Methodenartikel

Analyses van het concurrerende endogene RNA-netwerk bij ratten met occlusie van de middelste cerebrale slagader op basis van lncRNA-, miRNA- en mRNA-expressie

668 weergaven

⸱

DOI:

10.3791/68876

⸱

7 oktober 2025

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Pharmacy, The First Affiliated Hospital of Anhui University of Chinese Medicine, 2School of Pharmacy, Anhui University of Chinese Medicine, 3School of Medical Economics Management, Anhui University of Chinese Medicine, 4Xin'an Medical Research Institute, 5Key Laboratory of Xin'An Medicine, Ministry of Education, 6Anhui Province Key Laboratory of Chinese Medicinal Formula

In dit artikel

Samenvatting

Deze studie maakte gebruik van bio-informatica-analyses en experimentele validatie om systematisch de regulerende rollen en onderliggende mechanismen te onderzoeken van lange niet-coderende RNA's (lncRNA's) die functioneren als concurrerende endogene RNA's (ceRNA's) bij ischemische beroerte.

Samenvatting

Deze studie heeft tot doel de regulerende rollen en onderliggende mechanismen te onderzoeken van lncRNA's die fungeren als ceRNA's bij ischemische beroerte. Op basis van de ceRNA-hypothese werden lncRNA's, miRNA's en mRNA's geïdentificeerd als componenten van een regulerend netwerk dat betrokken is bij een beroerte. Belangrijke lncRNA's uit het resulterende subnetwerk werden geselecteerd voor gedetailleerde analyse. Functionele verrijkingsanalyse met behulp van genontologie en het in kaart brengen van routes via de Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes onthulde kritieke interacties binnen het lncRNA-geassocieerde ceRNA-netwerk. Belangrijke routes, waaronder calciumsignalering, gap junction-signalering en neuroactieve ligandreceptorinteractie, werden verder gevalideerd met behulp van Western blot-analyse. Het geconstrueerde ceRNA-netwerk bestond uit 334 lncRNA's, miRNA's en mRNA's, waarbij functionele verrijkingsanalyse hun biologische rol voorspelde. Drie lncRNA's met een hoge mate van centraliteit werden geselecteerd om een representatief ceRNA-subnetwerk te construeren. Western blot-analyse toonde aan dat, in vergelijking met de schijngroep, de expressieniveaus van belangrijke eiwitten - CaMKII, calmodulin, CX36, PKC, CX43, GRIA3, GABRA6 en NPY1R significant werden gedownreguleerd in de modelgroep, terwijl de expressie van CaN significant werd opgereguleerd (P < 0,05). Deze bevindingen suggereren dat lncRNA's significant betrokken zijn bij de pathogenese van een beroerte. Concluderend kunnen we stellen dat lncRNA's die als ceRNA's fungeren, een cruciale regulerende rol spelen in de pathogenese van ischemische beroerte.

Inleiding

Ischemische beroerte, een veel voorkomende neurologische aandoening, leidt tot blijvende hersenbeschadiging, langdurige invaliditeit of de dood 1,2,3,4. MicroRNA's (miRNA's of miR), lange niet-coderende RNA's (lncRNA's) en boodschapper-RNA's (mRNA) vormen RNA-gemedieerde regulerende netwerken 5,6,7,8. Deze moleculen reguleren cellulaire functies via verschillende complexe mechanismen 9,10 worden steeds meer erkend als bijdragers aan de pathofysiologie van ischemische beroerte. Ondanks hun groeiende associatie met de aandoening, blijven de precieze rollen van deze niet-coderende RNA's echter onduidelijk. Verder onderzoek naar nieuwe niet-coderende RNA's is essentieel voor het ophelderen van de moleculaire mechanismen die ten grondslag liggen aan ischemische beroerte.

