High-plex beeldvorming met behulp van spectrale confocale microscopie om niet-specifieke weefselfluorescentie te minimaliseren

Samenvatting

Spectral Iterative Bleaching Extend Multiplexity (IBEX) bouwt voort op de basis IBEX-techniek door heparineblokkering toe te voegen om niet-specifieke binding te minimaliseren en gebruik te maken van spectrale detectie met computationele ontmenging om autofluorescentie te onderdrukken. Deze aanpak versnelt de beeldacquisitie en vermindert tegelijkertijd achtergrondbronnen, waardoor robuuste multi-ronde, high-parameter ruimtelijke proteomische analyses mogelijk zijn.

Samenvatting

Sterk gemultiplexte beeldvorming maakt de studie mogelijk van functioneel diverse cellen en hun niches binnen hun natuurlijke weefselomgevingen. Iteratieve Bleaching Extend Multiplexity (IBEX) is een cyclische immunolabeling en fluorofore-inactiveringstechniek waarmee meerdere markers op hetzelfde weefselgedeelte kunnen worden gevisualiseerd. Vastgelegde beelden kunnen vervolgens worden geanalyseerd om gegevens van één cel te verkrijgen om celclusters, hun lokalisaties en naburige celtypen te definiëren. Het interpreteren van deze gegevens is afhankelijk van het vermogen om echte markerexpressies te onderscheiden van achtergrondbronnen die inherent zijn aan fluorescentiemicroscopie. Spectrale IBEX, een aanpassing van het IBEX-protocol, integreert spectrale confocale detectie met computationele ontmenging en bevat heparineblokkering om op lading gebaseerde off-target binding te verminderen. Deze combinatie verbetert de signaal-achtergrondverhouding, onderdrukt weefselautofluorescentie en minimaliseert doorbloeding, terwijl ook de acquisitietijd wordt verkort in vergelijking met conventionele multi-track confocale beeldvorming. Toepassing op menselijk neuspoliepweefsel, een model dat wordt gekenmerkt door een hoog eosinofielengehalte en sterke autofluorescentie, toonde betrouwbare beeldvorming van 26 markers in structurele, immuun- en celtoestandscompartimenten gedurende zes beeldvormingsrondes. De resulterende workflow genereert hoogdimensionale, ruimtelijk opgeloste proteomische informatie die complexe weefselarchitectuur en cellulaire niches vastlegt. Samen biedt deze geoptimaliseerde aanpak een robuuste en breed toepasbare strategie voor gemultiplexte beeldvorming, met name geschikt voor weefsels waar autofluorescentie en niet-specifieke kleuring conventionele benaderingen beperken.

Inleiding

Weefsels bestaan uit een diverse reeks cellen met gespecialiseerde functies die zich organiseren in driedimensionale structuren en, door middel van interactie, de biologische processen coördineren die nodig zijn voor het leven. Pathologie ontstaat wanneer verstoringen van de cellulaire samenstelling of weefselarchitectuur deze interacties verstoren en de weefselhomeostase in gevaar brengen¹. Kennis van hoe de talrijke gespecialiseerde celtypen zich lokaliseren en interageren in onze weefsels is vereist om de biologie te begrijpen die ten grondslag ligt aan de gezondheid en ziekte van de mens.

Vooruitgang in single-cell profileringstechnologieën op transcriptomisch, epigenoom en proteomisch niveau heeft een uitzonderlijke diversiteit aan gespecialiseerde celtypen blootgelegd. ^2,3 Technologieën zoals single-cell RNA-sequencing en spectrale flowcytometrie kunnen het aantal parameters meten dat nodig is om deze heterogene populaties te karakteriseren. Deze benaderingen missen echter ruimtelijke informatie, omdat cellen moeten worden gedissocieerd van hun oorspronkelijke weefselomgeving in eencellige suspensies ^4,5. Als zodanig zijn celtypen geïdentificeerd die verband houden met verschillende ziektecontexten, maar hun interacties in het weefsel en hun bijdrage aan het in stand houden van de ziekte blijven onduidelijk.

Om een aantal van deze beperkingen aan te pakken, zijn verschillende ruimtelijk-omics-technologieën ontwikkeld om cellulaire heterogeniteit binnen een weefsel vast te leggen en tegelijkertijd de positie van elke cel te behouden⁶. Gentranscriptie kan bijvoorbeeld worden gemeten door RNA te amplificeren op gerasterde plekken in een weefselsectie (bijv. Visium) of door RNA-hybridisatiesondes te gebruiken die gericht zijn op een panel van specifieke genen die worden afgebeeld met een resolutie van één cel (bijv. Xenium)^7,8. Deze methoden zijn effectief voor het traceren van transcriptiepatronen en regulerende mechanismen in weefsels. Transcriptieprofielen correleren echter vaak slecht met eiwitexpressie, wat directer de functionele mogelijkheden van een cel weerspiegelt⁹. Eiwitexpressie kan worden geïdentificeerd met behulp van specifieke antilichamen geconjugeerd aan fluoroforen, die kunnen worden gedetecteerd door fluorescentiemicroscopie^10,11. Het gebruik van traditionele fluorescentiemicroscopie kan een discrete beeldvorming mogelijk maken van meer dan zes van dergelijke antilichaam-geconjugeerde fluoroforen. De overlappende excitatie- en emissieprofielen van deze fluoroforen resulteren echter in onzekerheid over de oorsprong van het fluorescentiesignaal in een bepaald kanaal¹².

Iteratieve bleking verlengt multipleXity (IBEX) is een beeldvormingsmethode met een hoog gehalte die is ontwikkeld om deze beperking van fluorescentiemicroscopie te overwinnen 13,14,15. IBEX gebruikt lithiumboorhydride (LiBH₄) om fluoroforen na beeldvorming chemisch te inactiveren, waardoor hetzelfde weefselmonster opnieuw kan worden gekleurd met een volgende ronde van fluorofoor-geconjugeerde antilichamen voorafgaand aan herbeelding. IBEX behoudt de integriteit van het weefsel, waardoor vele beeldvormingsrondes een theoretisch onbeperkt aantal markers op hetzelfde weefselgedeelte kunnen visualiseren. Computationele uitlijning van de verkregen afbeeldingen biedt karakterisering op omics-niveau met een resolutie van één cel, terwijl ruimtelijke gegevens behouden blijven om cellulaire niches te onthullen. Deze gegevens kunnen ook vermeende cellulaire interacties onthullen, hoewel deze moeten worden gevalideerd met behulp van andere technieken¹⁶. IBEX is een open-sourcemethode die compatibel is met in de handel verkrijgbare fluoroforen en wordt ondersteund door een internationale gemeenschap van onderzoekers die reagentia hebben gevalideerd en gegevens openbaar delen om toegankelijkheid, snelle acceptatie en het genereren van hoogwaardige gegevens te bevorderen^17,18.

