017).
  4. Fu, Y., et al. Worst pattern of perineural invasion redefines the spatial localization of nerves in oral squamous cell carcinoma. Front Oncol. 11 (766902), (2021).
  5. Hu, J., Chen, W., Shen, L., Chen, Z., Huang, J. Crosstalk between the peripheral nervous system and breast cancer influences tumor progression. Biochim Biophys Acta Rev Cancer. 1877 (6), 188828(2022).
  6. Li, J., Mei, S., Zhou, S., Zhao, F., Liu, Q. Perineural invasion is a prognostic factor in stage ii colorectal cancer but not a treatment indicator for traditional chemotherapy: A retrospective cohort study. J Gastrointest Oncol. 13 (2), 710-721 (2022).
  7. Schmitd, L. B., Perez-Pacheco, C., D'silva, N. J. Nerve density in cancer: Less is better. FASEB Bioadv. 3 (10), 773-786 (2021).
  8. Zahalka, A. H., Frenette, P. S. Nerves in cancer. Nat Rev Cancer. 20 (3), 143-157 (2020).
  9. Winkler, F. Neuroscience and oncology: State-of-the-art and new perspectives. Curr Opin Neurol. 36 (6), 544-548 (2023).
  10. Lanigan, L. G., et al. Comparative pathology of the peripheral nervous system. Vet Pathol. 58 (1), 10-33 (2021).
  11. Jiang, S. -H., Zhang, S., Wang, H., Xue, J. -L., Zhang, Z. -G. Emerging experimental models for assessing perineural invasion in human cancers. Cancer Lett. 535 (215610), (2022).
  12. Moysidou, C. -M., Barberio, C., Owens, R. M. Advances in engineering human tissue models. Front. Bioeng. Biotechnol. 8 (620962), (2021).
  13. Bayat, F. K., et al. Adult mouse dorsal root ganglia neurons form aberrant glutamatergic connections in dissociated cultures. PloS ONE. 16 (3), e0246924(2021).
  14. Lin, Y. -T., Chen, J. -C. Dorsal root ganglia isolation and primary culture to study neurotransmitter release. J Vis Exp. (140), e57569(2018).
  15. Schmidt, H., Rathjen, F. G. Dii-labeling of drg neurons to study axonal branching in a whole mount preparation of mouse embryonic spinal cord. J Vis Exp. (58), e3667(2011).
  16. Klimovich, P., Rubina, K., Sysoeva, V., Semina, E. Three-dimensional model of dorsal root ganglion explant as a method of studying neurotrophic factors in regenerative medicine. Biomedicines. 8 (3), 49(2020).
  17. Neto, E., et al. Axonal outgrowth, neuropeptides expression and receptors tyrosine kinase phosphorylation in 3d organotypic cultures of adult dorsal root ganglia. PLoS ONE. 12 (7), e0181612(2017).
  18. Melli, G., Höke, A. Dorsal root ganglia sensory neuronal cultures: A tool for drug discovery for peripheral neuropathies. Expert Opin Drug Discov. 4 (10), 1035-1045 (2009).
  19. Du, J., Sudlow, L. C., Luzhansky, I. D., Berezin, M. Y. Drg explant model: Elucidating mechanisms of oxaliplatin-induced peripheral neuropathy and identifying potential therapeutic targets. bioRxiv. , (2023).
  20. Mo, Y. J., Kim, Y. -S., Kim, M. S., Lee, Y. -I. Advantages of adult mouse dorsal root ganglia explant culture in investigating myelination in an inherited neuropathic mice model. Methods Protoc. 5 (4), 66(2022).
  21. Nguyen, U. N., et al. Type i collagen concentration affects neurite outgrowth of adult rat drg explants by altering mechanical properties of hydrogels. J Biomater Sci Polym Ed. 35 (2), 164-189 (2024).
  22. Ito, K., et al. Histological effects of combined therapy involving scar resection, decellularized scaffolds, and human ipsc-ns/pcs transplantation in chronic complete spinal cord injury. Sci Rep. 14 (1), (2024).