LncRNA's fungeren als belangrijke regulatoren van genexpressie tijdens de initiatie en progressie van verschillende pathologische aandoeningen. lncRNA's dienen als concurrerende endogene RNA's (ceRNA's) en binden zich aan miRNA's om specifieke regulerende effecten uit te oefenen11. Wei et al. melden dat lncRNA AK038897 fungeert als een ceRNA door zich te richten op miR-26a-5p, waardoor dood-geassocieerde proteïnekinase 1 (DAPK1) wordt gemoduleerd om cerebrale ischemie-reperfusieschade te verergeren12. Studies tonen aan dat lang niet-coderend RNA SNHG1 (lncRNA SNHG1) functioneert als een ceRNA om cerebrovasculaire aandoeningen te reguleren door de HIF-1α/VEGF-signaleringsroute te moduleren door interactie metmiR-18a 13. Aanvullende studies tonen aan dat het lange niet-coderende RNA dat door de moeder tot expressie wordt gebracht gen 3 (lncRNA MEG3) neuronale apoptose moduleert via de miR-21/PDCD4-signaleringscascade14. Hoewel talrijke lncRNA's, miRNA's en mRNA's zijn geïdentificeerd door middel van high-throughput sequencing of microarray-analyse, blijven de functies van deze moleculen bij een beroerte onduidelijk en is de systematische oprichting van RNA-gemedieerde regulerende netwerken dringend nodig.

Daarom heeft deze studie tot doel een uitgebreid lncRNA-miRNA-mRNA-netwerk op te bouwen op basis van de ceRNA-hypothese met behulp van eerder verzamelde gegevens, en om geselecteerde ceRNA-subnetwerken te analyseren door middel van genontologie (GO) en Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes (KEGG) verrijking om lncRNA-functies beter te begrijpen. De resultaten zouden kunnen aantonen dat verschillende lncRNA's functioneren als ceRNA's, die mogelijk specifieke miRNA's en hun doel-mRNA's reguleren. GO-verrijking zou belangrijke biologische processen kunnen benadrukken, zoals cellulaire ontwikkeling, signaaltransductie en regulatie van de celcyclus, terwijl routeverrijking hun betrokkenheid bij beroerte-gerelateerde routes, immuunresponsen en metabolisme zou kunnen onthullen. Deze bevindingen zouden de mogelijke rol van lncRNA's in diverse cellulaire processen en ziektemechanismen kunnen benadrukken.

Er worden verschillende belangrijke verbeteringen geboden ten opzichte van bestaande ceRNA-netwerkanalysemethoden in onderzoek naar ischemische beroertes, zoals ondersteund door vergelijkingen met gerelateerde studies: ten eerste, integreer meerlaagse validatie door netwerkconstructie te combineren met verificatie van functionele routes; in tegenstelling tot Li et al.15, die zich voornamelijk richt op bio-informatica profilering van immuungerelateerde ceRNA-netwerken met behulp van openbare transcriptoomgegevens, een ceRNA-netwerk construeren dat bestaat uit 334 lncRNA's, miRNA's en mRNA's en valideren kritische signaalroutes (calciumsignalering, gap junction-signalering en neuroactieve ligand-receptorinteractie) door middel van Western blot-analyse, waarbij de beperking van overmatig vertrouwen op in silico-voorspellingen wordt aangepakt, zoals te zien is in Fan et al.16, dat een circRNA-geassocieerd ceRNA-netwerk construeert, maar geen experimentele validatie van stroomafwaartse routes heeft, en de functionele relevantie van het voorspelde netwerk bevestigt door eiwitexpressie te kwantificeren (bijv. CaMKII, CX36, GRIA3) in zowel model- als schijngroep; focus op kern-lncRNA's met een hoog topologisch belang, waardoor de specificiteit van de bevindingen wordt verbeterd; in tegenstelling tot Cheng et al.17, die een lncRNA-miRNA-mRNA ceRNA-netwerk construeert met 3 lncRNA's, 2 miRNA's en 24 mRNA's, maar geen prioriteit geeft aan belangrijke regulatoren, identificeren 3 lncRNA's met een hoge mate van centraliteit om een representatief subnetwerk op te bouwen, waardoor mechanistische inzichten worden verankerd aan de meest invloedrijke knooppunten en de interpreteerbaarheid wordt verbeterd in vergelijking met bredere, minder gerichte netwerken zoals beschreven in Li et al.18, die 62 lncRNA's omvat, maar geen gerichte subnetwerkanalyse heeft; geef gedetailleerde experimentele parameters om de reproduceerbaarheid te verbeteren: gebruik 500 ng-1 μg totaal RNA geëxtraheerd uit hersenweefsel (6 ratten per groep: 20 MCAO-modellen en 20 schijnbediende controles) voor bibliotheekvoorbereiding, met RNA-integriteitsnummer (RIN) > 8.0 om de kwaliteit te garanderen, een detail dat niet is gespecificeerd in Wang et al.19, dat circRNA-biomarkers valideert maar RNA-invoerspecificaties weglaat; gebruik mannelijke SPF SD-ratten (220 ± 30 g) met MCAO, een veelgebruikt model, maar let expliciet op de beperkingen ervan, het repliceert de vasculaire complexiteit of immuunresponsen van menselijke ischemische beroerte niet volledig, zoals benadrukt in Li et al. - en verzacht dit door ratten te stratificeren op basis van neurologische scores (1-3) om de ernst van het infarct te standaardiseren; erken studiebeperkingen: het ceRNA-netwerk legt mogelijk geen posttranslationele modificaties vast, en de steekproefomvang voor Western blot-validatie (n = 6 per groep) zou kunnen worden uitgebreid, met toekomstig werk om grotere cohorten en proteomische analyses op te nemen om deze hiaten aan te pakken.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