In dit werk is een aangepast protocol van IBEX ontworpen om twee grote uitdagingen van de techniek te overwinnen: weefselautofluorescentie en niet-specifieke binding van fluorofoor-geconjugeerde antilichaamsondes (gezamenlijk aangeduid als achtergrond). Autofluorescentie ontstaat wanneer excitatie van fluorescerende moleculen die endogeen zijn voor een weefsel licht uitzendt dat overlapt met het gewenste signaal dat wordt verkregen uit antilichaam-geconjugeerde fluoroforen^19,20. Off-target of niet-specifieke binding van fluorofoor-geconjugeerde antilichamen resulteert in fluorescentie van cellen of structuren die het doeleiwit niet tot expressie brengen^21,22. Deze artefacten kunnen resulteren in de onnauwkeurige conclusie dat een cel een marker tot expressie brengt die hij niet echt tot expressie brengt, waardoor computationele analyses en nauwkeurige toewijzing van celtypen worden bemoeilijkt. Door op heparine gebaseerde ladingsneutralisatie van off-target signaal te combineren met volledige spectrale acquisitie en computationele ontmenging, vermindert spectrale IBEX de doorbloeding aanzienlijk, verbetert het de signaal-achtergrondverhouding (SBR) en halveert het de acquisitietijd per ronde.

Protocol

Neuspoliepweefsel dat in deze studie werd gebruikt, werd verzameld tijdens sinuschirurgie bij Hamilton Health Sciences met ethische goedkeuring van de Hamilton Integrated Research Ethics Board. Van alle deelnemers werd geïnformeerde toestemming verkregen.

1. Afname van monsters

1. Verkrijg monsters tijdens routinematige poliepectomieprocedures die worden uitgevoerd bij patiënten met chronische rhinosinusitis. Plaats de monsters na chirurgische verwijdering in een injectieflacon met medische zoutoplossing op ijs voor transport en verwerk ze onmiddellijk voor beeldvorming om de weefselintegriteit te behouden.

2. Bereiding van reagens

1. Bereid fixatie- en permeabilisatieoplossing voor door de verkregen fixatie- en permeabilisatieoplossing 1:4 in PBS te verdunnen. Bereid cryopreservatieoplossing voor als 30% sucrose in PBS. Bereid de verdunningsbuffer voor als 0,1% v/v Triton X-100 in PBS.
2. Bereid BSA-blokreagens als 1% w/v runderserumalbumine in verdunningsbuffer. Bereid het heparineblokreagens als 10KU Heparine-natriumzout in 1 ml PBS. Bereid de blokkeerbuffer voor door heparineblokreagens (1:50) te mengen met Fc-blokreagens (1:100) in BSA-blokreagens.
3. Bereid het kleuringsmengsel voor als antilichaam getitreerd in de juiste verdunningen in de blokkeerbuffer. Bereid bleekoplossing voor door 10 mg LiBH₄ toe te voegen aan 10 ml ultrapuur water.

3. Weefselverwerking en brutowinst

1. Inspecteer weefsel onder een dissectiemicroscoop (meestal met een vergroting van ~15x, hoewel dit kan variëren afhankelijk van het monster en de microscoop) en verwijder vet en bot met een tang en een scalpel. Om het weefsel zo goed mogelijk te bewaren, gebruikt u schone instrumenten, werkt u op een koud en nat oppervlak en minimaliseert u de verwerkingsduur.
2. Grove weefsels > 0,5 cm dik in plakjes van 4-5 mm met een scalpel²³. Dompel de plakjes onder in fixatie- en permeabilisatieoplossing en draai ze gedurende 16 uur bij °C.
   OPMERKING: Het volume van deze oplossing en de andere in stap 3.3 moet ongeveer 20x het volume van het monster zijn, in een buisje van de juiste grootte.
3. Verplaats de tissue naar PBS en spoel gedurende 5 minuten. Dompel het weefsel onder in cryopreservatieoplossing en incubeer gedurende 16 uur bij °C. Was niet na deze stap, omdat er dan weer water in het weefsel zou komen.

4. Bevriezing van weefsels

1. Label een bord met 6 putjes met het experiment en de monsterdetails boven elk putje en plaats het in een vriezer van -20 °C om minimaal 20 minuten af te koelen.
2. Vul een cryomold van de juiste grootte met een optimale snijtemperatuur (OCT) -verbinding. Vermijd het maken van luchtbellen in de OCT. Sleep grote bubbels naar de randen van de cryomold met behulp van een naald of pipetpunt.
   OPMERKING: Een cryomold kan worden gemaakt met behulp van aluminiumfolie dat om een klein flesje of buisje met platte bodem is gewikkeld.
3. Verwijder het weefsel uit de cryopreservatieoplossing. Dep de tissue voorzichtig op een pluisvrij doekje om overtollige vloeistof te verwijderen, omdat dit het bevriezen in gevaar kan brengen.
4. Vul een bekerglas van 250 ml met ongeveer 100-150 ml isopentaan in een zuurkast en plaats deze in een schuimdoos of koeler die gedeeltelijk gevuld is met vloeibare stikstof.
   OPMERKING: Het isopentaan verdampt als het langer dan 2 uur open blijft staan; Direct na opening gebruiken. Het isopentaan vergemakkelijkt het gelijkmatig en snel invriezen van het weefsel. Het isopentaan kan na verloop van tijd langzaam bevriezen. Als het vast bevriest, verwijder dan het bekerglas van de vloeibare stikstof en laat het ontdooien. De isopentaan kan in een glazen fles met een dop worden gegoten om tot 5x te worden hergebruikt. Het gehalte van het isopentaan moet hoger zijn dan dat van de vloeibare stikstof om te voorkomen dat het bekerglas gaat drijven of kantelen.
5. Pas de oriëntatie van het weefsel binnen de OCT naar wens aan onder een dissectiemicroscoop.
   OPMERKING: Voor neuspoliepweefsels oriënteren we het monster meestal langs de lange as om symmetrische doorsneden te verkrijgen die een zo groot mogelijke dwarsdoorsnede vastleggen. Raadpleeg histologiehandleidingen voor het weefsel van belang voor een optimale inbeddingsoriëntatie.
6. Dompel de bodem van de cryomold in de isopentaan. Verwijder de cryomold van de isopentaan wanneer het midden van het weefsel volledig wit en ondoorzichtig is. Vermijd het volledig onderdompelen van de cryomold; Het blok kan barsten, waardoor de doorsnede in het gedrang komt.
7. Haal het blok voorzichtig uit de cryomold door druk uit te oefenen op de achterkant en plaats het in de voorgekoelde plaat met 6 putjes bij -20 °C. Nadat u alle monsters hebt ingevroren, brengt u de plaat over naar een vriezer van -80 °C voor langdurige opslag.
   OPMERKING: Dit is een pauzepunt. Weefsels kunnen jarenlang bij -80 °C worden bewaard.

