Induceren van gerichte milde hyperthermie in muizentumormodellen door fotothermische conversie van nabij-infrarood licht door intratumorale gouden nanostaafjes

Samenvatting

Dit protocol presenteert technieken en methodologie die nodig zijn voor gerichte hyperthermische therapie in solide tumormodellen. De aanpak maakt gebruik van de fotothermische conversie van nabij-infrarood licht door intratumoraal geïnjecteerde gouden nanostaafjes om plaatselijke verwarming in de micro-omgeving van de tumor te induceren.

Samenvatting

Milde hyperthermie (42-48 °C) is een gevestigde therapeutische modaliteit die gecontroleerde tumorceldood kan induceren en immuunresponsen tegen kanker kan stimuleren. Het blijft echter een grote uitdaging om precies warmte aan tumorweefsel toe te dienen en tegelijkertijd het omliggende gezonde weefsel te sparen. Traditionele hyperthermiemethoden, zoals geïsoleerde ledemaatperfusie, vereisen complexe, invasieve procedures en brengen een aanzienlijk risico op lokale toxiciteit en morbiditeit van de patiënt met zich mee. Daarentegen is fotothermische therapie met behulp van gouden nanodeeltjes geactiveerd door nabij-infrarood (NIR) licht naar voren gekomen als een veelbelovende, minder invasieve strategie voor het bereiken van gelokaliseerde hyperthermie. Met name gouden nanostaafjes (GNR's) vertonen afstembare optische eigenschappen en een hoge fotothermische conversie-efficiëntie, waardoor ze ideale kandidaten zijn voor nauwkeurige thermische modulatie van tumorplaatsen. Hoewel deze techniek veelbelovend is gebleken, vooral voor oppervlakkige en toegankelijke tumoren, blijven reproduceerbare toediening, ruimtelijke opsluiting en veiligheid actieve gebieden van verfijning. In dit protocol presenteren we onze gevalideerde en geoptimaliseerde methode voor het bereiken van gelokaliseerde, milde hyperthermie met behulp van intratumorale injectie van biocompatibele GNR's, gevolgd door kortdurende, gerichte NIR-laserblootstelling. Deze benadering maakt snelle, controleerbare verwarming binnen het therapeutische bereik mogelijk, waardoor immunogene tumorceldood wordt bevorderd en aangeboren immuunresponsen worden gestimuleerd, mechanismen die bijzonder relevant zijn voor immunologisch "koude" tumoren. Real-time temperatuurbewaking en lokale levering zorgen voor reproduceerbaarheid, veiligheid en minimale systemische blootstelling. Dit gestroomlijnde protocol biedt een robuust en toegankelijk platform voor preklinische studies en ondersteunt bredere inspanningen om milde hyperthermie te benutten bij immunotherapie bij kanker.

Inleiding

Er blijven aanzienlijke uitdagingen bij de behandeling van kanker, waaronder resistentie tegen geneesmiddelen, immuunontwijking en off-target toxiciteit, die allemaal het succes van conventionele therapieën op de lange termijn ondermijnen. Deze beperkingen hebben geleid tot de ontwikkeling van complementaire therapeutische strategieën die zijn ontworpen om resistentiemechanismen te overwinnen en tegelijkertijd nevenschade aan gezond weefsel te minimaliseren. Milde hyperthermie, gedefinieerd als de verhoging van de weefseltemperatuur tot 42-48 °C, wordt al lang erkend als een effectieve aanvulling op standaard kankertherapieën¹. Historisch gezien werd milde hyperthermie gebruikt in combinatie met chirurgie, chemotherapie of radiotherapie om de werkzaamheid van deze therapieën te verbeteren door de tumorperfusie te verhogen, de stromale architectuur te verstoren en kwaadaardige cellen gevoelig te maken voor cytotoxische agentia¹. Meer recentelijk, met het toenemende succes van immunotherapie in de oncologie, is er een groeiende belangstelling voor het benutten van het inherente immunomodulerende potentieel van milde hyperthermie om de antitumorimmuunrespons te verbeteren ^1,2,3.

Ondanks de aangetoonde klinische voordelen, blijft de bredere toepassing van tumorhyperthermie beperkt vanwege uitdagingen bij het bereiken van gelokaliseerde, controleerbare en reproduceerbare verhitting van tumoren en het vermijden van weefselschade buiten het doel⁴. De huidige klinische en experimentele hyperthermietechnieken, zoals regionale ledemaatperfusie of systemisch toegediende benaderingen op basis van nanodeeltjes, lijden vaak aan beperkte ruimtelijke precisie, variabele tumoropname en het potentieel voor systemische toxiciteit 2,5,6,7,8,9 . Gerichte hyperthermische therapie is een opkomende modaliteit op dit gebied van kankerbehandeling, ontworpen om selectief de tumortemperaturen te verhogen en tegelijkertijd de schade aan het omliggende gezonde weefsel te minimaliseren. Meer specifiek is de gerichte toediening van gouden nanostaafjes (GNR's) een veelbelovende methode om de huidige beperkingen van milde precisie en toxiciteit van tumorhyperthermie te overwinnen. GNR's zijn bijzonder geschikt voor fotothermische toepassingen vanwege hun afstembare oppervlakteplasmonresonantie in het NIR-gebied, hoge fotothermische conversie-efficiëntie en gunstige biodistributieprofielen in vergelijking met andere gouden nanostructuren^10,11. Hun respons op NIR-golflengten maakt efficiënte lichtabsorptie en plaatselijke verwarming mogelijk, zelfs in diepere weefsels, met minimale schade aan omliggende structuren. Als zodanig kunnen GNR's zorgen voor een betere werkzaamheid, doelgerichtheid en veiligheid bij hyperthermische therapieën.

Het doel van deze methode is om een zeer efficiënt, weinig resource-intensief en reproduceerbaar protocol te bieden voor het bereiken van milde, door goudnanoroden gemedieerde hyperthermie bij solide tumoren. Deze techniek, GNR-gemedieerde gerichte hyperthermische therapie (THT) genoemd, pakt de belangrijkste beperkingen van conventionele hyperthermiebenaderingen aan door directe intratumorale GNR-injectie te combineren met externe NIR-lichtactivering. Dit zorgt voor een hoge lokale concentratie nanodeeltjes, waardoor de reproduceerbaarheid en veiligheid worden verbeterd, met name voor kleine of slecht gevasculariseerde tumoren die mogelijk niet efficiënt systemisch toegediende middelen accumuleren. Bovendien zorgt het gebruik van directe intratumorale injectie van GNR's gevolgd door blootstelling aan nabij-infrarood (NIR) licht voor nauwkeurige, gecontroleerde en gelokaliseerde verhitting van tumoren, terwijl systemische blootstelling, toxiciteit en off-target effecten geassocieerd met conventionele regionale hyperthermietechnieken worden geminimaliseerd.

