Onderzoeksartikel

Bio-informatische identificatie van kandidaat-biomarkers geassocieerd met parodontitis in cytokine-behandelde parodontale ligamentstamcellen

DOI:

10.3791/68863

⸱

31 maart 2026

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Periodontology and Oral Mucosa, The Second Affiliated Hospital of Harbin Medical University, 2Department of Preventive dentistry, Heilongjiang Provincial Stomatological Disease Prevention and Treatment Hospital, 3Department of Stomatology, The First Affiliated Hospital of Harbin Medical University

In dit artikel

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De huidige studie is gericht op het onderzoeken van gestoorde genen via bio-informatische analyse in met cytokinen behandelde parodontale ligamentstamcellen. Upregulated ERC2-IT1 en downregulated EPB41L4A-AS1 werden geïdentificeerd als sleutelmoleculen in deze cellen, die mogelijk kunnen dienen als kandidaatbiomarkers die mogelijk geassocieerd zijn met parodontitis.

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Het primaire doel van de huidige studie was het onderzoeken van het mogelijke moleculaire mechanisme achter cytokine-geïnduceerde parodontale ligamentstamcellen (PDLSC's). Microarraygegevens uit de GSE260558-dataset zijn gehaald uit de genexpressie-omnibus (GEO)-database. Na normalisatie werden de ontregelde genen geïdentificeerd. Vervolgens werden de verschillende tot expressie gebrachte mRNA's (DE-mRNA's) onderworpen aan genontologie (GO) en kyoto encyclopedia of genes and genomes (KEGG) verrijkingsanalyses. Vervolgens werden hubgenen gescreend op basis van een eiwit-eiwitinteractie (PPI) netwerk. Ten slotte werden de concurrerende endogene RNA (ceRNA) regulatienetwerken met hubgenen opgebouwd met behulp van de ENCORI-website. In totaal werden 739 verschillende tot expressie gebrachte lncRNA's (DE-lncRNA's) en 809 verschillende tot expressie gebrachte mRNA's (DE-mRNA's) geïdentificeerd door gebruik te maken van het limma-pakket in de programmeertaal R. Vervolgens toonden de GO- en KEGG-analyses aan dat de DE-mRNA's nauw geassocieerd waren met ontsteking en de vorming van extracellulaire matrix in met cytokinen behandelde PDLSC's. Er werd een eiwit-eiwitinteractie (PPI) netwerk geconstrueerd voor DE-mRNA's, en hubgenen werden verkregen door de graad te evalueren. In totaal werden 12 upregulated hub-genen en 12 downregulated hub-genen gescreend. Deze upregulatie- en downregulatie-hubgenen werden vervolgens gebruikt om respectievelijk een ceRNA-regulatienetwerk op te bouwen. In deze netwerken werden opgereguleerde ERC2-IT1 en downreguliere EPB41L4A-AS1 beschouwd als belangrijke lncRNA's bij parodontitis. Concluderend onthulde de bio-informatica-analyse verschillende sleutelgenen en een ceRNA-regulerend netwerk die deelnamen aan de progressie van door cytokinen geïnduceerde PDLSC's. Hoewel deze studie verschillende kandidaatbiomarkers heeft geïdentificeerd die verband houden met parodontitis, is verdere experimentele validatie in diermodellen of klinische monsters noodzakelijk.

Inleiding

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Volgens de Wereldgezondheidsorganisatie wordt parodontitis erkend als de zesde meest voorkomende, alomtegenwoordige en onomkeerbare chronische ontstekingsziekte bij mensen 1,2. In het huidige tijdperk treft het bijna 15% van de wereldbevolking 1,2,3. Er is gerapporteerd dat parodontitis sterk gecorreleerd is met diverse factoren zoals leeftijd, geslacht, mondhygiëne, rookstatus, etniciteit, lagere sociaaleconomische status en een reeks systemische ziekten 2,3,4,5. Parodontitis, die een opmerkelijk hoge prevalentie heeft bij oudere volwassenen, wordt pathologisch veroorzaakt door dysbiotische veranderingen in de subgingivale microbiota die aan de tanden kleeft 6,7. Als deze aandoening niet wordt behandeld, leidt deze aandoening uiteindelijk tot botbeschadiging, tandbeweging en het ongelukkige verlies van tanden8. Daarom is een volledig begrip van de moleculaire mechanismen achter parodontitis en het identificeren van diagnostische markers voor de ziekte dringend nodig.