De dierproeven werden goedgekeurd door de Experimentele Ethische Commissie van de Anhui University of Chinese Medicine (licentienummer: AHUCM-rats-2024006) en uitgevoerd in overeenstemming met de institutionele richtlijnen en de normen voor diergebruik van JoVE. In deze studie werden veertig mannelijke SD-ratten van SPF-kwaliteit (220 g ± 30 g) gebruikt. De gebruikte reagentia en apparatuur staan vermeld in de materiaaltabel.

1. Proefdieren

  1. Huisvest de dieren in het Proefdiercentrum onder standaard proefomstandigheden. Houd een licht/donker-cyclus van 12 uur aan, verschoon het beddengoed dagelijks en zorg voor gratis toegang tot voedsel en water.
  2. Euthanaseer de dieren aan het einde van het experiment door toediening van 150 mg/kg natriumpentobarbital via intraperitoneale injectie om een diepe anesthesietoestand op te wekken (volgens institutioneel goedgekeurde protocollen). Bevestig diepe anesthesie door de afwezigheid van reflexieve reactie op het beknellen van de poot, controleer de ademhaling om volledig verlies van vitale functies te garanderen en ga vervolgens verder met onthoofding.

2. Inductie van het middelste cerebrale arterie occlusie (MCAO) model bij ratten

  1. Induceer anesthesie door toediening van een intraperitoneale injectie van 1% pentobarbitalnatrium in een dosis van 40 mg/kg20 (volgens institutioneel goedgekeurde protocollen). Evalueer de diepte van de verdoving met behulp van de teenknijp en hoornvliesreflexen.
    1. Controleer continu de ademhaling en hartslag tijdens de procedure. Breng steriele oogzalf op basis van minerale olie aan onmiddellijk na de anesthesie-inductie voor oogbescherming21.
  2. Eenmaal volledig verdoofd, maakt u een incisie in de middellijn van de nek en legt u voorzichtig de rechter gemeenschappelijke halsslagader (CCA), interne halsslagader (ICA) en externe halsslagader (ECA) bloot. Gebruik bij directe visualisatie geschikte microchirurgische instrumenten (bijv. tang en schaar) om het omliggende bindweefsel voorzichtig te scheiden en elke slagader volledig bloot te leggen.
    1. Nadat de slagaders zijn blootgelegd, ligate de ECA en CCA met behulp van chirurgische hechtingen. Leg stevige chirurgische knopen vast om de bloedstroom af te sluiten en bloedingen tijdens volgende procedures tot een minimum te beperken. Zorg voor de juiste spanning om een stabiel veld te creëren voor het inbrengen van hechtdraad.
    2. Maak een kleine incisie bij de splitsing van de ECA en ICA met behulp van een oogheelkundige schaar om zich voor te bereiden op het inbrengen van de hechtdraad. Kies een nylon hechtdraad met een diameter van 0,25 mm en een lengte van 18 mm vanaf de punt van het afgeronde (bolvormige) uiteinde. Breng de hechtdraad door de incisieplaats bij de ECA-ICA-overgang en beweeg deze voorzichtig langs de ICA tot een diepte van ongeveer 18,5 mm ± 0,5 mm om de middelste hersenslagader af te sluiten en focale cerebrale ischemie te induceren.
