Methodenartikel

Vooruitgang in de metabole profilering van driedimensionale hersentumorsferoïden voor screening op geneesmiddelen

759 weergaven

⸱

DOI:

10.3791/68833

⸱

5 september 2025

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Institute of Medical Innovation and Research, Peking University Third Hospital, 2Cancer Center of Peking University Third Hospital, 3Biobank, Peking University Third Hospital

* These authors contributed equally

In dit artikel

Samenvatting

Hier zetten we een metabool profileringsplatform op dat driedimensionale (3D) glioomsferoïden integreert met op beeldvorming gebaseerde normalisatie via extracellulaire fluxanalyse. Deze benadering maakt een nauwkeurigere beoordeling mogelijk van tumormetabole reacties op medicamenteuze behandelingen en biedt inzicht in mogelijke resistentiemechanismen.

Samenvatting

Hersentumoren, vooral gliomen, zijn moeilijk te behandelen vanwege hun agressieve aard, complexe tumormicro-omgeving en resistentie tegen conventionele therapieën. Traditionele tweedimensionale (2D) celculturen slagen er vaak niet in om de ware tumoromgeving te repliceren, wat leidt tot onnauwkeurige voorspellingen van de werkzaamheid van geneesmiddelen. Extracellulaire fluxanalysetechnologie, die doorgaans wordt gebruikt voor real-time metabole analyse in 2D-culturen, meet belangrijke metabole parameters, zoals de extracellulaire verzuringssnelheid (ECAR) en zuurstofverbruikssnelheid (OCR), en geeft inzicht in het cellulaire metabolisme. Het gebruik van 3D-modellen betekent een aanzienlijke vooruitgang, omdat ze de in vivo tumoromgeving nauwkeuriger nabootsen. De extracellulaire fluxanalysator werd aangepast aan driedimensionale (3D) glioomcelmodellen, waardoor de analyse van kritieke metabole routes, waaronder glycolyse en oxidatieve fosforylering, in een meer fysiologisch relevante context mogelijk werd.

U87-cellen werden met de juiste dichtheden gezaaid in een plaat met 96 putjes met weinig hechting en gedurende 5 dagen gekweekt. Op dag 5 werd 3D-sferoïde vorming waargenomen via beeldvorming met hoge inhoud. De succesvol gevormde sferoïden werden vervolgens overgebracht naar een metabole testplaat bedekt met poly-L-lysine voor metabole analyse. Om de nauwkeurigheid van deze metingen te verbeteren, beoordelen beeldvormingssystemen met een hoge inhoud de 3D-celgrootte, waardoor een nauwkeurige normalisatie van extracellulaire fluxgegevens mogelijk is en metabole variaties als gevolg van verschillen in celgrootte worden geminimaliseerd. Deze geïntegreerde aanpak biedt een betrouwbaardere analyse van de metabole responsen van glioomcellen op medicamenteuze behandelingen, waardoor mogelijke mechanismen van resistentie tegen geneesmiddelen worden onthuld. Uiteindelijk biedt deze methodologie waardevolle inzichten in de metabole dynamiek van gliomen en ondersteunt het de ontwikkeling van nieuwe, klinisch relevante therapeutische strategieën.

Inleiding

Gliomen, een veel voorkomende en agressieve vorm van hersentumor, vormen aanzienlijke klinische uitdagingen vanwege hun snelle progressie, zeer heterogene tumormicro-omgeving en duidelijke resistentie tegen conventionele therapieën1. Deze complexiteiten vereisen meer fysiologisch relevante experimentele modellen om de nauwkeurigheid van therapeutische evaluaties te verbeteren. Traditionele tweedimensionale (2D) celkweeksystemen slagen er niet in om de in vivo tumorarchitectuur en cel-celinteracties2 samen te vatten, wat vaak leidt tot misleidende conclusies met betrekking tot de werkzaamheid van geneesmiddelen en tumorbiologie3.

Om deze beperkingen aan te pakken, zijn driedimensionale (3D) tumormodellen naar voren gekomen als een superieur alternatief, dat een grotere biologische relevantie biedt door de structurele en functionele kenmerken van tumoren in vivo na te bootsen 4,5. Tegelijkertijd wordt metabole herprogrammering steeds meer erkend als een kenmerk van glioomprogressie en behandelingsresistentie 6,7,8. Extracellulaire fluxanalyse is een algemeen aanvaarde techniek geworden voor het in realtime meten van belangrijke metabole parameters, zoals de extracellulaire verzuringssnelheid (ECAR, het meten van protonefflux voornamelijk door de productie van glycolytisch lactaat) en het zuurstofverbruik (OCR, kwantificering van mitochondriaal zuurstofgebruik bij oxidatieve fosforylering), wat kritische inzichten biedt in glycolytische en oxidatieve fosforyleringsroutes 9,10,11.