Veel kankers vertonen complexe en diverse mechanismen van immuunontsnapping, waardoor ze op verschillende manieren weerstand kunnen bieden aan immunotherapie, het duidelijkst door slechte infiltratie van immuuncellen in de micro-omgeving van de tumor ^2,4,5. Milde hyperthermie biedt een synergetische oplossing wanneer het wordt gebruikt in combinatie met immunotherapieën. Naast directe cytotoxische effecten induceert milde hyperthermie bij voorkeur immunogene celdood (ICD), wat leidt tot het vrijkomen van tumor-geassocieerde antigenen (TAA's) en schade-geassocieerde moleculaire patronen (DAMP's)^1,2. Deze signalen activeren aangeboren immuunroutes, verbeteren de presentatie van tumorantigeen, bevorderen de rijping van dendritische cellen en verbeteren de priming van T-cellen, waardoor uiteindelijk de infiltratie van immuuncellen in de micro-omgeving van de tumor toeneemt ^1,6,12. In onze eigen preklinische modellen functioneerde deze GNR-gemedieerde THT-techniek om lokale immuunresponsen te activeren en de immuuninfiltratie van tumoren te versterken¹³. In combinatie met intra-tumorale interleukine-2 (IL-2) therapie of systemische anti-PD1-checkpointremming, verhoogde deze GNR-gemedieerde THT-techniek de antitumorimmuniteit verder en presteerde het beter dan alleen monotherapie in borstkanker- en melanoommodellen¹³. Deze resultaten komen overeen met een groeiend aantal bewijzen dat de synergie ondersteunt tussen door nanodeeltjes gemedieerde hyperthermie en immunotherapie bij solide tumoren, waaronder borstkanker 14,15,16 en hersentumoren^17,18. Kortom, door immunologisch 'koude' tumoren om te zetten in 'hete' tumoren, kan GNR-gemedieerde THT de respons op immunotherapieën, waaronder checkpointremmers, verbeteren ^1,2,12.

Het GNR-gemedieerde THT-protocol dat hier wordt gepresenteerd, is arbeidsintensief en technisch eenvoudig en in grote lijnen aanpasbaar aan onderhuidse of oppervlakkige tumoren. Deze techniek is met name geschikt voor onderzoekers die werken met muismodellen van onderhuidse of oppervlakkige tumoren, waaronder melanoom en borstkanker. Met kleine aanpassingen kan het echter worden uitgebreid naar andere tumortypen en anatomische plaatsen. Bovendien biedt deze techniek een veelzijdig platform voor het integreren van ruimtelijk gecontroleerde hyperthermie in preklinische kankerstudies, met name die welke immunotherapie-versterkende strategieën onderzoeken, en die milde hyperthermie willen onderzoeken om de respons op de behandeling op immunotherapiebehandelingen te verbeteren of resistentie tegen immunotherapiebehandelingen te overwinnen. Bovendien zijn de kennis en apparatuur die nodig zijn voor de implementatie van deze techniek toegankelijk en aanpasbaar aan een verscheidenheid aan zorgomgevingen, waardoor de haalbaarheid ervan voor breder klinisch gebruik wordt vergroot³.

In dit manuscript geven we gedetailleerde stap-voor-stap instructies voor het implementeren van ons GNR-gemedieerde THT-protocol in muismodellen met behulp van een NIR-lasersysteem dat werkt op 860 nm. Het succes van dit protocol hangt af van een efficiënte diepe weefselactivering van gouden nanostaafjes met behulp van de juiste golflengte van nabij-infrarood licht. We belichten ook procedurele overwegingen voor het bereiken van consistente, veilige en effectieve milde hyperthermische dosering in muizentumormodellen, zoals nauwkeurige real-time monitoring van de interne tumortemperatuur tijdens de procedure. Deze methode bouwt voort op en brengt aspecten van eerder gerapporteerde benaderingen van hyperthermie van nanodeeltjes samen en biedt een uitgebreid, gevalideerd, zeer nauwkeurig en reproduceerbaar alternatief voor preklinisch kankeronderzoek. Over het algemeen biedt dit protocol een biologisch veilige, kosteneffectieve en weinig toxische methode voor het toedienen van tumorgelokaliseerde hyperthermie, met een sterk potentieel om de werkzaamheid van bestaande kankerimmunotherapieën te verbeteren en het klinische nut van hyperthermie in de oncologie te verbreden.

Protocol

Alle experimentele protocollen zijn goedgekeurd door de University Committee on Laboratory Animals van de Dalhousie University volgens de richtlijnen van de ethische normen van de Canadian Council on Animal Care. Alle geldende internationale, nationale en institutionele richtlijnen voor de verzorging en het gebruik van dieren werden gevolgd. Zie de Materiaaltabel voor details over alle materialen die in dit protocol worden gebruikt.

1. Vereisten voor laser- en behandelingsfaciliteiten

1. Veilige toegang tot een volledig gekalibreerd lasersysteem dat licht kan leveren met een golflengte van 860 ± 10 nm met een intensiteit tot 4.000 mA. Zorg ervoor dat het lasersysteem de juiste uitschakelmechanismen heeft.
   OPMERKING: In dit onderzoek hebben we een op maat ontworpen laser gebruikt. Het model dat in dit protocol wordt gebruikt, heeft een laseractiveringstoets, een noodstopknop en een vergrendelingsjumper (de aangesloten jumper kan ook worden aangesloten op een veiligheidsschakelaar die wordt gebruikt voor veiligheidsnaleving, bijv. deurtoegang tot een laserkamer van klasse 4).
2. Bevestig een inbrengbare, gekalibreerde temperatuursonde voor intratumorale temperatuurbewaking die in staat is om live temperatuurgegevens te verzenden via de juiste thermokoppelopnamesoftware.
3. Bereid een aangewezen laserruimte voor die voldoet aan de vereiste veiligheidsnormen voor de laserklasse. Zorg voor een onbelemmerd werkgebied, met goede ventilatie, goede verlichting en alle reflecterende oppervlakken afgedekt. Beperk de toegang tot de ruimte tijdens lasergebruik om onbedoelde blootstelling te voorkomen. Zorg ervoor dat al het personeel dat bij het onderzoek betrokken is, volledig is opgeleid in laserbediening en veiligheidsprotocollen en de juiste persoonlijke beschermingsmiddelen en oogbescherming draagt.
4. Creëer een werkruimte in de laserruimte met een anesthesiemachine in de buurt van de laseropstelling. Zorg ervoor dat de laser stevig is gemonteerd, maar verstelbaar, waarbij de proefpersoon ongeveer 1-2 cm van de laserstraalbron kan worden geplaatst om een nauwkeurige targeting van de tumorplaats te garanderen.
5. Gebruik een warmtebeeldcamera op een statief, gepositioneerd om temperatuurmetingen van het oppervlak van het onderwerp vast te leggen, tijdens laserbelichting.