    3. Bevestig de ingebrachte nylon hechtdraad aan het omliggende weefsel of bloedvaten met behulp van chirurgische hechtingen om verplaatsing te voorkomen. Na het handhaven van MCAO gedurende 2 uur, induceer ischemie/reperfusieschade. Gebruik een fijne chirurgische tang om de nylon hechtdraad voorzichtig vast te pakken en trek langzaam ongeveer 5 mm terug om de cerebrale doorbloeding gedeeltelijk te herstellen en reperfusieschade op te wekken. In de schijngroep alleen de halsslagader binden zonder een draadembolie22 in te brengen.
  3. Een week na de succesvolle oprichting van het MCAO-model, verdoof je de ratten diep. Zodra er geen reactie is op het knijpen van de poten, onthoofdt u snel en oogst u de hersenen. Spoel het hersenweefsel af met normale zoutoplossing en bewaar ze vervolgens in een koelkast van -80 °C voor cryopreservatie23.
  4. Neurologische functiescore
    1. Evalueer de neurologische functie met behulp van de Longa-scoremethode om het succes van het MCAO-model24 te bepalen. Evalueer 24 uur na de reperfusie de neurologische functie van elke rat en ken een score toe op basis van de volgende criteria: Score 0: geen waarneembare neurologische uitval; Score 1: flexie van de linker voorpoot tijdens staartophanging, voorpoot niet volledig gestrekt; Score 2: flexie van de linker voorpoot tijdens de staartophanging met duidelijk verminderde weerstand aan de aangedane (linker) kant wanneer deze op een vlakke ondergrond wordt geplaatst; Score 3: hetzelfde als score 2, met toegevoegde cirkelende of onwillekeurige draaibewegingen tijdens het kruipen; Score 4: bewusteloosheid of overlijden binnen 24 uur.
      OPMERKING: Een hogere score duidt op een ernstigere gedragsstoornis en grotere neurologische stoornissen.
  5. Bereken het volume van het herseninfarct met behulp van 2,3,5-trifenyltetrazoliumchloride (TTC) kleuring
    1. Snijd elk ex vivo rattenbrein langs het coronale vlak in vijf plakjes van gelijke dikte. Zorg ervoor dat elke plak precies 2.0 mm ± 0.1 mm dik is. Dompel de secties volledig onder in vers bereide 2% (m/v) TTC-kleuringsoplossing.
      1. Wikkel de kleurcontainer in aluminiumfolie om de oplossing tegen licht te beschermen en incubeer de monsters in een incubator met constante temperatuur bij 37 °C ± 0,5 °C gedurende 30 min. Observeer na het kleuren rozerode kleuring in normaal hersenweefsel, terwijl ischemische infarcten ongekleurd (wit) blijven als gevolg van verlies van dehydrogenase-activiteit.
    2. Breng TTC-gekleurde hersenplakjes over in een paraformaldehydeoplossing van 4% (m/v) en fixeer deze gedurende 24 uur bij 4 °C om de weefselmorfologie te behouden. Leg na fixatie digitale beelden van de plakjes vast met behulp van een beeldvormingssysteem met hoge resolutie. Registreer en archiveer de gegevens 24 uur na de fixatie.
    3. Gebruik ImageJ-software om het infarctvolume en het totale hersenweefselvolume te kwantificeren voor elke rattengroep na TTC-kleuring. Bereken het gecorrigeerde volumepercentage van het infarct met behulp van de volgende formule25:
      Gecorrigeerd infarctvolume (%) = {[totaal laesievolume − (volume linkerhersenhelft − volume rechterhersenhelft)] / volume rechterhersenhelft} × 100%.
    4. Gebruik de GraphPad Prism-software om gecorrigeerde infarctvolumes te visualiseren en statistisch te analyseren via een ongepaarde t-test. Definieer statistische significantie als P < 0,05.