In deze studie werd extracellulaire fluxanalyse aangepast om 3D-glioomsferoïden te analyseren, waardoor metabole routes kunnen worden onderzocht in een context die sterk lijkt op in vivo tumoraandoeningen. U87-glioomcellen werden gezaaid met een dichtheid van 1.500 cellen per putje in transparante, ultra-lage gehechte platen met 96 putjes met ronde bodem en gedurende 5 dagen gekweekt bij 37 °C met 5% CO2 om de vorming van sferoïden te vergemakkelijken. Beeldvorming met hoge inhoud werd gebruikt om de sferoïde morfologie te bevestigen en de celgrootte te beoordelen. Voorafgaand aan de metabole analyse werden dichte en cirkelvormige 3D-celsferoïden met een diameter van ongeveer 220 μm overgebracht naar testplaten die vooraf waren gecoat met poly-L-lysine om hechting en meetstabiliteit te garanderen. Belangrijk is dat normalisatie van metabole gegevens op basis van sferoïde grootte werd uitgevoerd via geïntegreerde beeldvorming met hoge inhoud, waardoor de variabiliteit werd verminderd en de betrouwbaarheid van de gegevens werd verbeterd.

Dit geïntegreerde platform, dat 3D-cultuur, extracellulaire fluxanalysetechnologie en normalisatie op basis van beeldvorming combineert, maakt een nauwkeurigere beoordeling van glioommetabole reacties op therapeutische interventies mogelijk. Deze studie biedt een robuust kader voor het bestuderen van de metabole onderbouwing van geneesmiddelresistentie en draagt bij aan de ontwikkeling van effectievere, klinisch vertaalbare behandelingsstrategieën voor gliomen.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

OPMERKING: De volledige specificaties van alle reagentia en verbruiksartikelen worden beschreven in de materiaaltabel.

1. 2D celcultuur

  1. Bewaar U87-cellen in minimaal essentieel medium (MEM) aangevuld met 10% (v/v) foetaal runderserum (FBS) onder steriele omstandigheden. Voer standaard passageprocedures uit zodra de cellen 80% samenvloeiing hebben bereikt.
    OPMERKING: Houd tijdens het kweekproces de celstatus nauwlettend in de gaten en sluit cellen die abnormale groei of morfologische veranderingen vertonen uit van latere experimenten.
  2. Zaai U87-cellen in celkweekschaaltjes van 10 cm en incubeer in een steriele celkweekincubator bij 37 °C met 5% (v/v) CO2 en 90-95% relatieve vochtigheid.
    OPMERKING: Het medium moet regelmatig worden vervangen om optimale groeiomstandigheden te behouden.