2. Celcultuur en inoculatie (injectie van tumorcellen)

1. Selecteer geschikte muismodellen op basis van het tumortype dat interesse heeft, volgens gestandaardiseerde voorbereidings- en onderhoudstechnieken voor laboratoriumcelculturen. Om dit protocol te volgen, selecteert u 6-8 weken oude vrouwelijke BALB/c-muizen voor CT26-tumorinoculatie.
   OPMERKING: Immunocompetente of immuungecompromitteerde muizen van verschillende leeftijden en stammen kunnen worden gebruikt, afhankelijk van de onderzoeksvereisten.
2. Kweek de CT26-kankercellijn in RPMI 1640-medium aangevuld met 10% door warmte geïnactiveerd foetaal runderserum (FBS), 100 E/ml penicilline, 100 μg/ml streptomycine en 2 mM glutamine. Houd de cellen op 37 °C in een bevochtigde atmosfeer met 5% CO₂ . Vernieuw het medium elke 2-3 dagen en subkweek cellen met een confluentie van 70-80% met een splitverhouding van 1:4 tot 1:10. Gebruik cellen in vroege passages (bijv. ≤10 passages) om een consistente groei en inoculatie-efficiëntie te garanderen. Breid de culturen zo nodig uit om het vereiste aantal cellen voor inoculatie te verkrijgen.
   OPMERKING: Het aantal cellen dat per muis nodig is, is afhankelijk van het model, bijvoorbeeld voor het CT26-model voor colorectale kanker bij muizen hadden we 5 × 10⁵ cellen per muis nodig.
3. Maak aanhangende cellen los met behulp van trypsinisatie en was 2x met steriel 1x PBS. Resuspendeer in een steriele 1x PBS-oplossing om de gewenste concentratie van 5 × 10⁶ cellen/ml te bereiken. Bewaar de celsuspensie in een steriele microcentrifugebuis van 2 ml maximaal 1 uur op ijs voordat u deze injecteert.
4. Verdoof muizen vóór injectie met behulp van een inductiekamer met 4% verdampt isofluraan met een debiet van 0,8 l/min. Eenmaal verdoofd, verminder isofluraan tot 2% en handhaaf de anesthesie met een neuskegel tijdens de inoculatieprocedure. Bevestig de anesthesiediepte met behulp van een teenknijptest om er zeker van te zijn dat er geen pijnreactie optreedt. Breng oogsmeermiddel aan op beide ogen om uitdroging te voorkomen en mogelijke laserschade te minimaliseren.
5. Scheer de injectieplaats (bijv. de linkerflank voor dit heterotope CT26-model) met een elektrisch scheerapparaat en reinig het gebied met een alcoholdoekje om vuil te verwijderen en de huid te desinfecteren. Knijp in de huid op de injectieplaats en injecteer 100 μl van de celsuspensie met 5 × 10⁶ cellen/ml subcutaan met behulp van een naald van 26 g en een spuit van 1 ml. Haal na de injectie de muis uit de neuskegel en plaats hem terug in zijn kooi om te herstellen op een verwarmende deken gedurende 1 uur.

3. Tumorgroei en meting

1. Begin met dagelijkse tumormetingen, meestal beginnend op dag 7 na injectie, met behulp van een tumormeetmaat. Meet tumorafmetingen in drie assen: breedte, lengte en hoogte en bereken tumorvolumes met behulp van een ellipsoïde tumorvolumeformule van π/6 × lengte × breedte × hoogte.
2. Plan om GNR-gemedieerde THT te starten zodra tumoren een volume van ongeveer 50 mm³ (± 20 mm³) bereiken.
   OPMERKING: Voor ons CT26-model werd dit tumorvolume bereikt tussen dag 10 en 12 na injectie van tumorcellen).
3. Zorg er voorafgaand aan de laserbehandeling voor dat muizen willekeurig worden toegewezen aan controle- en behandelingsgroepen. De behandelingsgroep krijgt een intratumorale GNR-injectie gevolgd door laserblootstelling; en de controlegroep krijgt een intratumorale PBS-injectie (hetzelfde volume als de GNR-injectie) in plaats van GNR's, gevolgd door laserblootstelling.