3. RNA-sequencing met hoge doorvoer

  1. Selecteer hersenweefsel van drie ratten in elke groep. Verwijder ribosomaal RNA (rRNA) uit de totale RNA-monsters met behulp van de Ribo-Zero rRNA-verwijderingskit volgens de instructies van de fabrikant.
    1. Bouw complementaire DNA-bibliotheken (cDNA) met behulp van de TruSeq RNA Library Prep Kit volgens het standaardprotocol. Gebruik gezuiverde cDNA-bibliotheken voor het genereren en sequencen van clusters.
  2. Gebruik de kerngegevens die eerder zijn gegenereerd26, die alle sequentiebibliotheken en datasets voor dit onderzoek hebben opgeleverd, zonder afhankelijk te zijn van nieuw gebouwde bibliotheken. Richt het huidige werk op de geïntegreerde fusieanalyse van deze bestaande datasets zonder nieuwe RNA-seq-bibliotheken of sequentiegegevens te genereren.
    1. Bevestig de goedkeuring van relevante institutionele ethische commissies voor de vorige studie. Voer high-throughput sequencing uit om systematisch het miRNA-expressieprofiel bij ratten met MCAO te beoordelen, in overeenstemming met gestandaardiseerde protocollen zoals eerder beschreven27.
      OPMERKING: Kwaliteitscontrolegegevens voor de RNA-sequencingbibliotheek worden verstrekt in aanvullend bestand 1.

4. Differentiële expressieanalyse van lange niet-coderende RNA's, microRNA's en boodschapper-RNA's

  1. Verkrijg annotaties voor eiwitcoderende genen, miRNA's en lncRNA's van Ensembl (https://www.ensembl.org/index.html), miRBase (https://www.mirbase.org/) en NONCODE (http://www.noncode.org/), indien van toepassing 28,29,30. Kwantificeer genexpressie met behulp van StringTie31 (https://ccb.jhu.edu/software/stringtie/).
    1. Monteer de uitgelijnde lezingen van elk monster in transcriptomen met behulp van de StringTie-assembler. Gebruik de StringTie-samenvoegmodule om de transcriptoomassemblages van alle monsters te integreren, waardoor een uniforme set transcripties wordt gegenereerd die consistent is in het cohort. Gebruik dit samengevoegde transcriptoom om de overvloed aan transcripten32 te schatten.
    2. Kwantificering van eiwitcoderende genen en lncRNA's uitvoeren door normalisatie van het getrimd gemiddelde van M-waarden (TMM) toe te passen en fragmenten per kilobase van het transcript per miljoen in kaart gebrachte lezingen (FPKM) voor elk transcriptte berekenen 33,34.
  2. Voer differentiële expressieanalyse uit met behulp van het edgeR-pakket (https://bioconductor.org/) om differentieel tot expressie gebrachte lncRNA's (DEL's), miRNA's (DEMis) en mRNA's (DEM's) tussen de MCAO- en controlegroepen te identificeren. Converteer de gefilterde matrix voor onbewerkte tellingen naar een edgeR DGEList-object. Schat de gemeenschappelijke dispersie en ken dezelfde dispersiewaarde toe aan elk gen of miRNA.
    1. Voer een exacte test uit om genexpressie tussen groepen te vergelijken. Haal de log2-vouwverandering (log2FC), logtellingen per miljoen (logCPM), P-waarden en false discovery rate (FDR)-gecorrigeerde P-waarden op voor elk differentieel tot expressie gebracht gen35. Definieer statistische significantie als P < 0,05 met een drempelwaarde voor vouwverandering van |log2(FC)| > 1.

5. Voorspelling van lange niet-coderende RNA- en boodschapper-RNA-doelen van differentieel tot expressie gebrachte microRNA's

  1. Haal de sequenties van DEMi's en DEL's op uit de juiste databases. Gebruik de miRNA-lncRNA-interactievoorspellingstools miRanda36 en RNAhybrid37 om mogelijke interacties tussen DEM's en DEL's te identificeren. Verkrijg miRNA-mRNA-interactieparen uit de miRWalk 3.0-database (http://mirwalk.umm.uni-heidelberg.de/)38