2. 3D vorming van sferoïden van cellen

  1. Experimentele voorbereiding
    1. Bekijk de volledige workflow in afbeelding 1 voordat u met experimentele procedures begint.
      LET OP: Houd u tijdens het experiment strikt aan aseptische technieken om de gezondheid van de cellen te waarborgen en besmetting te voorkomen.
  2. Celdissociatie en telling
    1. Verwijder het gebruikte medium uit de celkweekschaal en was de U87-cellen driemaal met 9 ml fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS) (3 ml per wasbeurt). Gooi gebruikte reagentia weg in een bleekoplossing van 20-25% (v/v) om alle bioactieve materialen te inactiveren.
    2. Voeg 1 ml trypsineoplossing toe aan de schaal en incubeer gedurende 2-3 minuten bij 37 °C. Neutraliseer trypsine met 2 ml DMEM met 10% FBS voorverwarmd tot 37 °C zodra alle cellen onder microscopische observatie zijn losgemaakt.
    3. Breng de celsuspensie over in een centrifugebuis van 15 ml en centrifugeer gedurende 3 minuten bij 200 × g . Gooi het supernatant weg en suspendeer de celpellet in 1 ml DMEM aangevuld met 10% FBS. Pipetteer de cellen voorzichtig om een gelijkmatige celsuspensie te garanderen. Tel vervolgens via een hemocytometer of geautomatiseerde cellenteller en registreer het initiële aantal cellen.
      OPMERKING: Behandel de cellen voorzichtig tijdens het wassen en het toevoegen van media om mechanische schade te voorkomen. De pipetteerkracht kan worden geregeld om belvorming te voorkomen, wat de levensvatbaarheid van de cellen en de nauwkeurigheid van het tellen kan beïnvloeden.
  3. Verdunning van de celsuspensie
    1. Verwarm het ongebruikte medium voor op 37 °C. Houd de celsuspensies gedurende 30 minuten op kamertemperatuur (RT; 25 ± 2 °C).
    2. Verdun op basis van het initiële celgetal de celsuspensie met DMEM met 10% FBS tot een eindvolume van 20 ml, zodat u ongeveer 200.000 cellen krijgt.
      OPMERKING: Vóór de laatste verdunning pipetteer u voorzichtig de celsuspensie om bezinking te voorkomen. Het ongebruikte medium werd op 37 °C gehouden en de celsuspensies werden bij RT geïncubeerd. Als 96 putjes met 1.500 cellen per put werden gezaaid, werd een totaal volume van 22 ml voorbereid om het teveel te verklaren. De verdunde celsuspensie werd overgebracht naar een steriele centrifugebuis van 50 ml en grondig gemengd.
  4. Celzaaien in ultra-lage bevestiging 96-well platen
    1. Meng de uiteindelijke celsuspensie grondig via een pipet van 200 μl. Voeg langzaam 200 μL van de suspensie (1.500 cellen/putje) toe aan elk putje van een transparante, ultra-lage bevestiging met ronde bodem en 96-putje langs de rand.
      OPMERKING: Overweeg voor efficiëntie het gebruik van een meerkanaals pipet.
    2. Gooi de resterende suspensie weg nadat alle putjes zijn gevuld om besmetting te voorkomen.
  5. Centrifugeren
    1. Sluit de plaat goed af met parafilm om lekkage tijdens het centrifugeren te voorkomen. Centrifugeer het mengsel gedurende 2 minuten bij 200 × g om de cellen op de bodem van elk putje te pelleteren.
    2. Haal de plaat uit de centrifuge, verwijder voorzichtig de parafilm en plaats de plaat in een broedmachine van 37 °C, 5% CO2 .

3. Poly-D-Lysine-coating van de metabole testplaten

OPMERKING: De microplaat van de metabole test is een gespecialiseerde microplaat die is ontworpen voor de adhesie van de celsferoïde tijdens extracellulaire fluxanalyse.

  1. Bereid een coatingoplossing voor door 5 mg poly-D-lysine op te lossen in 50 ml steriel water. Meng.
  2. Voeg 30 μl van de coatingoplossing toe aan elk putje van de metabole testplaat. Zorg ervoor dat er geen luchtbellen ontstaan door de overtollige oplossing voorzichtig te schudden of op te zuigen.
  3. Incubeer de plaat en dek deze 20 minuten af bij RT. Zuig de coatingoplossing op en was de putjes twee keer met 200 μL steriel water.
  4. Laat de plaat minimaal 30 minuten aan de lucht drogen en verwarm vervolgens 30 minuten bij 37 °C zonder CO2 om de coating te stabiliseren.
  5. Voeg 175 μL voorverwarmd medium toe aan elk putje en houd de plaat op 37 °C in een CO2-vrije incubator totdat deze klaar is voor celsferoïdeoverdracht.

4. Monitoring van de sferoïde groei

  1. Breng de sferoïde platen na 5 dagen kweek over naar een beeldvormingssysteem met een hoog gehalte.
  2. Configuratie beeldvormingsparameters: Stel de temperatuur in op 37 °C en de CO2 op 5% en pas het plaattype, de kanalen en het focusbereik aan.
  3. Verkrijg sferoïde beelden via een confocale microscoop met 10x objectieven en beeldvormingssoftware.
  4. Identificeer putten die intacte sferoïden bevatten (bijv. Figuur 2A-C) en noteer hun posities voor overdracht. Sluit putten met onregelmatige sferoïden uit (bijv. Figuur 2D)."

5. Sferoïde behandeling

OPMERKING: Medicamenteuze behandeling werd uitgevoerd op volwassen 3D-sferoïden om metabole reacties te beoordelen.