4. Fotothermische conversie van NIR-licht met behulp van intra-tumorale GNR's

1. Gebruik in een steriele biologische veiligheidskast een spuit van 0,3-1 ml met een naald van 31 G om het juiste volume GNR's op te zuigen op basis van elk tumorvolume.
2. Verdoof de muis op dezelfde manier als bij injectie van kankercellen (met een neuskegel die 2% isofluraan afgeeft met een stroomsnelheid van 0,8 l/min en bevestig voldoende anesthesiediepte met behulp van een teenknijptest).
3. Eenmaal verdoofd, verlaagt u het isofluraan tot 2% en plaatst u de muis in buikligging op het laserplatform terwijl u de anesthesie handhaaft met behulp van een neuskegel. Breng oogsmeermiddel aan op beide ogen om uitdroging te voorkomen en mogelijke laserschade te minimaliseren.
4. Scheer indien nodig overtollige vacht rond de tumor om ervoor te zorgen dat het huidoppervlak wordt blootgesteld aan de laser. Gebruik ethanol om het tumoroppervlak te desinfecteren en veeg eventuele vacht/vuil weg.
   OPMERKING: In deze studie hebben we GNR's gebruikt die zijn geoptimaliseerd voor absorptie bij 860 nm. Als u een ander GNR-product gebruikt dan hier wordt voorgesteld, zorg er dan voor dat de afgifte van de NIR-golflengte van de laser is geoptimaliseerd volgens het absorptiespectrum van de GNR.
5. Voorafgaand aan blootstelling aan laser, injecteer GNR's intratumoraal in een concentratie van 1 μg/^mm3 van het tumorvolume. Verdeel indien nodig de injectie over twee intratumorale plaatsen om een efficiënte verdeling van GNR's in de tumor te garanderen.
   OPMERKING: In deze protocolvideo werden GNR's gebruikt met een concentratie van 2 μg/μL; daarom werd voor een tumor van 50 mm³ 25 μL GNR's in de tumor geïnjecteerd. Zorg ervoor dat u overtollige GNR's op het huidoppervlak wegveegt na de respectieve injecties.
6. Dien voor muizen uit de controlegroep een intratumorale injectie van steriel PBS toe met het equivalente volume dat wordt gebruikt voor de GNR-injectiegroep(en) (bijv. injecteer 25 μL PBS in het geval van een tumor van 50 mm³).
7. Desinfecteer de intratumorale temperatuursonde met ethanol en breng deze voorzichtig in het midden van de tumormassa.
8. Breng een uniforme laag aloë vera-gel van ongeveer 5 mm dik aan op het tumoroppervlak om huidzweren te voorkomen en het risico op thermisch letsel tijdens de behandeling te minimaliseren.
9. Zorg ervoor dat de laser is afgesteld om direct boven het midden van de tumor uit te lijnen. Gebruik de opzoektabel voor bestralingsuitstraling (tabel 1) om de juiste laserhoogte te bepalen op basis van de vereiste laserstraaldiameter om het tumoroppervlak te bedekken. Optimaliseer de laserhoogte op basis van de diameter van de tumor om een consistente energieafgifte te garanderen.
   OPMERKING: In ons experiment vereiste een tumor met een diameter van 1,3 cm een laserhoogte van 1,5 cm).
10. Schakel de laser- en thermos-elektrische koelbron (TEC) in en sluit vervolgens het lasersysteem aan op de stroombron (aangepast volgens het protocol van de fabrikant). Zet de elektrische koelbron van de thermos aan; wacht tot de blauwe LED gaat branden en de temperatuur van de TEC-bron van de laser na 25 s stabiliseert op 30 °C.
11. Gebruik de opzoektabel voor bestralingssterkte (tabel 1) om een beoogde bestralingssterkte van 1 W/cm² ± 0.2 W/cm² te bereiken door de laserstroomuitgang aan te passen (draai de laserbronknop naar het gewenste stroominstelpunt).
    OPMERKING: In ons experiment resulteerden een laserhoogte van 1,5 cm, een straaldiameter van 1,3 cm en de laserstroom van 1.800 mA in een bestralingswaarde van 0,82 W/^cm2, die geoptimaliseerd was voor dit tumormodel.
    Zorg er vanaf dit punt voor dat alle personen in de laseroperatiekamer een gecertificeerde laserveiligheidsbril dragen voor de gebruikte golflengte van het licht.
12. Plaats de thermocamera naast het laserplatform, gericht op de muis, om de temperatuur van het huidoppervlak tijdens de laserprocedure te controleren.
13. Maak in de thermokoppelopnamesoftware een nieuw bestand en klik op de opnameknop . Zorg ervoor dat de grafiek van de interne tumortemperatuur versus tijd in realtime wordt weergegeven.
14. Draai de veiligheidssleutel om de uitvoer van de laserbron in te schakelen. Begin met lasertoediening door het voetpedaal naar beneden te duwen.
    OPMERKING: In dit protocol is een Raspberry Pi-controller de interne interface tussen het voetpedaal en de laserbron.
15. Controleer en zorg ervoor dat de computersoftware een verhoging van de tumortemperatuur detecteert zodra de GNR-geïnjecteerde tumor wordt blootgesteld aan de laserstraal.
    OPMERKING: De interne tumortemperatuur begint te stijgen bij de start van de laser, waarbij het ongeveer 15 s tot 2 minuten duurt voordat het beoogde hyperthermiebereik van 42 °C binnenkomt, afhankelijk van de grootte en het type tumormodel.
16. Houd de inwendige tumortemperatuur gedurende 5 minuten op hyperthermisch bereik (tussen 42 °C en 48 °C). Controleer voortdurend de inwendige tumortemperatuur en als deze in de buurt van 48 °C komt, haal dan de voet van het pedaal en laat de temperatuur weer dalen. Zoek naar deze temperatuurdaling in realtime in de grafiek van de temperatuur versus tijdweergave. Zodra de inwendige tumortemperatuur is gedaald tot ~43 °C, schakelt u de lasertoediening opnieuw in door het pedaal opnieuw in te drukken. Ga door met dit patroon van aan/uit laserpedaalcycli om de interne tumortemperatuur gedurende 5 minuten in het juiste hyperthermische bereik te houden en bewaak de grafiek van de temperatuur versus tijdweergave.
    1. Als de tumortemperatuur op enig moment tijdens de hyperthermieperiode van 5 minuten onder de 42 °C daalt, verleng dan de tijd van hyperthermie om de verloren tijd in te halen. Als de temperatuur bijvoorbeeld gedurende 20 s onder de 42 °C daalt, voegt u 20 s toe aan het einde van de eerste 5 minuten. Sommige tumoren die met GNR's worden geïnjecteerd, bereiken mogelijk geen 48 °C en laser aan/uit-cycli zijn niet nodig.
       OPMERKING: Bij controlemuizen die intratumoraal met PBS worden geïnjecteerd, zullen tumoren het hyperthermische bereik niet bereiken. Indien gewenst moet de aan/uit-cyclus van de laser voor controlemuizen hetzelfde patroon volgen als voor de met GNR behandelde groep, ondanks het verwachte gebrek aan hyperthermische respons.
17. Tijdens het onderhoud van tumorhyperthermie moet de temperatuur van het huidoppervlak voortdurend worden gecontroleerd om ervoor te zorgen dat deze onder de 50 °C blijft. Ongeacht de interne tumortemperatuur, als de temperatuur van het huidoppervlak 50 °C bereikt, schakelt u de laser uit om af te koelen. Als de interne temperatuur het gewenste hyperthermische bereik niet kan bereiken zonder dat de huidtemperatuur hoger is dan 50 °C, verminder dan het laservermogen en/of breng extra aloë vera aan op de plaats van de tumor om de warmte af te voeren. Laat na 5 minuten in het hyperthermische bereik het voetpedaal los om de lasertoediening te stoppen en laat de interne tumortemperatuur dalen tot ~37 °C en schakel de laserveiligheidssleutel uit.
    OPMERKING: Het is belangrijk om huidbeschadiging die tot tumorzweren kan leiden tot een minimum te beperken door de huidtemperatuur onder de 50 °C¹⁹ te houden.
18. Bewaak de interne tumortemperatuursonde, zodat de tumortemperatuur weer kan dalen tot ongeveer 37 °C. Verwijder voorzichtig de temperatuursonde van de tumor en veeg de resterende aloë vera-gel op het tumoroppervlak weg.
19. Haal de muis uit de neuskegelverdoving en controleer de opwinding van het dier voordat u hem terugplaatst in de kooi. Plaats de kooi gedeeltelijk op een warmtekussen van 37 °C tijdens de herstelperiode na de procedure, zodat de muizen zich naar behoefte tussen warmere en koelere gebieden kunnen verplaatsen om hun lichaamstemperatuur te reguleren. Houd elke muis in de gaten om ervoor te zorgen dat ze weer normaal gaan werken voordat ze worden teruggebracht naar hun woonfaciliteit.