5. Voorbereiding van dia's en cryo-secties

1. Pipetteer 10-1 μL chroom-aluingelatinelijm op objectglaasjes; Verdeel gelijkmatig en laat 15 minuten aan de lucht drogen. Voor een optimale hechting brengt u chroomaluingelatinelijm 2x-3x aan op de dekglaasjes met kamer en voegt u 5 μL per toepassing toe (totaal 15 μL).
2. Plaats de objectglaasjes na het drogen gedurende 1 uur in een oven op 80 °C om een volledige droging te garanderen. Als u een afdekglas met kamer gebruikt, laat het dan een nacht drogen bij 37 °C, aangezien het plastic bij 80 °C kan smelten.
   OPMERKING: Zodra de objectglaasjes zijn gecoat en gedroogd, kunnen ze dagenlang bij kamertemperatuur worden bewaard totdat ze worden gebruikt. Ze moeten worden afgedekt om stof te voorkomen.
3. Breng weefsels over van -80 °C tot -20 °C (of in de cryostaat bij de snijtemperatuur) om in evenwicht te komen en koel 1 uur voor voordat u ze in secties snijdt. Snijd 10-2 μm secties op een cryostaat²⁴.
   1. Als u in een afdekglas met kamer snijdt, pakt u het gedeelte voorzichtig op met een tang nadat u de antirolplaat hebt opgetild. Gebruik een penseel om het plat op het glas in de kamer te leggen. Druk met de duim onder het monster op de bodem van het dekglas om het gedeelte op het glas te smelten.
4. Droog de objectglaasjes 1 uur bij 3 °C of 24 uur bij kamertemperatuur.
   OPMERKING: Als de objectglaasjes onmiddellijk worden gebruikt, kunnen ze tijdelijk bij kamertemperatuur in een objectglaasjesdoos worden bewaard om ze te beschermen tegen stof tijdens de voorbereiding op vlekken. Als ze echter niet meteen worden gebruikt, bewaar ze dan bij -80°C om de integriteit van het weefsel te behouden. Dit is een pauzepunt. Als dia's bij -80 °C worden bewaard, kan het proces hier worden gepauzeerd.

6. Blokkering en immunolabeling van antilichamen

1. Teken een cirkel op het glas rond het weefsel met behulp van een PAP-pen om een hydrofobe barrière te creëren die de vloeistof bevat tijdens het kleuren of andere stappen. Teken niet over de OCT, omdat de hydrofobe inkt wegspoelt wanneer de OCT oplost.
   NOTITIE: Deze stap is niet nodig voor het kamerdekglas, omdat de wanden de vloeistof in de put vasthouden.
2. Voeg ~100 μL PBS toe aan elk weefsel en incubeer gedurende ~2 minuten bij kamertemperatuur om de tissues te rehydrateren en OCT af te wassen. Gebruik ~1 ml PBS voor kamerdekglas.
   OPMERKING: Om te voorkomen dat het weefsel uit het glas komt, mag u geen vloeistof rechtstreeks op het monster pipetteren.
3. Zuig de PBS op en voeg 100 μL van de blokkeerbuffer toe. Incubeer gedurende 1 uur bij kamertemperatuur in een afgedekte vochtigheidskamer. Gebruik ~400 μL blokkeerbuffer voor kamerafdekglas.
4. Zuig de blokkeerbuffer op en voeg 100 μL van het kleuringsmengsel toe. Incubeer in een afgedekte vochtigheidskamer en plaats deze een nacht in de koelkast (4 °C). Gebruik ~400 μL van het kleurmengsel voor kamerdekglas. Bereid secties voor die zijn gekleurd met slechts één van de fluoroforen in het paneel, en een negatieve controle zonder vlekken, om het spectrum van de fluoroforen en de autofluorescentie van de weefsels te definiëren.
   OPMERKING: Antilichaamverdunningen moeten experimenteel worden geoptimaliseerd door te titreren tot 1:50, 1:100 en 1:200, of een andere verdunning indien nodig. Kies de minimale hoeveelheid antilichaam die het optimale signaal oplevert. Streef ernaar dat de intensiteit van alle antilichamen in het panel ongeveer gelijk is om de effectiviteit van spectrale ontmenging te maximaliseren. Bescherm monsters tegen licht na deze stap om fotobleken van fluoroforen te minimaliseren.
5. Aanzuigen van vlekkenmix en 3x wassen met PBS (10 μL, elk 2 min), opzuigvloeistof tussen elke wasbeurt. Gebruik ~1 ml PBS voor kamerdekglas.
6. Voeg ~10 μL montagemedia toe aan elke sectie. Pipetteer langzaam om luchtbellen te vermijden die optische aberraties veroorzaken tijdens de beeldvorming. Zuig eventuele belletjes op met behulp van een pipet. Voeg voor kamerglas 1 ml montagemedia toe aan elke put.
   OPMERKING: De volgende stappen, 6.7 en 6.8, zijn niet nodig voor het kamerafdekglas.
7. Leg voorzichtig nr. 1 22 mm x 50 mm afdekglas op het preparaat.
   NOTITIE: Luchtbellen kunnen worden geminimaliseerd door het ene uiteinde van het afdekglas stevig op de montagemedia te drukken en het glas op het monster te laten vallen, waardoor het medium gelijkmatig wordt verdeeld. De dikte van het dekglas moet overeenkomen met de specificaties van de objectieflens (bijv. #1.5 dekglaasje voor de meeste objectieven met een hoog numeriek diafragma). Als de objectieflens een correctiekraag heeft, zorg er dan voor dat deze is afgesteld op de juiste maat dekglaasjes. Het gebruik van de verkeerde dikte of kraaginstelling kan sferische aberratie veroorzaken en resulteren in wazige of vervormde beelden.
8. Draai de schuif om en druk voorzichtig op een pluisvrij doekje om het overtollige montagemedium eruit te duwen.
   OPMERKING: Duw niet met te veel kracht op de slede naar beneden. Overmatige kracht kan het weefsel beschadigen of vervormen, wat de uitlijning tussen beeldvormingsrondes kan beïnvloeden.