  1. Sferoïde groepsopdracht
    1. Wijs intacte sferoïden toe aan twee groepen:
      Controlegroep: 6 repliceerputten
      Behandelingsgroep: 6 replicate putjes (met fenofibraat behandeld)
  2. Bereiding van de medicijnoplossing
    1. Bereid de fenofibraatwerkoplossing in vers, voorverwarmd medium in de optimale concentratie (bijv. 100 μM).
      OPMERKING: Behandelingsgroepen werden gereconstitueerd in 100% DMSO om voorraadoplossingen te creëren, die vervolgens werden verdund in vers voorverwarmd medium. De controlegroepen kregen dezelfde eindconcentratie DMSO (0,1% v/v) toegediend als aanwezig was in de met geneesmiddelen behandelde monsters. De uiteindelijke concentratie werd bepaald aan de hand van dosis-responstesten.
  3. Medium vervanging
    1. Zuig 100 μL medium uit elke put langzaam langs de wand.
      NOTITIE: Vermijd contact met de bodem van de put om sferoïde verstoring te voorkomen.
    2. Voeg 100 μl vers medium toe aan de controleputjes.
    3. Voeg 100 μL fenofibraat werkoplossing toe aan de behandelingsputjes.
  4. Incubatie na de behandeling
    1. Breng de plaat voorzichtig terug naar 37 °C in een 5% CO2 -incubator. Cultuur voor 72 uur.
  5. Morfologische beoordeling
    1. Beoordeel de integriteit van de sferoïden na de beeldvormingsprocedure in stap 4.

6. Overdracht van celsferoïden

  1. Verwijder de sferoïde-bevattende plaat met lage bevestiging voorzichtig uit het beeldvormingssysteem en plaats deze op een steriel oppervlak in een bioveiligheidskast. Plaats de met poly-L-lysine beklede testplaat naast elkaar voor overdracht.
  2. Knip de punt van een pipet van 20 μl af om de sferoïden van de cellen voorzichtig op te zuigen zonder beschadiging.
  3. Zuig elke intacte sferoïde voorzichtig op van de bodem van de put en breng deze over naar de overeenkomstige put van de celplaat, zodat deze 20 s kan bezinken. Bevestig de hechting door de afwezigheid van zwevende fragmenten onder 10× microscopie.
  4. Herhaal dit voor alle sferoïden en controleer de overdrachtsefficiëntie via het beeldvormingssysteem dat in stap 4 wordt beschreven.