Resultaten

Het doel van dit GNR-gemedieerde THT-protocol is om solide tumoren consistent en betrouwbaar te verhitten tot het gewenste milde hyperthermische bereik van 42-48 °C. De belangrijkste stappen van deze procedure worden beschreven in figuur 1. Het succes van dit protocol hangt af van het tot stand brengen en behouden van gecontroleerde en reproduceerbare milde hyperthermie binnen een bepaald solide tumormodel. De gebruikte GNR's werden gesynthetiseerd met behulp van een gepatenteerde CTAB-vrije methode, waarbij goudzout werd gereduceerd in een gepatenteerde oppervlakteactieve oplossing om staafvormige kristalgroei te bevorderen. Na de synthese werden de natieve oppervlakteactieve stoffen grotendeels vervangen door PEG met een laag moleculair gewicht om de biocompatibiliteit te verbeteren. De resulterende GNR's waren uniform van grootte (51,1 ± 10,8 nm bij 12,2 ± 1,9 nm), hadden een optimale excitatiegolflengte van 860 ± 10 nm en waren vrij van detecteerbare endotoxinen.

Om een goede opwarming van de tumor en een nauwkeurige temperatuurmeting te garanderen, moet een intratumorale temperatuursonde in het midden van de tumor worden ingebracht. Bovendien is het van cruciaal belang om de temperatuur van het huidoppervlak tijdens de procedure te bewaken met behulp van een warmtebeeldcamera. Het is mogelijk, vooral voor tumoren met een kleiner volume, dat intratumoraal geïnjecteerde GNR's kunnen diffunderen in de peritumorale en/of subcutane ruimte rond de tumor. Bij blootstelling aan NIR-licht kan dit leiden tot opwarming van de huid tot boven de fysiologische basisniveaus, en als de huid temperaturen bereikt boven milde hyperthermische niveaus (hoger dan 50 °C), kan dit leiden tot huidbeschadiging zoals korstvorming en/of ulceratie¹⁹. Het aanbrengen van een laag aloë vera-gel op het oppervlak van de tumor is een belangrijke voorzorgsmaatregel om de temperatuur van het huidoppervlak te helpen reguleren en thermische schade tijdens blootstelling aan NIR-laser te voorkomen. In ieder geval wordt aanbevolen om het behandelde gebied gedurende 48 uur na THT te controleren op tekenen van ulceratie. Figuur 2 toont een visuele weergave van de voorgestelde opstelling om het temperatuurbeheer van de tumor te optimaliseren, waarbij de locatie van de interne tumortemperatuursonde en de aloë vera-gellaag wordt weergegeven in relatie tot de NIR-lasersonde.

Het relatieve succes van dit experimentele protocol kan worden bepaald aan de hand van het observeren van de interne tumortemperatuur versus tijdgrafiek tijdens de laseroperatie. Voor muizen die intratumoraal met GNR's worden geïnjecteerd, wordt verwacht dat tumoren binnen 15 s tot 2 minuten opwarmen tot het milde hyperthermische bereik (42-48 °C). Zodra de interne tumortemperatuur het milde hyperthermische bereik is binnengegaan, wordt verwacht dat deze binnen het juiste bereik zal stabiliseren of een aan/uit-cyclus van lasertoediening vereist om ervoor te zorgen dat de interne tumortemperatuur niet boven de 48 °C stijgt (zoals weergegeven in figuur 3A). Succesvol onderhoud van milde hyperthermie gedurende 5 minuten wordt als een positief resultaat beschouwd. Voor muizen die intratumoraal met PBS worden geïnjecteerd, wordt niet verwacht dat tumoren in het hyperthermische bereik terechtkomen. Blootstelling aan NIR-licht met een golflengte van 860 nm alleen is niet voldoende om weefselverwarming in het milde hyperthermische bereik te veroorzaken, en controletumoren zullen naar verwachting stabiliseren rond 39-40 °C. Figuur 3B toont een interne tumortemperatuur versus tijdgrafiek tussen GNR en controlemuizen (PBS-geïnjecteerde) muizen gedurende de 5 minuten durende procedure. Als een met GNR geïnjecteerde tumor niet in staat is om het hyperthermische bereik te bereiken bij blootstelling aan NIR-licht of niet gedurende 5 minuten in het juiste hyperthermische bereik kan worden gehouden, wordt dit als een negatief resultaat beschouwd.

Aanvullende downstream-analyse om het succes van dit GNR-gemedieerde THT-protocol te bepalen, omvat het meten van veranderingen in het tumorvolume na de procedure. Succesvol uitgevoerde GNR-gemedieerde THT veroorzaakt gerichte tumorceldood en activering van immuunresponsen tegen kanker, wat leidt tot tumorregressie en bijbehorende vermindering van het tumorvolume¹³. Figuur 4 toont veranderingen in tumorvolume na GNR-gemedieerde THT voor twee subcutane flankkankermodellen (B16-melanoom en CT26-heterotopisch colorectale kankermodel) en één muizenkankermodel met borstvetkussen (4T1-borstkanker). In elk model is een significante vermindering van het tumorvolume in vergelijking met controles duidelijk 48-72 uur na GNR-gemedieerde THT-procedure. De tijdlijn en omvang van de vermindering van het tumorvolume na de procedure zal naar verwachting variëren, afhankelijk van de muizenstam en het kankermodel. Naast tumorreductie zagen we een krachtige aangeboren immuunrespons binnen 48 uur van GNR-gemedieerde THT, gekenmerkt door verhoogde expressie van genen die betrokken zijn bij de STING-cGAS-route en de opregulatie en activering van dendritische cellen, macrofagen en NK-cellen in zowel de B16F10- als de^{4T1-modellen 13}. Met name in een bilateraal 4T1-tumormodel induceerde GNR-enabled THT een systemische immuunrespons, zoals blijkt uit verhoogde infiltratie van CD8⁺ T-cellen in onbehandelde contralaterale tumoren¹³. Deze bevindingen ondersteunen verder het potentieel van deze benadering voor het opwekken van zowel directe cytotoxische als bredere immunomodulerende antikankereffecten.