De structurele en interactieve complexiteit van parodontaal weefsel wordt algemeen beschouwd als een van de belangrijke factoren die bijdragen aan de aanzienlijke moeilijkheden die het proces van parodontale regeneratieondervindt 9,10. Onder het diverse scala aan mesenchymale stamcellen (MSC's) die worden gebruikt voor parodontale regeneratie, zijn parodontale ligamentstamcellen (PDLSC's) grondig aangetoond als een zeer betrouwbare bron voor de vorming van nieuwe cementachtige structuren in de in vivo omgeving11,12. In de recente preklinische studies die zijn uitgevoerd, heeft de behandeling op basis van PDLSC's zeer veelbelovende resultaten laten zien op het gebied van weefselregeneratie13,14. In vergelijking met gingivaal weefsel van de patiënt toonde de transcriptomics-analyse van PDLSC's een sterkere functionele oriëntatie en therapeutisch transformatiepotentieel13,14.

Bioinformatica-technologie en bio-informatica analysemethoden stellen onderzoekers in staat potentiële biologische processen en associaties met proteomische, genomische en metabolomische statistieken te identificeren15,16. Daarnaast stelt de hoge doorvoersnelheid van bio-informaticatechnologie onderzoekers ook in staat om grootschalige biologische datasets te analyseren, zoals die gegenereerd uit next-generation sequencing en microarray-experimenten17,18. Deze mogelijkheid maakt het mogelijk om potentiële biomarkers te identificeren voor ziektediagnose en prognose19,20. Zo werden een disintegrine- en metalloproteïnase 28 (ADAM28) en een disintegrine-achtig en metalloprotease domein met trombospondin type I motieven-achtig-3 (ADAMTSL3) geïdentificeerd als nieuwe biomarkers in gingivale weefsels van parodontitispatiënten via een uitgebreide analyse gebaseerd op bio-informatica technologie21. Daarnaast werd gerapporteerd dat verschillende ferroptose-gerelateerde genen, waaronder nucleaire receptorcoactivator 4 (NCOA4), opgeloste drager transporter 1A5 (SLC1A5) en hitteschokproteïne B1 (HSPB1), een betere diagnostische waarde hadden bij parodontitis22. Het moleculaire mechanisme van parodontitis verdient echter verdere onderzoek. In de huidige studie proberen onderzoekers bio-informaticatechnologie te gebruiken om hubgenen in cytokine-geïnduceerde PDLSC's te onderzoeken en potentiële biologische processen en routes te identificeren die verband houden met parodontitis. Bio-informatica-analyse van met cytokinen behandelde PDLSC's vangt ontstekingsgedreven transcriptieprogramma's die relevant zijn voor PDLSC-disfunctie, en die de kloof tussen PDLSC-disfunctie en parodontitis aanpakken. Deze kerngenen en routes in door cytokinen geïnduceerde PDLSC's bieden waardevolle inzichten in de verenigde mechanismen achter parodontitis.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Dataset

Deze analyse maakte gebruik van openbaar beschikbare gegevens en betrof geen menselijke of dierlijke proefpersonen, in overeenstemming met de ethische richtlijnen van de instelling en de JoVE. Alle informatie met betrekking tot de gebruikte platforms is beschikbaar in de Materiaaloverzicht.