6. Constructie van het lange niet-coderende RNA - microRNA - messenger RNA regulerend netwerk

  1. Construeer het lncRNA-miRNA-mRNA-regulerende netwerk op basis van de ceRNA-hypothese39,40.
    1. Bereken de Pearson-correlatiecoëfficiënt (PCC) tussen DEL's en DEM's. Selecteer lncRNA-mRNA-paren voor verdere analyse als PCC > 0,99 en P < 0,01.
    2. Identificeer voor elk co-tot expressie gebracht lncRNA-mRNA-paar gedeelde miRNA's die gericht zijn op beide transcripten. Gebruik deze gedeelde miRNA's om het miRNA-mRNA-lncRNA co-expressienetwerk te bouwen.
    3. Gebruik Cytoscape (https://cytoscape.org/) om het lncRNA-miRNA-mRNA-interactienetwerk te construeren en te visualiseren41,42. Volg deze stappen:
      1. Gebruik de CytoNCA-plug-in om betweenness centrality (BC), nearness centrality (CC) en degree centrality (DC) voor elk knooppunt te berekenen.
      2. Selecteer genen met centraliteitsscores die hoger zijn dan de mediaanwaarden van alle drie de metrieken om het uiteindelijke sleutelsubnetwerk te construeren.
      3. Gebruik de CytoHubba-plug-in om de top 10 hub-genen in het eiwit-eiwitinteractienetwerk te identificeren en de belangrijkste knooppunten te extraheren die in stap 2 zijn geïdentificeerd.
      4. Bereken de knoopgraad voor elk onderdeel van het ceRNA-netwerk.

7. Functionele verrijkingsanalyses

  1. Voer GO- en KEGG-routeverrijkingsanalyses uit om de RNA-functie43 verder te onderzoeken. Gebruik het clusterProfiler-pakket (https://bioconductor.org/) om de verrijkingsresultaten te visualiseren44.

8. Western blot-analyse om de expressieniveaus te detecteren van belangrijke eiwitten die betrokken zijn bij lncRNA - ceRNA-gerelateerde routes

  1. Verwijder onder diepe verdoving snel de hele hersenen. Nadat u de hersenvliezen en bloedvaten zorgvuldig hebt verwijderd, isoleert u het corticale weefsel in het infarctgebied van de rat45. Gebruik een fijne schaar om het weefsel in kleine stukjes te knippen en zorg ervoor dat elk stuk tussen de 50 mg en 100 mg weegt. Breng de gewogen weefselmonsters over in voorgekoelde homogenisatiebuizen.
    1. Bereid de eiwitlysisbuffer voor in een volumeverhouding van PMSF tot RIPA lysisbuffer van 1:100 (eindconcentratie 1 mM PMSF). Voeg de lysisbuffer toe in een verhouding van 200 μl per 20 mg weefsel. Homogeniseer de monsters grondig met behulp van een met warmte gesteriliseerde glashomogenisator totdat het weefsel fijn is afgebroken.
    2. Incubeer de homogenaten gedurende 30 minuten op ijs en schud elke 10 minuten zachtjes om volledige lysis te vergemakkelijken. Centrifugeer de monsters gedurende 15 minuten bij 28.656,6 ×g bij 28.656,6 g bij 4 °C. Zuig het bovenstaande eiwit met totaal eiwit voorzichtig op zonder de pellet te verstoren.
  2. Voeg 5× natriumdodecylsulfaat-polyacrylamidegelelektroforese (SDS-PAGE) laadbuffer toe aan het eiwitmonster in een verhouding van 1:4 (1 volume van 5× buffer op 4 volumes eiwitmonster). Na verdunning is de uiteindelijke werkconcentratie van de SDS-PAGE-laadbuffer 1×.
    1. Meng grondig en verwarm 10 minuten in een kokend waterbad om de eiwitten volledig te denatureren. Laat de monsters afkoelen tot kamertemperatuur. Laad 30 μg van elk monster in de SDS-PAGE-gelpotten.
    2. Voer elektroforese uit in twee fasen: breng 80 V aan gedurende 30 minuten om eiwitten op te lossen via de stapelgel, verhoog vervolgens tot 120 V gedurende 1 uur om eiwitten in de oplossende gel te scheiden.
  3. Bereid voorgesneden filterpapier en polyvinylideendifluoride (PVDF) membranen voor die passen bij de grootte van de gel. Week het PVDF-membraan 3 minuten in methanol om het te activeren. Dompel zowel het PVDF-membraan als het filterpapier 5 minuten onder in de overdrachtsbuffer.
    1. Monteer de transfersandwich in de volgende volgorde (van boven naar beneden): anodeplaat, drie lagen filterpapier, PVDF-membraan, gel, drie lagen filterpapier, kathodeplaat. Zorg voor een goede uitlijning van de gel-, membraan- en filterpapierlagen. Verwijder alle luchtbellen bij elke stap om een gelijkmatige overdracht te garanderen.
  4. Spoel het PVDF-membraan onmiddellijk na de eiwitoverdracht gedurende 5 minuten in de westerse wasbuffer om de resterende overdrachtsbuffer te verwijderen. Blokkeer het membraan gedurende 2 uur bij kamertemperatuur door zachtjes te schudden in een westerse blokkeerbuffer met 5% magere melkpoeder, of gebruik 5% BSA als u gefosforyleerde eiwitten detecteert.
  5. Incubeer na het blokkeren het membraan met het primaire antilichaam (1:1000) 's nachts bij 4 °C onder voorzichtig schudden. Incubeer het membraan de volgende dag gedurende 2 uur bij kamertemperatuur met het secundaire antilichaam (1:10.000).
  6. Voer chemiluminescerende detectie uit in een donkere kamer om lichtinterferentie te voorkomen. Plaats de eiwitzijde van het PVDF-membraan plat in het midden van de belichtingsplaat in het automatische beeldvormingssysteem.
    1. Meng vlak voor gebruik gelijke hoeveelheden ECL-reagens A en ECL-reagens B in een schone centrifugebuis. Breng de gemengde ECL-oplossing gelijkmatig aan op het membraanoppervlak om de luminescentiereactie op gang te brengen.
    2. Verwijder na 1-2 minuten incubatie bij kamertemperatuur voorzichtig overtollig vocht zonder het membraanoppervlak te verstoren. Pas de belichtingsparameters op het beeldvormingssysteem aan op basis van de luminescentie-intensiteit om de signaalopname te optimaliseren.