Tabel 1: Opzoektabel voor bestraling. Tabel met bestralingswaarden (W/cm²) voor verschillende laserstroominstellingen (mA) en werkafstanden (cm). De tafel wordt gebruikt om de juiste laserhoogte te bepalen op basis van de vereiste straaldiameter om het tumoroppervlak te bedekken en om een beoogde bestralingssterkte van 1 W/cm² ± 0,2 W/cm² te bereiken. Groen gemarkeerde waarden geven optimale instralingsniveaus aan in de buurt van 1 W/^cm2. Deze bestralingstabel is specifiek voor de LDX-laser en is geleverd door de fabrikant. Klik hier om deze tabel te downloaden.

Figuur 1: Grafisch schema van GNR-gemedieerde THT-procedure. Methodologie van goud-nanostaaf gemedieerde gerichte hyperthermische therapie voor subcutane flanktumoren in een muizenmodel. Na het opzetten van een palpabele tumor (ongeveer 50 mm³) en anesthesie bij muizen, (1) injecteer GNR's intratumoraal in een concentratie van 1 μg/mm³, (2) breng een intratumorale temperatuursonde in het midden van de tumormassa, (3) breng een ~5 mm laag aloë vera-gel aan op het tumoroppervlak, (4) begin met NIR-lasertoediening en (5) houd de interne tumortemperatuur gedurende 5 minuten in een mild hyperthermisch bereik (42 °C-48 °C). Afkortingen: GNR = gouden nanostaaf; THT = gerichte hyperthermische therapie; NIR = nabij-infrarood. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 2: Visuele weergave van de experimentele opstelling. Een BALB/c-muis met een heterotope colorectale tumor met een centraal ingebrachte intratumorale temperatuursonde en een topische aloë vera-gellaag die direct onder blootstelling aan nabij-infrarode laserstraal wordt aangebracht. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 3: Real-time interne temperatuurgrafieken. Representatief intern tumortemperatuurprofiel(en) in de loop van de tijd (in ms) geregistreerd door de interne temperatuursonde tijdens blootstelling van de tumor aan de NIR-laser. (A) Aan/uit NIR-lasercycluspatroon in een GNR-geïnjecteerde muis die nodig is om de interne tumortemperatuur gedurende 5 minuten in een mild hyperthermisch bereik (42 °C-48 °C) te houden. Dit benadrukt het belang van nauwgezette monitoring van de interne tumortemperatuur en cycli van lasertoediening om het onderkoelingsbereik tijdens de procedure te behouden. (B) Gemiddeld verschil in interne tumortemperatuur tussen GNR-geïnjecteerde (n = 15) en controlemuizen (PBS-geïnjecteerd) (n = 8) gedurende 5 minuten NIR-laserblootstelling. Tumoren van PBS-geïnjecteerde muizen worden niet verhit tot een mild onderkoeld bereik en plateau rond 39-40 °C, ondanks dezelfde lange blootstelling aan NIR-laser als de GNR-geïnjecteerde groep, waarvan de tumoren hyperthermische temperaturen van 42-48 °C bereiken. Afkortingen: GNR = gouden nanostaaf; NIR = nabij-infrarood. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 4: Grafieken van het tumorvolume na GNR-gemedieerde THT. GNR-gemedieerde THT induceert tumorvolumekrimp in meerdere muizenkankermodellen binnen 48-72 uur na de behandeling. (A) Tumorvolumemetingen in het 4T1 (borstkanker) model na GNR-gemedieerde THT (n= 24 PBS, n = 28 THT). (B) Tumorvolumemetingen in het B16-F10 (melanoom) model na GNR-gemedieerde THT (n = 19 PBS, n = 23 THT). (C) Tumorvolumemetingen in CT26 (colorectale kanker) model na GNR-gemedieerde THT (n = 9 PBS, n = 9 THT). Een vermindering of vertraging van de groei van het tumorvolume binnen 48-72 uur na de behandeling is een indicatie van een positief resultaat. Tumorvolumegegevens voor het CT26-model op het '24 uur pre'-tijdstip worden niet samengevoegd - de waarden zijn vergelijkbaar en overlappen elkaar. Foutbalken staan voor SEM. * p < 0,05. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Discussie

Kritieke stappen binnen het protocol
Het ontwerp en de implementatie van deze GNR-gemedieerde THT-techniek biedt de mogelijkheid om gerichte, nauwkeurige, weinig resource-intensieve en reproduceerbare verhitting van solide tumoren in vivo uit te voeren. Een belangrijk voordeel van dit systeem ligt in de ruimtelijke precisie en thermische controle, waardoor een plaatselijke behandeling mogelijk is zonder het omliggende weefsel te beschadigen. Een cruciale stap voor een succesvolle fotothermische conversie is het waarborgen van compatibiliteit tussen de gebruikte GNR's en de NIR-lichtbron. In deze studie hebben we GNR's gebruikt die zijn geoptimaliseerd voor absorptie bij 860 nm. Op deze golflengte dringt licht effectief door in het weefsel en wordt selectief warmte gegenereerd in GNR-bevattende tumoren, terwijl het omringende gezonde weefsel in de buurt van fysiologische temperatuur²⁰ blijft. Bovendien is bij het uitvoeren van dit protocol nauwkeurige real-time monitoring van de interne tumortemperatuur cruciaal om te bevestigen dat een mild hyperthermisch bereik wordt bereikt en dat de behandeling consistent wordt toegediend. De plaatsing van een intratumortemperatuursonde, zoals weergegeven in figuur 2, maakt real-time monitoring van de thermische dosis van de tumor mogelijk, zoals te zien is in figuur 3B.