7. Microscoopopstelling en beeldvorming

OPMERKING: Dit protocol verwijst specifiek naar de ZEISS LSM980 en andere ZEISS-systemen. Deze stappen kunnen op andere systemen anders zijn. Er worden twee workflows beschreven: traditioneel confocaal + ontmenging (multi-track acquisitie met computationele spectrale ontmenging post hoc), die kan worden gebruikt wanneer er geen spectrale detector beschikbaar is, maar die langere acquisitietijden heeft en enige resterende doorbloeding; en volledige spectrale detectie (single-pass, 34-kanaals spectrale acquisitie), onze voorkeursmethode, omdat deze de beste SBR, bijna-nul overspraak en snelste beeldvormingstijden biedt.

1. Traditionele confocale microscopie
   1. Schakel het microscoopsysteem (inclusief lasers, detectoren en de computer) ongeveer 30 minuten voor de beeldvorming in.
   2. Selecteer op het scherm voor het bedienen van de microscoop door op Microscoop > objectieven te klikken de juiste objectieflens (bijv. 20x 0,8 NA) en reinig deze indien nodig met een lensveilig doekje.
   3. Monteer het monster stevig op het podium. Probeer de glazen kamer of de afdekglaskamer uit te lijnen met dezelfde hoek/hetzelfde uiteinde van de schuifhouder om de X-Y-uitlijning van opeenvolgende rondes te vergemakkelijken. Dit is afhankelijk van de geïnstalleerde houder.
   4. Stel scherp op het monster met behulp van de oculairs op de GFP-, YFP- of RFP-verlichting en schakel vervolgens over naar het tabblad Acquisitie op het computerscherm.
      NOTITIE: Gebruik het DAPI-filter niet bij het scherpstellen van het monster met behulp van de oculairs, omdat blootstelling van de DAPI-kleuring aan UV-licht (met behulp van de DAPI-filterkubus) ervoor zorgt dat deze wordt omgezet in een groenfluorescerend molecuul (aanvullende afbeelding 1A).
   5. Configureer beeldvormingssporen die overlapping en cross-laserexcitatie minimaliseren (Aanvullende Tabel 1, Aanvullende Tabel 2 rapporteert acquisitie-instellingen voor traditionele confocale microscopie-experimenten die hier worden getoond).
      OPMERKING: Ideale combinaties omvatten verschillende excitatie- en emissiepieken, zoals DAPI of AF488 samen met AF594, AF647 of AF700.
      1. Wijs de optimale excitatielaser(s) toe voor elke baan. Pas de grootte van het gaatje aan op 1 AU of Airy Unit voor elke baan voor een optimale optische sectie.
      2. Pas het acquisitiegolflengtebereik voor elke afstembare detector in de baan afzonderlijk aan, volgens de fluoroforen voor de baan.
      3. Stem het laservermogen en de versterkingsinstellingen van de detector af om de SBR te maximaliseren. Zorg ervoor dat zeer weinig of geen pixels de maximale intensiteit bereiken.
         NOTITIE: Om fotobleken en/of overbelichting van de detectoren te voorkomen, moet u het laservermogen zo laag mogelijk houden. Optimaliseer de verdunningen van antilichamen zodat een sterk signaal boven de achtergrond wordt gedetecteerd.
   6. Druk op de knop Continuous scanning mode om een voorbeeld van het voorbeeld te bekijken en de scanparameters in te stellen (scansnelheid, resolutie en indien nodig middeling).
      OPMERKING: Voor kleine tegels en om de achtergrond te minimaliseren, wordt een verblijftijd tussen 0,2-0,3 μs, met 1-2 middelingsrondes, aanbevolen. Om de snelheid te maximaliseren met behoud van segmentatie en resolutie van één cel, gebruikt u de hoogste scansnelheid zonder middeling en een pixelgrootte van 0,2-0. μm/pixel. Beeldvorming met 2048 x 2048 pixels per tegel met een 20x/0,80 NA-objectief levert bijvoorbeeld 0,20 μm/pixel op over een veld van 424,26 x 424,2 μm².
   7. Voer testscans uit voor elke baan om te controleren op overspraak of doorbloeding.
      1. Start op de dia die is gekleurd met alle markeringen in de continue scanmodus elke laser op laag vermogen en til deze alleen op totdat de markering duidelijk zichtbaar is zonder verzadiging (gebruik de LUT/verzadigingsindicator).
         OPMERKING: Indien mogelijk wordt aanbevolen om een duplicaatmonster of een ongewenst gebied te gebruiken om de microscoopinstellingen te optimaliseren voordat u het experimentele monster in beeld brengt. Dit is vooral belangrijk bij het kleuren met DAPI (om het risico van fotoconversie te voorkomen) of fluoroforen die snel fotobleekmiddel (bijv. PE).
      2. Ga naar de enkelvoudig gekleurde knop voor die fluorofoor. Pas het laservermogen en de detectorversterking aan zodat het signaal helder en onverzadigd is.
      3. Scan op hetzelfde glaasje met één kleuring alle andere detectiekanalen. Als de intensiteit buiten het kanaal de achtergrond overschrijdt, verkleint u het detectievenster en/of verlaagt u de excitatie/versterking.
      4. Herhaal 7.1.7.1-7.1.7.2 voor elke fluorofoor. Controleer na elke aanpassing kort eerder geoptimaliseerde vlekken om de intensiteit vergelijkbaar te houden, vooral voor markeringen die co-lokaliseren.
   8. Schakel de functie Tegels in en definieer een gebied voor het verwerven van tegels.
      1. Optimaliseer de focus voor het tegelacquisitiegebied in het midden van het weefsel. Zoek een uniek kenmerk (een set cellen in een bepaalde rangschikking) als referentie voor uitlijning in latere rondes.
   9. Schakel de Z-stack-functie in en ga naar het tabblad Z-stack. Ga naar het tabblad Centrum. Stel het aantal plakjes in de Z-stack in op minimaal 6, met een interval van minimaal 1 μm tussen de plakjes. Klik vervolgens op de knop 'Centrum ' om het huidige scherpstelpunt (bepaald in stap 6.1.8.1) als het middelste segment van de stapel te plaatsen.