9. Statistische analyse

  1. Analyseer de resultaten van Western blot met behulp van ImageJ-software om bandgrijswaarden te kwantificeren. Gebruik GraphPad Prism voor statistische analyse van experimentele gegevens. Druk alle gegevens uit als gemiddelde ± standaarddeviatie (x ± SD). Evalueer statistische verschillen tussen groepen met behulp van een ongepaarde t-toets.
    1. Voer gegevens van de twee onafhankelijke steekproefgroepen in de gegevenstabel van de software in, waarbij elke groep overeenkomt met een afzonderlijke kolom en de steekproeven onafhankelijk van elkaar. Controleer de normaliteit door "Normaliteits- en symmetrietests" te selecteren onder de functie "Analyseren" en de Shapiro-Wilk-test op beide groepen toe te passen.
    2. Als P voor beide groepen 0,05 >, beschouw dan de gegevens als normaal verdeeld. Selecteer op basis hiervan de optie Ongepaarde t-toets onder t-toetsen in de functie Analyseren om de analyse uit te voeren. Definieer statistische significantie als P < 0,05.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

De experimentele resultaten van de verificatie van het slagingspercentage van elke groep rattenmodellen worden weergegeven in figuur 1. Na modellering werd een neurologische functiescore uitgevoerd op de ratten (Figuur 1A). De modelgroep vertoonde ernstige neurologische gebreken en degenen met scores variërend van 1 tot 3 werden opgenomen in volgende experimenten. Figuur 1B en C tonen de resultaten ...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

Om de moleculaire mechanismen die ten grondslag liggen aan de pathogenese van een beroerte te onderzoeken en potentiële diagnostische en therapeutische doelen te identificeren, werden RNA-Seq en kleine RNA-Seq (sRNA-Seq) analyses uitgevoerd op hersenweefsel van ratten na MCAO. Deze studie heeft voornamelijk tot doel de complexe regulerende netwerken te onderzoeken waarbij lncRNA's, miRNA's en mRNA's betrokken zijn. Een uitgebreide analyse van de RNA-Seq- en sRNA-Seq-datasets van MCAO-geï...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

De auteurs stellen dat er geen concurrerende belangen zijn.