Problemen met de techniek oplossen
Afhankelijk van het in vivo model en het tumortype kunnen kleine aanpassingen aan het protocol nodig zijn om de resultaten te optimaliseren. In de modellen van muizenmelanoom, colorectale kanker en borstkanker waarnaar in figuur 4 wordt verwezen, hebben we bijvoorbeeld de GNR-tot-tumorvolumeconcentratie geoptimaliseerd op 1 μg/mm³. We hebben ook de efficiëntie van dit protocol geoptimaliseerd door NIR-laserblootstelling direct na GNR-injectie uit te voeren, aangezien er geen verschillen in behandelingswerkzaamheid werden waargenomen bij het vergelijken van deze injectie en behandelingstiming met langere intervallen van 0,5, 1, 4, 18 of 24 uur. Voor tumormodellen die afwijken van onze model(len) in termen van tumorpathofysiologie of lichaamslokalisatie, kan een andere GNR-concentratie, geïnjecteerd op een ander tijdstip, optimaal zijn om hyperthermisch bereik te bereiken en/of te blijven. Na deze procedure moeten dagelijkse metingen van het tumorvolume worden uitgevoerd om veranderingen in het tumorvolume vast te leggen. Tumorregressie binnen 2-3 dagen is een positieve indicator voor het succes van de behandeling.

Vanwege de aard van het laserprotocol zijn oppervlakkige brandwonden en zweren een potentiële risicofactor, vooral bij een gepigmenteerde of gevoelige huid. Aanpassingen aan de laserstroomoutput kunnen nodig zijn om een passend evenwicht te behouden tussen het huidoppervlak en de interne tumortemperatuur, afhankelijk van het gebruikte in vivo model. We hebben bijvoorbeeld ontdekt dat vanwege verschillen in watergehalte en melaninepigment in de huid²¹, C57Bl/6-muizen NIR-lasertoediening met een lagere stroom nodig hebben in vergelijking met BALB/c-muizen, om de huidtemperatuur onder de 50°C te houden. Zorg er bij het wijzigen van de laserstroomoutput voor dat de laserhoogte dienovereenkomstig wordt aangepast om een beoogde bestralingssterkte van 1 W/cm² ± 0.2 W/cm² te behouden, terwijl het grootste deel van het tumoroppervlak nog steeds wordt bedekt met de diameter van de laserstraal. Als alternatief kan het aanbrengen van extra aloë vera-gel helpen de huidtemperatuur tijdens de procedure te verlagen zonder de interne tumortemperatuur drastisch te beïnvloeden. Het handhaven van de juiste temperatuur van het huidoppervlak door middel van noodzakelijke aanpassingen is belangrijk om het risico op ulceratie te minimaliseren, wat is waargenomen als een mogelijke bijwerking van deze behandeling. Zorg er bij het aanbrengen van wijzigingen in de aloë vera-gellaag voor dat de toediening van de NIR-laserstraal tijdelijk wordt stopgezet. Zorg er in de dagen na het laserprotocol voor dat de muizen nauwlettend worden gecontroleerd op mogelijke brandwonden en/of zweren.

Beperkingen van GNR-gemedieerde THT
Een belangrijk veiligheidsprobleem dat moet worden aangepakt bij het uitvoeren van deze procedure, is het gebruik van gecertificeerde laserveiligheidsbrillen voor de golflengte van het licht dat tijdens de laserwerking wordt gebruikt. Het lasersysteem moet ingebouwde veiligheidsvoorzieningen bevatten, zoals een vergrendeling met sleutel, om onbedoelde activering te voorkomen. Er zijn echter aanvullende persoonlijke beschermingsmiddelen nodig - met name geschikte laserveiligheidsbrillen - om te beschermen tegen mogelijke blootstelling aan gereflecteerde of verstrooide stralen. Het oog is het meest kwetsbaar voor letsel door een laserstraal, waarbij brandwonden op het netvlies een groot probleem zijn bij NIR-lasers²². Ten slotte moet al het personeel dat de laser bedient, de juiste opleiding hebben genoten.

Dit protocol koos voor de intratumorale injectie van GNR's in plaats van een systemische injectie om de systeemtoxiciteit te minimaliseren, de distributie van nanodeeltjes in organen buiten het doelwit, zoals de lever, milt en nieren, te beperken en de nauwkeurigheid, werkzaamheid en het veiligheidsprofiel van hyperthermische behandeling te verbeteren. Omdat dit protocol echter intratumorale injecties van GNR's vereist, kan het beperkt zijn in zijn vermogen om hyperthermie te induceren in bepaalde tumormodellen. Tot nu toe hebben we de effectiviteit van deze methode bewezen bij onderhuidse en borstspiertumoren, die zich beide dicht bij het huidoppervlak bevinden en gemakkelijk toegankelijk zijn in termen van GNR-injectie en blootstelling aan NIR-licht. Logistieke problemen kunnen zich voordoen bij het aanpakken van tumoren die zich in lichaamsholten bevinden, zoals het peritoneum, of bij het aanpakken van uitgezaaide plaatsen van een primaire tumor. Een mogelijke wijziging van dit protocol zou systemische GNR-injectie kunnen inhouden, op voorwaarde dat de nanodeeltjes worden gemanipuleerd of gemodificeerd om een efficiënte accumulatie op tumorplaatsen te garanderen voorafgaand aan NIR-blootstelling²³. Bovendien is het mogelijk dat intratumorale GNR-injectie kan leiden tot een ongelijke verdeling van nanodeeltjes in de tumor, waardoor de elasticiteit van de verwarming wordt beïnvloed. Er wordt echter niet verwacht dat niet-uniforme tumorverwarming een grote invloed zal hebben op de mate van effectiviteit van de behandeling, aangezien het primaire resultaat van dit GNR-gemedieerde THT-protocol de inductie van ICD is om de immuniteit tegen kanker te activeren. Ten slotte is de uitlezing van de intratumorale temperatuur afhankelijk van de locatie van de temperatuursonde in de tumor. Het midden van de tumor is de meest optimale locatie voor de sonde om de algehele gemiddelde tumortemperatuur nauwkeurig weer te geven. Als het echter moeilijk is om het inbrengen van een centrale sonde te garanderen en/of te bevestigen vanwege de grootte en/of vorm van de tumor, kan het nodig zijn om te registreren met behulp van twee of meer temperatuursondes op verschillende locaties.

Betekenis ten opzichte van bestaande methoden
Dit manuscript biedt een uitgebreid, geoptimaliseerd en reproduceerbaar protocol voor GNR-gemedieerde THT in solide en oppervlakkig toegankelijke tumoren. In vergelijking met andere methoden om hyperthermie op te wekken, biedt deze techniek duidelijke voordelen, namelijk dat het weinig middelen verbruikt, ruimtelijk nauwkeurig is en gepaard gaat met minimale systemische toxiciteit. Hoewel het gebruik van GNR's voor fotothermische therapie goed gedocumenteerd is, blijft er een aanzienlijke variabiliteit in de literatuur in de manier waarop deze protocollen worden geïmplementeerd. Belangrijke procedurele elementen zoals de duur van de NIR-bestraling, de keuze van thermische bewakingsinstrumenten (thermokoppelsondes of thermische camera), de bereiding van de GNR-oplossing en de GNR-injectiemethoden variëren vaak tussen onderzoeken.