  1. Selecteer in totaal 6 monsters (GSM8119437, GSM8119438, GSM8119439, GSM8119440, GSM8119441 en GSM8119442) uit de GSE260558 dataset (National Center of Biotechnology Information Gene Expression Omnibus, https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/query/acc.cgi?acc=GSE260558) voor bio-informatische analyse.
  2. In deze monsters worden parodontale ligamentstamcellen (PDLSC's) 7 dagen in een normaal medium of in medium met inflammatoire cytokines gekweekt.
  3. Extraheer het totale RNA uit PDLSC's en onderwerp het aan high-throughput sequencing23. Het proces van bio-informatische analyse wordt weergegeven in Figuur 1.

2. Identificatie van DEG's

  1. Analyseer de expressieprofielen van lncRNA en mRNA met behulp van de limma-software (versie: 3.46.0) zoals eerder beschreven24.
  2. Voer paargewijze vergelijkingen uit tussen cytokines en normale groepen.
  3. Gebruik de false discovery rate (FDR) correctie met een standaard cutoff van < 0,05 om significant differentieel tot expressie gebrachte genen te identificeren. Gebruik de aangepaste p-waarden (FDR) om het aandeel vals-positieven tussen statistisch significante resultaten te beheersen.
  4. Gebruik een aangepaste P-waarde cutoff van < 0,05 en een fold change threshold van > 1 om significant gedysreguleerde lncRNA's of mRNA's te identificeren.
  5. Presenteer de differentiële genexpressie in vulkaangrafieken (ggplot2: versie 3.4.1), die zijn gegenereerd met de R-software (versie 4.0.4).
  6. Vermeld de top 10 gedisreguleerde lncRNA's en mRNA's in tabellen.

3. Analyse van functionele verrijking

  1. Voer GO-verrijkingsanalyse uit van de DE-mRNA's met behulp van de DAVID online database (Database for Annotation, Visualization and Integrated Discovery, https://david.ncifcrf.gov/).
    1. Dien de gedysreguleerde genen in op de website en selecteer GO-termen, waaronder moleculaire functie (MF), biologische processen (BP) en cellulaire componenten (CC), om GO-analyse uit te voeren.
    2. Dien de gedisreguleerde genen in bij de Cytoscape (versie: 3.8.2) plugin ClueGO [16]+ en de Cluepedia-app.
    3. Pas de Benjamini-Hochberg-correctie toe voor meervoudige vergelijkingen en stel de significantiedrempel in op een aangepaste P-waarde < 0,05.
    4. Download de resultaten van Cytoscape. Rangschik de verrijkingen in aflopende volgorde op basis van P-waarde en presenteer de top 5 verrijkingen in elke categorie.
  2. De Kyoto encyclopedia of Genes and Genomes (KEGG) is een waardevolle database om de functies en effecten van biologische systemen (http://www.genome.jp/kegg/) te begrijpen.
    1. Voer de KEGG-analyse op vergelijkbare wijze uit door KEGG-PATHWAY op de website te kiezen.
    2. Stel de significantiedrempel in op een aangepaste P-waarde < 0,05 en presenteer de top 10 verrijkingen in deze studie. Voer deze verrijkingsanalyses uit volgens gerapporteerde studies 25,26.

4. PPI-netwerk

  1. Voorspel en construeer eiwit-eiwitinteracties (PPI) netwerken met behulp van de zoektool voor het ophalen van interagerende genen (STRING, versie 12.0).
  2. Dien 318 upregulated mRNA's of 465 downregulated mRNAs in op de STRING-website om het PPI-netwerk op te bouwen.
  3. Exporteer de interactiegegevens van het PPI-netwerk en dien de gegevens in bij de Cytoscape-software.
  4. Verberg de individuele node in het PPI-netwerk. Download het PPI-netwerk dat in deze studie aanwezig is.
  5. Bereken de topologische eigenschappen van het netwerk, inclusief gradenverdeling, met behulp van de CentiScaPe-app, een plug-in van Cytoscape.
  6. Kwantificeer de lokale topologie van elk gen door het aantal aangrenzende genen op te tellen en de interacties voor een gegeven knoop te tellen.
  7. Rangschik alle genen uit het PPI-netwerk in aflopende volgorde op basis van hun mate van connectiviteit.
  8. Selecteer de top 12 upregulated en top 12 downregulated genen uit deze gerangschikte lijst als de hubgenen.