7. Metabole test

  1. Monster ontgassen
    1. Plaats de met geneesmiddelen behandelde sferoïde testplaat in een voorgebalanceerde hydratatiekamer van 37 °C zonder CO2 .
      OPMERKING: Er werd gedurende 1 uur continu ontgassen uitgevoerd met strikte omgevingscontrole om de nauwkeurigheid van de metabolische meting te garanderen.
  2. Preparaat van reagentia en toediening van geneesmiddelen
    1. Bereid het reagens parallel voor en laad het medicijn tijdens de ontgassingsperiode van 1 uur.
      OPMERKING: Het primaire doel van dit experiment is het beoordelen van mitochondriale stress; Alle procedures moeten nauwgezet op dit doel zijn afgestemd. Specifieke protocollen moeten worden gevolgd voor verschillende experimentele typen om de nauwkeurigheid en betrouwbaarheid van de gegevens te garanderen.
    2. Geneesmiddelbereiding: Gebruik de volgende verbindingen:
      Oligomycine (mitochondriaal complex V-remmer)
      Carbonylcyanide-4 (trifluormethoxy) fenylhydrazon (FCCP, ontkoppeling)
      Een mengsel van rotenon (een complex I-remmer) en antimycine A (een complex III-remmer)
      OPMERKING: Geneesmiddelen werden verkregen uit de mitochondriale stresstestkit die in dit onderzoek werd gebruikt. Sommige verbindingen zijn biologisch gevaarlijk; Er moeten strikte bioveiligheidsprotocollen (persoonlijke beschermingsmiddelen en voorbereiding op noodsituaties) worden gebruikt.
    3. Formulering van geneesmiddelen
      1. Bereid de voorraadoplossingen van de geneesmiddelen in poedervorm zoals weergegeven in tabel 1.
      2. Verdun de stamoplossingen tot de in tabel 2 aangegeven werkconcentraties.
        OPMERKING: De oplossingen worden grondig gevortexeerd of geroerd om homogeniteit over de concentratiegradiënten te garanderen.
  3. Verbindingen in detectiesondecartridges laden
    OPMERKING: Detectiesondecartridge is een wegwerpcartridge met biosensorsondes voor real-time meting van zuurstof en pH.
    1. Activering van de sondepatroon (moet voorafgaan aan het laden van de verbinding):
      NOTITIE: Zorg ervoor dat de sensor wordt geactiveerd door deze stappen ten minste 12 uur voor gebruik uit te voeren:
      1. Voeg 200 μL van de calibrantoplossing toe aan elk putje van de drinkplaat.
      2. Plaats de patroon van de detectiesonde voorzichtig op de drinkplaat en zorg ervoor dat alle sondes volledig worden ondergedompeld in de calibrantoplossing.
      3. Incubeer het geassembleerde apparaat gedurende 12-24 uur in een 37 °C CO2-vrije broedmachine om de sensoren te activeren.
        OPMERKING: Onvolledige onderdompeling of onvoldoende hydratatie veroorzaakt meetafwijking (±15% OCR-fout).
    2. Gebruik meerkanaals of elektronische pipetten om nauwkeurige volumes in putten te brengen, waardoor achtergebleven druppels aan de randen van de put worden vermeden.
      OPMERKING: Aangezien acute stimulatie van het geneesmiddel niet nodig is, volgt u de standaard laadsequenties.
    3. Plaats de sondeplaat na het laden op een stabiele ondergrond om storingen tijdens het transport te voorkomen.
      OPMERKING: De nauwkeurigheid van het laden heeft een aanzienlijke invloed op de resultaten.
  4. Software configuratie
    1. Start de software en selecteer het protocol voor de mitochondriale stresstest.
    2. Wijs groepen toe op basis van de vooraf gedefinieerde experimentele groepering.
    3. Stel de bestandsnaam in en klik op Start Run.
  5. Kalibratie van detectiesondecartridges.
    1. Steek de geladen sondeplaat voorzichtig in de instrumentsleuf volgens de systeemprompt.
    2. Start de kalibratie (15-20 min). Zorg voor stabiele omstandigheden; Vermijd trillingen.
    3. Verwijder de drinkplaat onmiddellijk na de kalibratie (volgens de instructies op het scherm).
      NOTITIE: Verwijder het deksel van de plaat voordat u gaat kalibreren.
  6. Metabole profilering van 3D-sferoïden
    1. Breng de ontgaste 3D-sferoïde testplaat over naar de meetsleuf van het instrument. Zorg voor een nauwkeurige uitlijning met de sonde-array door het volgende te bevestigen: (i) Plaathoek match-gleufgeleiders; (ii) Put A1 is uitgelijnd met de geïndexeerde positie; (iii) Geen zichtbare opening tussen de plaat en het oppervlak van het instrument
    2. Klik op Start om mitochondriale stresstesten te starten (duur: ~1,5 uur). Bewaak de instrumentparameters overal.
      NOTITIE: Verwijder de deksels van de 3D-sferoïde testplaat vóór de meting.
  7. Gegevensanalyse
    1. Beeldvormende analyse
      1. Breng 3D-sferoïde testplaten over naar een beeldvormingssysteem met hoge inhoud.
        OPMERKING: Er zijn afbeeldingen gemaakt zoals beschreven in stap 4. Beeldvorming toonde aan dat het merendeel van de sferoïden intact bleef, terwijl een minderheid schade opliep tijdens het overdrachtsproces, zoals weergegeven in figuur 3.
      2. Analyseer de morfologische gegevens (bijv. oppervlakte, lengte, breedte) van de celsferoïden via Harmony-softwareversie 5.2, volgens de stappen 7.7.1.3-7.7.1.7.
      3. Pas de module Textuurgebied grof toe om 3D-sferoïden van de achtergrond te scheiden door de afbeeldingsinhoud in drie clusters te verdelen op basis van de textuurkenmerken van objecten in de afbeeldingen.
      4. Pas de module Afbeeldingsgebied zoeken toe om de scheiding van vooraf geïsoleerde 3D-sferoïden te verfijnen via op volume gebaseerde groottekenmerken om onzuiverheden te verwijderen en intacte sferoïden te behouden.
      5. Meet de morfologische parameters van de 3D-sferoïden via de module Morfologie-eigenschappen .
      6. Pas de module Select Population toe om uiteindelijk echte 3D-celsferoïden uit te filteren.
      7. Exporteer de resultaten van de morfologische gegevens, zoals weergegeven in tabel 3.
    2. Gegevensverwerking
      OPMERKING: Normaliseer de celgegevens via parameters uit de beeldvormingsoutput om experimentele artefacten te minimaliseren.
      1. Open de ruwe metabolische gegevens via de analysesoftware.
      2. Selecteer de Normalisatie Optie om toegang te krijgen tot de bewerkingsinterface voor de normalisatiemodus.
      3. Voer de dwarsdoorsnede van de sferoïden in elke corresponderende put van de testplaat in het veld Normalisatiewaarden in.
      4. Stel de parameter voor de schaalfactor in op 1.000.000.
      5. Klik op de knop Toepassen om het normalisatieproces te voltooien. De uiteindelijke resultaten zijn weergegeven in figuur 4.