  23. Aisenbrey, E. A., Murphy, W. L., Aisenbrey, E. A., Murphy, W. L. Synthetic alternatives to matrigel. Nat Rev Mater. 5 (7), 539-551 (2020).
  24. Berkovitch, Y., Seliktar, D. Semi-synthetic hydrogel composition and stiffness regulate neuronal morphogenesis - pubmed. Int J Pharm. 523 (2), 545-555 (2017).
  25. Carozzi, V. A., Salio, C., Rodriguez Menendez, V., Ciglieri, E., Ferrini, F. 2d vs 3d morphological analysis of dorsal root ganglia in health and painful neuropathy. Eur J Histochem. 65 (Suppl 1), 3276(2021).
  26. Smith, P. R., Meyer, A., Loerch, S., Campbell, Z. T. Protocol for the isolation and culture of mouse dorsal root ganglion neurons for imaging applications. STAR Protocols. 4 (4), (2023).
  27. Bunge, R. P. Expanding roles for the schwann cell: Ensheathment, myelination, trophism and regeneration - pubmed. Curr Opin Neurobiol. 3 (5), 805-809 (1993).
  28. Chen, Z., Fang, Y., Jiang, W. Important cells and factors from tumor microenvironment participated in perineural invasion. Cancers. 15 (5), 1360(2023).
  29. Jang, K., Garraway, S. M. A review of dorsal root ganglia and primary sensory neuron plasticity mediating inflammatory and chronic neuropathic pain. Neurobiol Pain. 15 (100151), (2024).
  30. Hanani, M., et al. Age-related changes in neurons and satellite glial cells in mouse dorsal root ganglia. Int J Mol Sci. 24 (3), 2677(2023).
  31. Martinelli, C., Sartori, P., Ledda, M., Pannese, E. Age-related quantitative changes in mitochondria of satellite cell sheaths enveloping spinal ganglion neurons in the rabbit. Brain Res Bull. 61 (2), 147-151 (2003).
  32. Niwa, H., et al. Differential age-dependent trophic responses of nodose, sensory, and sympathetic neurons to neurotrophins and gdnf: Potencies for neurite extension in explant culture. Neurochem Res. 27 (6), 485-496 (2002).
  33. Adler, J. E. Age-dependent differential regulation of sensory neuropeptides by glial cell line-derived neurotrophic factor. J Neurochem. 71 (1), 170-177 (1998).
  34. Podratz, J. L., et al. Neurotoxicity to drg neurons varies between rodent strains treated with cisplatin and bortezomib. J Neurol Sci. 362, 131-135 (2015).
  35. Lawson, S. N., Biscoe, T. J. Development of mouse dorsal root ganglia: An autoradiographic and quantitative study. J Neurocytol. 8 (3), 265-274 (1979).
  36. Monje, M., et al. Roadmap for the emerging field of cancer neuroscience. Cell. 181 (2), 219-222 (2020).
  37. Silverman, D. A., et al. Cancer-associated neurogenesis and nerve-cancer cross-talk. Cancer Res. 81 (6), 1431-1440 (2021).
  38. Vermeer, P. D., Restaino, A. C., Barr, J. L., Yaniv, D., Amit, M. Nerves at play: The peripheral nervous system in extracranial malignancies. Cancer Discov. 15 (1), 52-68 (2025).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Trefwoorden

DRG kweekinteractie tussen neuronen en kankerwhole mount kweekgedissocieerde neuronenkweekneurietuitgroeico kweekmodeltumormicro omgevingneurale invasie
Opstellen van in-vitromodellen van dorsale wortelgangliacultuur: complementaire benaderingen voor het onderzoeken van overspraak tussen kanker en zenuw
Neem contact met ons op
Aanbevelen aan bibliotheek

Privacy

Gebruiksvoorwaarden

Beleid

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Alle rechten voorbehouden.