5. miRNA-mRNA regulatienetwerk

OPMERKING: De ENCORI-database (versie 12.0, https://rnasysu.com/encori/) werd gebruikt om regulatieverbanden te voorspellen tussen microRNA's (miRNA's) en DE-lncRNA's (of hubgenen).

  1. Dien de upregulated hub-genen of downregulated hub-genen in bij ENCORI en stel het cut-off-criterieprogramma ≥5 in totaal zes programma's, waaronder PITA, RNA22, miRmap, miRanda, PicTar en TargetScan, voor de voorspellingsanalyse in ENCORI.
  2. Download de voorspelde miRNA's en dien ze in bij ENCORI om potentiële lncRNA's te verkrijgen.
  3. Download de voorspelde lncRA's en identificeer de overlappende lncRNA's tussen stap 5.2 en Figuur 2.
  4. Dien de hubgenen, miRNA's verkregen in sectie 5.1 en lncRNA's verkregen in stap 5.3 in bij de Cytoscape-software (versie 3.4.0) om het ceRNA-netwerk te construeren.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Identificatie van DEG's
De limma R-software werd gebruikt om de differentiële expressieprofielen van lncRNA's en mRNA's te analyseren. De verschillen tussen de twee groepen werden bepaald door een niet-gepaarde t-test. Zoals weergegeven in het vulkaandiagram (Figuur 2), werden in totaal 739 verschillende tot expressie gebrachte lncRNA's (DE-lncRNA's, p-waarde<0,05, |log2FC|>1) geïdentificeerd. Onder deze DE-lncRNA's werden 340 up...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Parodontale ligamentstamcellen (PDLSC's) worden beschouwd als sleutelcellen die een cruciale rol spelen bij het onderdrukken van parodontale schade gedurende zowel de progressie- als herstelfase van parodontitis32,33. Een aanzienlijke hoeveelheid bewijs heeft duidelijk aangetoond dat incubatie onder een ontstekingstoestand het potentieel heeft om de veroudering van PDLSC's34,35...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De auteurs stellen dat er geen concurrerende belangen zijn in deze studie.

Dankbetuigingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wij waarderen de steun van het Tweede Geaffilieerde Ziekenhuis van Harbin Medical University, de Natural Science Foundation van de provincie Heilongjiang (LH2023H037) en de National Natural Science Foundation (82201070).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
RR Foundation for Statistical Computing4.0.4Core open-source omgeving voor statistische berekeningen. Dient als de basis voor alle verdere analyses. Meestal gebruikt met RStudio.
LimmaBioconductor Community (Lead Dev: Walter & Eliza Hall Institute)3.46.0Gespecialiseerd pakket voor differentiële expressieanalyse van microarrays en RNA-seq. 
CytoscapeCytoscape Consortium3.8.2Open-source platform voor netwerkvisualisatie. Vereist aparte installatie; ondersteunt plugins zoals ClueGO en cytoHubba via de App Store.
STRINGEuropean Molecular Biology Laboratory12De grootste wereldwijde database voor voorspelde en bekende eiwit-eiwitinteracties (PPI). Toegankelijk via web of Cytoscape-plugin; geeft vertrouwensscores.
ENCORISun Yat-sen University3Openbare database gericht op ceRNA-netwerken (miRNA-mRNA-lncRNA).

Herprints en machtigingen

Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

Toestemming aanvragen

Trefwoorden

Cytokinebehandelingbio informatica analysegenexpressiedifferentieel tot expressie gebrachte geneneiwit eiwitinteractieceRNA netwerkGO verrijkingKEGG signaalroute

Gerelateerde artikelen