8. Afvalverwerking

  1. Gooi al het experimentele afval (media, reagentia, verbruiksartikelen en celsuspensies) weg volgens de protocollen voor biologisch gevaar en laboratoriumafvalbeheer. Autoclaaf of desinfecteer het bioactieve afval chemisch voordat u het weggooit om milieuverontreiniging te voorkomen.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

De drie meest kritische stappen in het detectieproces van het energiemetabolisme van 3D-celsferoïden zijn de kweek van 3D-celsferoïden, het sferoïde-overdrachtsproces en de beeldvorming en kwantificering van sferoïden na detectie (Figuur 1). Bovendien is het observeren van de toestand van de celsferoïden van groot belang. Toen de experimenten werden uitgevoerd volgens de bovengenoemde experimentele procedures, werden sferoïden op de 5edag gedetecteerd

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

De aanpassing van extracellulaire fluxanalyse aan 3D-glioommodellen vertegenwoordigt een cruciale methodologische vooruitgang in de studie van het metabolisme van tumorcellen. Hoewel traditionele 2D-culturen lange tijd als basis hebben gediend voor in vitro experimenten, slagen ze er niet in om de ruimtelijke architectuur, cel-cel en cel-matrix interacties, en zuurstof- en nutriëntengradiënten die kenmerkend zijn voor in vivo tumoren vast te leggen12

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

De auteurs hebben niets te onthullen.

Dankbetuigingen

Dit onderzoek werd gefinancierd door de National Natural Science Foundation of China, subsidienummers 82471329 en 82001248.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
10 cm schaalCorning430167
15 mL centrifugeerbuisjeCorning430791
50 mL centrifugeerbuisjeCorning430828
Calcein, AMInvitrogenC1430
Countess 3Thermo FisherAutomatische celteller
Fetaal bovien serumGibcoA5669701
Harmony 5.2PerkinElmerBeeldvormingssoftware
Hoechst 33342SolarbioC0031
MEM EBSS MediumHyCloneSH30024.01
Operetta CLSPerkinElmerHigh-content beeldanalysesysteem
PBSHyCloneSH30256.01
Poly-D Lysine hydrobromideSigma P7280
Rond-bodem ultra-lage hechting 96-well platenCorning4515
Seahorse Wave Desktop softwareAgilent
Seahorse XFe96AgilentExtracorporaal metabolisch testapparaat
Sorvall ST8RThermo FisherCentrifuge
TRYPSIN 0.25% EDTAGibco25200072
U87MG cel lijn National Infrastructure of Cell Resource
XF 1.0 M Glucose Oplossing, 50 mLAgilent103577-100
XF 100 mM Pyruvaat Oplossing, 50 mLAgilent103578-100
XF 200 mM Glutamine Oplossing, 50 mLAgilent103579-100
XF Calibrant Oplossing 500 mL Agilent100840-000
XF Cell Mito Stress Test KitAgilent103015-100
XF DMEM Medium, pH 7.4, 500 mLAgilent103575-100
XFe96/XF Pro Fluxpak-Detectie Sonde ArrayAgilent103792-100
XFe96/XF Pro Fluxpak-Metabolische Assay PlatenAgilent103792-100