   10. Klik op de knop Experiment starten om te beginnen met het ophalen van de afbeeldingen. Sla de acquisitie-instellingen op en maak een back-up van de afbeeldingsgegevens door met de rechtermuisknop op de miniatuur van de afbeelding te klikken en Opslaan als te selecteren. Kies vervolgens de bestandslocatie en geef de afbeelding een naam.
   11. Meng de afbeelding met dezelfde geoptimaliseerde instellingen van de verwerving van het betegelde gebied, leg een Snap vast van elke enkelvoudige kleurplaat om het ware signaalspectrum te verkrijgen en van de niet-gekleurde regelaar om achtergrond/autofluorescentie vast te leggen, voorbereid in stap 6.4.
       1. Deze beelden worden gebruikt voor spectrale ontmenging; Selecteer geen echt signaal uit gemultiplexte samples. Bevestig dat het geselecteerde gebied het signaal echt vertegenwoordigt door er eerst voor te zorgen dat de intensiteit/morfologie afwezig is of gelijk is aan de achtergrond in de ongekleurde controle en vervolgens overeenkomt met de verwachte lokalisatie van de marker (bijv. membraan versus nucleair versus cytoplasmatisch versus uitgescheiden patronen).
       2. Open de snapafbeelding. Klik op het tabblad Ontmengen . Gebruik een van de regioselectietools op het tabblad Unmix-tools om een ROI te trekken rond het positieve signaal (er verschijnt een spectrum van die regio). Herhaal dit voor elke foto van elke fluorofoor om referentiespectra te creëren voor het ontmengen.
          1. Vergelijk dit spectrum met het theoretische spectrum van de fluorofoor om er zeker van te zijn dat het geselecteerde gebied representatief is voor het echte signaal. Geef het spectrum een naam op basis van elke fluorofoor en sla het op in de spectrale database.
             OPMERKING: Een spectrum voor autofluorescentie kan worden geïdentificeerd en behandeld als een afzonderlijke fluorofoor om het te ontmengen met andere signalen. Bij volledige paneloptimalisatie is het verwerven van nieuwe referenties niet nodig, omdat men dezelfde instellingen kan hergebruiken zolang hetzelfde protocol en weefseltype worden gebruikt.
       3. Laad de tegelafbeelding en navigeer naar de tool Mengen. Gebruik de knop + om de referentiespectra voor elke fluorofoor toe te voegen aan de ontmengingslijst en klik vervolgens op de knop Lineaire ontmenging .
   12. Sla de ongemengde afbeelding op voor latere analyse.
       OPMERKING: De uitvoer is een afbeelding met meerdere tegels met een kanaal voor elke markering. Het experiment kan hier worden gepauzeerd voordat het verder gaat.
   13. Verkrijg een schaduwreferentieafbeelding
       1. Gebruik exact dezelfde instelling die is gebruikt om het monster af te beelden, om een afbeelding van een DAPI-kalibratiedia te maken. Sla de afbeelding op en extraheer vervolgens alleen het DAPI-kanaal om als schaduwreferentie te dienen. De uitvoer is een vlak veldbeeld (aanvullende figuur 1B).
          OPMERKING: Het is niet nodig om voor elk monster een referentiebeeld te verkrijgen. Zolang hetzelfde instrument met dezelfde instellingen wordt gebruikt, moet de referentie hetzelfde zijn. Deze verwijzing is niet nodig als de verkregen afbeeldingen geen schaduwartefacten hebben, zoals weergegeven in aanvullende figuur 1C.
2. Spectrale confocale microscopie
   1. Schakel het microscoopsysteem in (inclusief lasers, detectoren en de computer). Selecteer de juiste objectieflens (bijv. 20x 0.8 NA, of een ander objectief) en reinig indien nodig.
   2. Monteer het monster stevig op het podium. Zorg ervoor dat het dekglaasje naar het doel wijst.
   3. Stel scherp op het monster met behulp van helderveld of DIC en schakel vervolgens over naar de fluorescentiemodus. Configureer spectrale acquisitie. Aanvullende tabel 3 rapporteert acquisitie-instellingen voor spectrale confocale microscopie-experimenten die hier worden getoond.
      1. Wijs de juiste lasers toe.
         OPMERKING: Sommige lasers kunnen meerdere fluoroforen exciteren. Het is dus misschien niet nodig om voor elke fluorofoor een unieke laser te hebben.
      2. Selecteer een straalsplitser die geschikt is voor de laserlijnen die worden gebruikt. Stel alle detectoren in staat om zoveel mogelijk van het spectrum vast te leggen. Stel de grootte van het gaatje in op 1 AU voor een optimale optische sectie.
   4. Optimaliseer de laserinstelling
      1. Gebruik een sectie die is gekleurd met alle markeringen en start de continue scanmodus met lasers op een laag vermogen. Stem de intensiteit voor elke laser af totdat markeringen kunnen worden geïdentificeerd bij een goede SBR.
         OPMERKING: Hoewel dit geen nauwkeurige aanpassing mogelijk maakt voor spectraal overlappende fluoroforen, helpt het om het aantal keren dat de enkelvoudig gekleurde objectglaasjes op de microscoop moeten worden geschakeld, te minimaliseren.
      2. Gebruik secties met één vlek om de laserintensiteiten voor elke fluorofoor nauwkeurig af te stellen. Schakel iteratief over van secties met één vlek terug naar de sectie met alle markeringen totdat het signaal van elke markering kan worden gevisualiseerd zonder oververzadiging.
         OPMERKING: Elke keer dat een laserintensiteit of versterkingsinstelling wordt aangepast, bezoekt u de eerder geoptimaliseerde dia's met enkele kleuring opnieuw om ervoor te zorgen dat het signaal optimaal blijft. Voor de meest optimale ontmenging moeten de signaalintensiteitsniveaus tussen markers zo gelijk mogelijk zijn, vooral tussen markers die colocaliseren. Indien mogelijk wordt aanbevolen om een duplicaatmonster of een ongewenst gebied te gebruiken om de microscoopinstellingen te optimaliseren voordat het experimentele monster in beeld wordt gebracht. Dit is vooral belangrijk bij het kleuren met DAPI (om het risico van fotoconversie te voorkomen) of fluoroforen die snel fotobleekmiddel (bijv. PE).
   5. Voer de stappen 7.1.8 - 7.1.14 uit.