Andere methoden vereisten bijvoorbeeld een langere (20 min)²⁴ of meerdere doses (4 x 15 min)²⁵ NIR-blootstelling om vergelijkbare resultaten te bereiken als de onze. Bovendien gebruiken de meeste protocollen thermokoppelsondes of thermische camera's, maar combineren ze zelden beide tools^26,27. Bovendien worden GNR-oplossingen vaak bereid met CTAB 28,29,30, en hun toedieningsmethode varieert tussen systemische injecties ^24,30 en intratumorale injecties³¹, wat van invloed kan zijn op hun verspreiding/locatie binnen de TME. Als zodanig moet er nog een uitgebreide en aanpasbare methode voor GNR-gemedieerde THT worden ontwikkeld die de huidige protocollen optimaliseert en verbetert.

Ons protocol pakt deze tekortkomingen aan door de meest effectieve en reproduceerbare componenten uit de literatuur te integreren in één gestandaardiseerde aanpak. Concreet gebruiken we dubbele thermische monitoring (zowel thermokoppel als thermische camera) om een nauwkeurige en veilige warmteafgifte te garanderen; we maken gebruik van intra-tumorale injectie van CTAB-vrije GNR's om tumorlokalisatie te maximaliseren en toxiciteit te minimaliseren; En we gebruiken het gebruik van aloë vera-gel om te beschermen tegen oppervlakkige brandwonden. Bovendien zijn de GNR's die in dit protocol worden gebruikt, geoptimaliseerd voor efficiënte fotothermische conversie bij 860 nm NIR, waardoor binnen enkele seconden snel milde hyperthermische temperaturen kunnen worden bereikt. Zodra dit temperatuurbereik is bereikt, kan het stabiel worden gehandhaafd gedurende de behandelingsduur van 5 minuten, waarvan we hebben vastgesteld dat deze voldoende is voor het induceren van immunogene celdood en immuunactivering. De NIR-golflengte van 860 nm zelf zorgt ook voor een gunstige balans tussen weefselpenetratiediepte en veiligheid, waardoor het therapeutische venster van deze methode verder wordt verbeterd.

Samenvattend biedt ons protocol een geconsolideerd, gevalideerd en biologisch effectief alternatief voor bestaande GNR-gemedieerde hyperthermiebenaderingen, en vult het een kritieke leemte in het veld door een volledig gedetailleerde en aanpasbare methode te bieden die geschikt is voor preklinisch kankeronderzoek en de ontwikkeling van combinatietherapie.

Toekomstige toepassingen van de techniek
Ten slotte, hoewel dit protocol gemakkelijk kan worden gecombineerd met verschillende kankerbehandelingen, is het bijzonder geschikt voor het verbeteren van de effectiviteit van immunotherapieën, gezien het inherente vermogen van THT om de immuniteit tegen kanker te stimuleren. Door immunogene celdood te induceren, de afgifte van tumorspecifieke antigenen te bevorderen en het aantal aangeboren immuuncellen dat binnen 48 uur na de behandeling naar de TME wordt gerekruteerd, te verhogen, helpt GNR-gemedieerde THT immunologisch koude tumoren 'opnieuw gevoelig te maken' voor detectie en aanval door het immuunsysteem¹³. Als gevolg hiervan kan deze techniek worden gebruikt om de effectiviteit van immunotherapieën te verbeteren bij de behandeling van kankers die mogelijk eerder resistentie hebben ontwikkeld, wat een mogelijke strategie biedt voor het overwinnen van barrières voor de behandeling van kanker en ziekteprogressie¹³.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
0.25% Trypsin	Thermo Fisher Scientific	25200-056
10 mL Stripette	Fisher Scientific	7200574
15 mL Falcon tube	Corning	352095
1 mL syringe	BD Biosciences	3331431
28 G needle	BD Biosciences	1298811
4T1 borstkanker cel lijn	American Type Culture Collection	CRL-2539
5 mL Stripette	Fisher Scientific	7200573
50 mL Falcon tube	Fisher Scientific	14-432-22
70% Ethanol	Commercial Alcohols	36195
Aloe vera gel	Life Brand	57800985495
B16-F10 melanoom cel lijn	American Type Culture Collection	CRL-6475
Biorender	BioRender	N/A
Bisafety cabinet	Nuaire	N/A
Klasse 4 laser veiligheidsbril	laservision	F22.P5P18.5000	We hebben een P22 frame met een P5P18 filter gebruikt
CO2 incubator (37 °C, 5% CO2)	Nuaire	N/A
Corning 1-200 µL Universal Fit Racked Pipet Tips	Corning	4865
Corning Gefilterde Pipet Tips, 30 µL	Fisher Scientific	07-200-265
CT26 muis colorectal cel lijn	American Type Culture Collection	CRL-2638
DPBS	Thermo Fisher Scientific	10010-049
Eppendorf tubes	Thermo Fisher Scientific	3451
Vrouwelijke BALB/c muizen	Charles River Laboratories (Montreal, Canada)	028
Vrouwelijke C57Bl/6	Charles River Laboratories (Montreal, Canada)	027
Fetaal bovien serum	Thermo Fisher scientific invitrogen	12483020
GNR	Sona Nanotech Inc	N/A
Intratomor temperatuur sonde	OMEGA	HYP1-30-1/2-T-G-60-SMP-M	Thermokoppel sonde Model HYP-1
IsoTip 1000 µL Universele Gefilterde Pipet Tips	Corning	4809
LDX Laser (Model: LDX- 3520-860-HHLFC)	Minnetronix	N/A	Laser stroom met set punt maximum bij 4600 mA
Optixcare Oog smering	Aventix	N/A
Penicilline-Streptomycine	Thermo Fisher Scientific	15140148
Prism 10.6.0	Graphpad	N/A
RPMI 1640 Medium	Thermo Fisher Scientific	11875119
TC-08 Thermokoppel Data Logger Software	Pico Technology	PicoLog V5.25.3
Thermische camera	HIKmicro	EA-1086922
Weefselkweek schotel 100 x 20 mm	Fisher Scientific	877222
Trypan Blauw Oplossing 0.4%	Thermo Fisher Scientific	15250061
Tumor meetkaliber	Giles scientificMitutoyo corporation	500-321