Referenties

  1. Wu, W., et al. Glioblastoma multiforme (GBM): An overview of current therapies and mechanisms of resistance. Pharmacol Res. 171, 105780(2021).
  2. Crowley, A. E. 85th annual report on medical education in the United States. Executive summary. Jama. 254 (12), 1553-1554 (1985).
  3. Zhang, X., et al. Nutritionally physiological cell culture medium and 3D culture influence breast tumor proteomics and anticancer drug effectiveness. Pharmacol Res. 210, 107519(2024).
  4. Edmondson, R., Broglie, J. J., Adcock, A. F., Yang, L. Three-dimensional cell culture systems and their applications in drug discovery and cell-based biosensors. Assay Drug Dev Technol. 12 (4), 207-218 (2014).
  5. Bahl, R., et al. Growing desmoplastic three-dimensional pancreatic cancer spheroids from coculture. J Vis Exp. 211, e66625(2024).
  6. Faubert, B., Solmonson, A., Deberardinis, R. J. Metabolic reprogramming and cancer progression. Science. 368 (6487), eaaw5473(2020).
  7. Baksh, S. C., Finley, L. W. S. Metabolic diversity drives cancer cell invasion. Nature. 605 (7911), 627-628 (2022).
  8. Yoshida, G. J. Metabolic reprogramming: The emerging concept and associated therapeutic strategies. J Exp Clin Cancer Res. 34, 111(2015).
  9. Plitzko, B., Loesgen, S. Measurement of oxygen consumption rate (OCR) and extracellular acidification rate (ECAR) in culture cells for assessment of the energy metabolism. Bio Protoc. 8 (10), e2850(2018).
  10. Hong, X., Muñoz-Cánoves, P. Measuring oxygen consumption rate (OCR) and extracellular acidification rate (ECAR) in muscle stem cells using a Seahorse analyzer: Applicability for aging studies. Methods Mol Biol. 2640, 73-88 (2023).
  11. Yoo, I., Ahn, I., Lee, J., Lee, N. Extracellular flux assay (Seahorse assay): Diverse applications in metabolic research across biological disciplines. Mol Cells. 47 (8), 100095(2024).
  12. Kapałczyńska, M., et al. 2D and 3D cell cultures - a comparison of different types of cancer cell cultures. Arch Med Sci. 14 (4), 910-919 (2018).
  13. Rybkowska, P., et al. The metabolic changes between monolayer (2D) and three-dimensional (3D) culture conditions in human mesenchymal stem/stromal cells derived from adipose tissue. Cells. 12 (1), 178(2023).
  14. Białkowska, K., Komorowski, P., Bryszewska, M., Miłowska, K. Spheroids as a type of three-dimensional cell cultures-examples of methods of preparation and the most important application. Int J Mol Sci. 21 (17), 6225(2020).
  15. Pinto, B., Henriques, A. C., Silva, P. M. A., Bousbaa, H. Three-dimensional spheroids as in vitro preclinical models for cancer research. Pharmaceutics. 12 (12), 1186(2020).
  16. Juarez-Moreno, K., Chávez-García, D., Hirata, G., Vazquez-Duhalt, R. Monolayer (2D) or spheroids (3D) cell cultures for nanotoxicological studies? Comparison of cytotoxicity and cell internalization of nanoparticles. Toxicol In Vitro. 85, 105461(2022).
  17. Renner, H., et al. A fully automated high-throughput workflow for 3D-based chemical screening in human midbrain organoids. Elife. 9, e52904(2020).
  18. Beaufort, I. N., et al. Author commentary on Ilse N. Beaufort et al. Endoscopy. 56 (5), v6(2024).
  19. Liu, D., Chen, S., Win Naing, M. A review of manufacturing capabilities of cell spheroid generation technologies and future development. Biotechnol Bioeng. 118 (2), 542-554 (2021).
  20. Trettner, K. J., Hsieh, J., Xiao, W., Lee, J. S. H., Armani, A. M. Nondestructive, quantitative viability analysis of 3D tissue cultures using machine learning image segmentation. APL Bioeng. 8 (1), 016121(2024).
  21. Dominijanni, A. J., Devarasetty, M., Forsythe, S. D., Votanopoulos, K. I., Soker, S. Cell viability assays in three-dimensional hydrogels: A comparative study of accuracy. Tissue Eng Part C Methods. 27 (7), 401-410 (2021).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

Toestemming aanvragen

Trefwoorden

Extracellulaire fluxanalysezuurstofconsumptiesnelheidglycolyseanalysehigh content imagingpoly D lysine coating3D celkweekbehandeling met fenofibraat

Gerelateerde artikelen