8. Het dekglaasje verwijderen (geldt alleen voor dia's, niet voor afdekglas met kamers)

1. Dompel de dia onder in PBS en laat het dekglaasje loskomen. Probeer het dekglaasje niet los te forceren, omdat dit het weefsel kan vervormen, waardoor uitlijningsproblemen kunnen ontstaan bij volgende beeldvormingsrondes of volledig kan worden losgemaakt van het objectglaasje. Gebruik een container die groot genoeg is om op de dia te passen en zorg ervoor dat deze volledig kan worden ondergedompeld in PBS.

9. Fluorofoor bleken en fietsen

1. Alleen voor afdekglas met kamer: Zuig zoveel mogelijk montagemedia op met een pipet en zorg ervoor dat het weefsel niet wordt beschadigd.
   OPMERKING: Door de kamer naar de zijkant te kantelen, kan het aanzuigen worden vergemakkelijkt.
2. Was 3x met ~1 ml (kamerdekglas) of ~100 μL (dia's) PBS gedurende 2 minuten totdat de montagemedia volledig zijn verwijderd.
3. Bereid de bleekoplossing voor in de zuurkast. Weeg 10 mg LiBH₄ met behulp van een microspatel rechtstreeks af in een droog bekerglas. Voeg voorzichtig 10 ml ultrapuur water rechtstreeks toe aan het bekerglas met LiBH₄ en meng tot het volledig is opgelost om de bleekoplossing te maken.
   OPMERKING: Bereid u onmiddellijk voor gebruik voor op maximale reactiviteit.
   LET OP: LiBH₄ is uiterst ontvlambaar, dus deze stap vereist uiterste zorg - zorg ervoor dat de zuurkast op de juiste manier wordt gebruikt (d.w.z. vleugel op de juiste hoogte, geschikte persoonlijke beschermingsmiddelen, enz.) en werk alleen met <10 mg LiBH₄ per keer. Zorg ervoor dat het bekerglas volledig droog is voordat u LiBH4 toevoegt - als u dit niet doet, kan dit leiden tot brand.
4. Voeg ~100 μL bleekoplossing toe, met behulp van een glazen pasteurpipet, aan elk weefselgedeelte en incubeer gedurende 15 minuten bij kamertemperatuur in de zuurkast. Gebruik 2 ml bleekoplossing voor kamerglaasjes.
5. Als het bleken van BV-kleurstoffen (bijv. BV421, BV510, enz.), verplaats het putje dan voorzichtig naar een epifluorescentiemicroscoop. Selecteer het DAPI-filter, stel de sample scherp en verlicht deze op vol vermogen.
   1. Gebruik het 5x objectief voor een groter verlichtingsveld. Verlaag de trap zo laag mogelijk om schade aan de objectieven en de behuizing te voorkomen.
6. Decanteer de LiBH_4-oplossing uit het putje met behulp van een glazen pasteurpipet en voeg deze weer toe aan het bekerglas met LiBH_4-oplossing .
   LET OP: Dit is nu afval LiBH₄; De oplossing kan niet worden opgeslagen voor toekomstig gebruik.
7. Was de objectglaasjes 3x met verdunningsbuffer en incubeer gedurende ~3 min. Het totale volume is 2 ml voor de kamergeleiders.
8. Voeg de antilichaammix en kleuring toe volgens het normale protocol (stappen 6.3 - 6.8).
9. Voeg 2N H₂SO₄ druppelsgewijs toe aan het afvalstof LiBH₄ in de zuurkast en meng regelmatig.
   LET OP: LiBH₄ zal agressief borrelen. Deze bellen zijn H_2-gas dat vrijkomt uit de LiBH₄; H₂ is zeer ontvlambaar, dus wees uiterst voorzichtig bij deze stap en voeg H₂SO₄ heel langzaam toe.
10. Giet het in een absorberende onderlegger als de oplossing niet meer borrelt. Spoel het bekerglas af met ultrapuur water en giet het in het absorberende onderkussen.
    LET OP: Doe het absorberende onderstuk in een zak voor chemische/biologisch gevaarlijke stoffen, zet deze vast en gooi het weg volgens de lokale richtlijnen voor chemisch gevaar.

10. Verwerking van het beeld na de acquisitie

1. Open de referentieafbeelding (vanaf stap 7.1.14) in de Zen-software door te klikken op Bestand > Openen > Referentieafbeelding selecteren.
   OPMERKING: De beeldverwerkingsstappen na de acquisitie kunnen ook worden uitgevoerd in open-source softwarepakketten. (bijv. AfbeeldingJ).
2. Pas de helderheid en het contrast aan om het dynamisch bereik te optimaliseren door te klikken op Intensiteit >> Intensiteit Contrast uitrekken > Automatisch > Toepassen.
3. Wijzig het pixeltype in 32-bits door te klikken op Verwerking > afbeelding > Pixeltype converteren > 32-bits (zwevend).
4. Normaliseer de referentieafbeelding door te klikken op Intensiteit > verwerken > normaliseren (verzadigde pixels = 0%) > Toepassen.
5. Maak de referentieafbeelding vloeiend door te klikken op Verwerking > Vloeiend > Gaussiaans > voer straal in (bijv. 2-5 px) > Toepassen (aanvullende afbeelding 1B).
   OPMERKING: Optimaliseer de Gaussiaanse vervagingsstraal door verschillende waarden uit te proberen. Om de juiste waarde te kennen, deelt u (Bewerken > Afbeeldingscalculator) de onbewerkte referentieafbeelding door de bewerkte afbeelding en de resulterende afbeelding moet een uniforme intensiteit hebben (alle pixels ongeveer dezelfde waarde).
6. Open de afbeelding met meerdere tegels die u wilt corrigeren door te klikken op Bestand > Open > selecteer afbeelding met meerdere tegels.
7. Pas stitching en arceringscorrectie toe met behulp van de verwerkte referentie door te klikken op Verwerken > Stitchen met de volgende parameters.
   1. Vink het vakje aan voor overvloeien. Vink het juiste arceringsvak aan en kies in het vervolgkeuzemenu de verwerkte referentieafbeelding (stap 10.5). Houd alle andere parameters hetzelfde.
      OPMERKING: Parameters moeten mogelijk worden afgestemd om de beste resultaten te krijgen.
   2. Kies in het menu Invoer/uitvoer de afbeelding met meerdere tegels als invoer en de schaduwreferentie als referentie.
   3. Druk bovenaan op de knop Toepassen en er wordt een nieuwe afbeelding gegenereerd waarin de stiksels en arcering zijn gecorrigeerd (aanvullende afbeelding 1D).
      OPMERKING: Stitching-correctie (aanvullende afbeelding 1I-J) is nodig om de nauwkeurigheid van de beelduitlijning later in het proces te garanderen.
   4. Sla de gecorrigeerde afbeelding op door te klikken op Bestand > Opslaan > Map selecteren.

11. Uitlijning van afbeeldingen

1. Converteer de verwerkte afbeeldingen van elk formaat (.czs, .tif, enz.) naar het Imaris-formaat met behulp van de Imaris File Converter-tool.
   OPMERKING: De tool kan worden gedownload en geïnstalleerd door de instructies op deze website te volgen (https://imaris.oxinst.com/microscopy-imaging-software-free-trial#file-converter).
2. Start de registratietool voor Imaris-extensies om de afbeeldingen van alle rondes te registreren (uitlijnen) tot één afbeelding met alle kanalen.
   OPMERKING: Om de tool te installeren en de afbeeldingen met succes uit te lijnen, volgt u de instructies op de volgende website (https://github.com/niaid/imaris_extensions).
3. Klik op de knop Imaris-extensies. Selecteer SimpleITK-hulpprogramma's > exporteer kanaalinstellingen naar CSV.
4. Klik op Bladeren, navigeer naar een IMS-afbeelding (uit een van de rondes), selecteer deze en klik op Openen.
5. Klik op Exporteren en kies een locatie om het CSV-bestand op te slaan. Voer een naam in en klik op Opslaan.
6. Open het opgeslagen CSV-bestand en controleer of de kanaalnamen correct zijn. Bewerk indien nodig.
7. Als er bewerkingen zijn aangebracht, gaat u naar Imaris Extensions > SimpleITK Utilities > Batch Configure Channel Settings.
   OPMERKING: Deze stap is niet nodig als er in de vorige stap geen bewerkingen zijn uitgevoerd.
8. Klik op Bladeren, navigeer naar het CSV-bestand, selecteer het en klik op Openen. Klik op Volgende en vervolgens nogmaals op Bladeren om dezelfde .ims-afbeelding te selecteren en klik op Openen.
9. Klik op Configureren om de wijzigingen toe te passen. Herhaal stap 11.3-11.8 voor alle afbeeldingen uit verschillende rondes.
10. Zodra de kanalen de juiste naam hebben, gaat u naar Imaris Extensions > SimpleITK-algoritmen > Affine-registratie van Z-stacks met behulp van een gemeenschappelijk kanaal.
11. Klik op Bladeren, navigeer naar de map met alle rondes, selecteer alle afbeeldingen en klik op Openen.
12. Klik op Volgende, selecteer het registratiekanaal (fiducciaal kanaal). Voor dit protocol is gebruik gemaakt van het DAPI-kanaal. Kies vervolgens voor de vaste afbeelding.
    OPMERKING: Kies een kanaal/markering die constant blijft in alle rondes en bestand is tegen chemisch of fotobleken (bijv. nucleaire kleurstoffen zoals DAPI). Kies vervolgens voor de vaste afbeelding.
13. Klik op Geavanceerde registratie-instellingen, vink alle vakjes behalve Automatisch maskeren aan en stel Gaussiaanse afvlakkingssigma in op 5.0.
14. Klik op Gereed en vervolgens op Registreren om de uitlijning uit te voeren. Zodra de registratie is voltooid, klikt u op Pixels wijzigen en Gecombineerde afbeelding opslaan.
15. Selecteer na het hersamplen het fiduciale kanaal en klik op Correlatie berekenen. De uitvoerbestanden bevatten een uitgelijnde output.ims-afbeelding, twee PDF's die de uitlijningskwaliteit voor en na de registratie weergeven, een JSON-bestand met de instellingen die voor de registratie zijn gebruikt en een TXT-bestand met het logboek van het hele proces.

12. Uitlijning van afbeeldingen

1. Segmenteer cellen/objecten met behulp van CellPose (v2.5)²⁵
2. Genereer voor elke gegevensset met één kleuring één segmentatiemasker op basis van het eigen detectiekanaal van de markering (voorbeeld: genereer voor de enkele CD20-kleuring het masker op basis van het AF488-detectiekanaal (het beoogde kanaal voor CD20)).
3. Pas het segmentatiemasker uit stap 2 toe op elk kanaal in dezelfde gegevensset (in het CD20-voorbeeld wordt het van AF488 afgeleide masker toegepast op AF488 om het echte signaal te meten en op alle andere detectiekanalen om doorbloeding te meten).
4. Extraheer intensiteiten en gebieden per object in Python met behulp van scikit-image (regionprops_table) en NumPy.
5. Signaal-achtergrondverhouding (SBR)
   1. Bereken de gemiddelde objectintensiteit voor alle gesegmenteerde ROI's in het beoogde detectiekanaal van de marker.
   2. Definieer achtergrondintensiteit als de gemiddelde intensiteit van alle pixels buiten ROI's in hetzelfde gezichtsveld, met uitzondering van opvulling met een nulwaarde of pixels die buiten het bereik vallen.
      Bereken SBR als:
      
   3. Visualiseer SBR-verdelingen met vioolplots, waarbij waarden per object worden weergegeven als punten (of waarden per veld waar aangegeven).
6. Kwantificering doorbloeden
   1. Bereken voor elk niet-bedoeld kanaal de bleed-through (%) met dezelfde ROI's van het masker in stap 12.2:
      
   2. OPMERKING: diagonale ingangen zijn gelijk aan 100%, aangezien in het beoogde kanaal van een afbeelding met één kleuring de teller en noemer identiek zijn (echt markeringssignaal gemeten in het eigen kanaal).

Resultaten

Twee fundamentele uitdagingen waarmee immunofluorescentiebeeldvormingstechnieken worden geconfronteerd, zijn de niet-specifieke binding van fluorofoor-geconjugeerde antilichaamsondes en weefselautofluorescentie. Dit protocol is ontworpen om een echt signaal van de achtergrond te onderscheiden om gemultiplexte immunofluorescentietechnieken te optimaliseren.

Heparineblokkering vermindert d...

Discussie

Spectrale IBEX, een aanpassing van het IBEX-protocol, pakt met succes twee belangrijke problemen aan in immunofluorescentiebeeldvorming: niet-specifieke binding en autofluorescentie. Het behandelen van sterk eosinofiele weefsels met heparine en het gebruik van spectrale ontmenging om autofluorescentie en spectrale overlap tussen kanalen te elimineren, verhoogde de detectie van echt signaal boven de achtergrond aanzienlijk. Door alle markeringen in één keer vast te leggen, wordt de acquis...

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
2N zwavelzuur (H2SO4) oplossing	N/A	N/A	Wat beschikbaar/gebruikt wordt in het lab
500 mL beker	N/A	N/A	Wat beschikbaar/gebruikt wordt in het lab
6-wellsplaat	N/A	N/A	Wat beschikbaar/gebruikt wordt in het lab
Bcl-6 - Alexa Fluor 647	BD Biosciences	561525	Verdunningsfactor 1:100
BD Cytofix/Cytoperm Fixatie/Permeabilisatie Kit	BD Biosciences	554722
Dissectiemicroscoop op tafel	N/A	N/A	Wat beschikbaar/gebruikt wordt in het lab
Rundserumalbumine (BSA)	SIGMA-ALDRICH	A4503
CD11c - Alexa Fluor 700	BD Biosciences	561352	Verdunningsfactor 1:100
CD138/Syndecan-1 - PE	BioLegend	356503	Verdunningsfactor 1:200
CD20 - Alexa Fluor 488	Invitrogen	53020282	Verdunningsfactor 1:100
CD21 - Alexa Fluor 532	NovusBio	NBP2-60733AF532	Verdunningsfactor 1:100
CD23 - PE	BioLegend	338507	Verdunningsfactor 1:200
CD3 - iFluor 594	AAT Bioquest	100320C0	Verdunningsfactor 1:100
CD31 - Alexa Fluor 700	BioLegend	303134	Verdunningsfactor 1:100
CD34 - iFluor 594	AAT Bioquest	103400C0	Verdunningsfactor 1:100
CD38 - Alexa Fluor 700	BioLegend	303523	Verdunningsfactor 1:100
CD4 - Alexa Fluor 647	BioLegend	300520	Verdunningsfactor 1:100
CD45 - Alexa Fluor 532	ThermoFisher Scientific	58045942	Verdunningsfactor 1:100
CD54/ICAM-1 - Alexa Fluor 647	BioLegend	353113	Verdunningsfactor 1:100
Chrome Alum-Gelatin Lijm	Newcomer Supply	1033A
Cryomold	Fisher Scientific	NC9511236	Ook Catalogusnr.50-465-347 voor grotere monsters
DAPI kalibratieschuif	Agar Scientific	AG2273
DAPI oplossing, 1 mg/mL	ThermoFisher Scientific	62248	Verdunningsfactor 1:3000
E-cadherin/CD324 - Alexa Fluor 647	BioLegend	147307	Verdunningsfactor 1:100
EpCAM/CD326 - Alexa Fluor 594	BioLegend	324228	Verdunningsfactor 1:100
Eppendorf/falcon buisjes	N/A	N/A	Wat beschikbaar/gebruikt wordt in het lab
Fluoromount-G	SouthernBiotech	0100-01
Pincetten	N/A	N/A	Wat beschikbaar/gebruikt wordt in het lab
FoxP3 - eFluor 660	ThermoFisher Scientific	50577382	Verdunningsfactor 1:100
Microscoopglazen met bevroren uiteinde	ChemScience	GEW45-2575-W
GL7 - Alexa Fluor 488	ThermoFisher Scientific	53590282	Verdunningsfactor 1:100
Heparine natriumzout	SIGMA-ALDRICH	H3393	10KU
HLA-DR - PE	NovusBio	NB100-77855PE	Verdunningsfactor 1:200
Human TruStain FcX (Fc Receptor Blocking Solution)	BioLegend	422302	Verdunningsfactor 1:100
Vochtwolk	N/A	N/A	Wat beschikbaar/gebruikt wordt in het lab
IJsemmer met deksel	N/A	N/A	Wat beschikbaar/gebruikt wordt in het lab
IgD - Alexa Fluor 488	BioLegend	348215	Verdunningsfactor 1:100
IL4Ra/CD124 - PE	BioLegend	144803	Verdunningsfactor 1:200
Imaris File Converter	OXFORD instruments	N/A	Conversie van elk afbeeldingsbestandformaat naar.ims formaat (https://imaris.oxinst.com/microscopy-imaging-software-free-trial#file-converter)
Isopentaan (2-Methylbutaan)	N/A	N/A	Wat beschikbaar/gebruikt wordt in het lab
Ki-67 - Alexa Fluor 488	BD Biosciences	558616	Verdunningsfactor 1:100
Kimberly-Clark Professional Kimtech Science Kimwipes Delicate Task Wipers, 1-Ply	Kimtech Science	06-666
Grote (d.w.z. 25 cm lang) pincetten	N/A	N/A	Wat beschikbaar/gebruikt wordt in het lab
Vloeibare Stikstof	N/A	N/A	Wat beschikbaar/gebruikt wordt in het lab
Lithiumborohydride (LiBH4)	SIGMA-ALDRICH	222356
MECA-79 - Alexa Fluor 488	Invitrogen	53603680	Verdunningsfactor 1:100
Microscoop glasplaatje Dekglas Nr.1 22x50 mm	Fisher Scientific	12-542A
Milli-Q water	N/A	N/A	Wat beschikbaar/gebruikt wordt in het lab
MUC2 - Alexa Fluor 488	NovusBio	NB120-11197AF488	Verdunningsfactor 1:100
Nunc Lab-Tek Chambered Coverglass	ThermoFisher Scientific	155380
PAP pen