Dankbetuigingen

Dit manuscript werd ondersteund door het Anhui Province Academic Leader Reserve Candidate Funding Project (No.2022H287), Anhui Provincial Health Research Key Project (Referentie: AHWJ2022a013), Anhui Provincial College Natural Science Research Key Project (NO.2023AH050745), en het Anhui Provincial Hygiene and Health Outstanding Talents Project (NO. ahsjhmypygc20230074).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
2% (w/v) TTC-kleuringsoplossingBeijing Kangle Clone Biotechnology Co., Ltd. 20230805TTC-kleuring
4% (w/v) paraformaldehyde-oplossingBeyotimeP0099Gefixeerd hersenweefsel
40 mannelijke SPF-graad SD-rattenHagzhou Ziyuan Laboratory Animal Breeding Co.,LtdSCXK [zhe] 2024-0004laboratoriumdier
5% mageremelkpoederScientific PhygenePH1519WB
agarose-elektroforesesysteemBeijing Liuyi Biotechnology Co., Ltd.DYCP-44PWB
automatisch belichtingsapparaatShanghai Peiqing Technology Co., Ltd.JS-M6PWB
Automatische belichtingsmeterShanghai Peiqing Technology Co., LTDJS-M6PWB
Automatische ijsmakerChangshu City Xueke Electric Appliance Co., LTDIMS-20WB
CalmodulineAffinity49B2443WB
CamKIIAffinity14G0796WB
centrifugeHaimen Qilinbeier Instrument Manufacturing Co., Ltd.LX 300WB
clusterProfiler-pakketBioconductorclusterProfiler_4.17verrijkingsanalyses
CX36ZENBION24AP24WB
CX43ZENBIOM08NO01WB
ECL ultragevoelige chemiluminescentiekitbiosharpBL520BWB
Elektrische thermostaat luchtdroogkastShanghai Sanfa Scientific Instrument Co., LTDDHG-9070WB
Elektroforese-apparaatShanghai Tianeng Technology Co., LTD. (Tanon)EPS300WB
elektroforese-apparaatShanghai Tanon Science & Technology Co., Ltd.EPS300WB
elektroforesetankShanghai Tanon Science & Technology Co., Ltd.VE-180WB
GABRA6Affinity46V5371WB
Geit Anti-muis IgGZs-BIO142637WB
Geit Anti-konijn IgGZs-BIO139931WB
GRIA3Affinity0C33051WB
Hogesnelheid koelcentrifugeAnhui Jiawen instrument equipment Co., LTDJW-3021HRWB
HiSeq 2500 systeemillumina/RNA high-throughput sequencing
ImageJ softwareNational Institutes of HealthImageJ 1.54kTTC-kleuring
Magnetische verwarmingsroerderChangzhou city and instrument factoryJJ-79-1WB
MicropipetGermany Eppendorf/WB
Normaal temperatuur microcentrifugeHaimen Qi Limber Instrument Manufacturing Co., LTD. LX300LX300WB
NPY1RAffinity2D38248WB
pipeteppendorf0.5-10ulWB
PKCAffinity17E3745WB
voorgekleurde eiwitmarkerbiosharpBL712CWB
PVDF-membraanMilliporeIPVH00010WB
Ribo-Zero rRNA VerwijderingskitIllumina, San Diego, California, USA/RNA extractie
RIPA-lysaatBiosharpBL504AWB
NatriumpentobarbitalBeijing Think-Far Technology Co., Ltd.MERCKanesthetisch
TransfermembraaninstrumentShanghai Tanon Science & Technology Co., Ltd.VE-186WB
Transmembraan-apparaatShanghai Tianeng Technology Co., LTD. (Tanon)VE-186WB
β-actineZs-BIO19AW0505WB

Referenties

  1. Marquez-Ortiz, R. A., et al. Neuroimmune support of neuronal regeneration and neuroplasticity following cerebral ischemia in juvenile mice. Brain Sci. 13 (9), 1337(2023).
  2. Han, M., Ma, B., She, R., Xing, Y., Li, X. Correlations between serum cxcl9/12 and the severity of acute ischemic stroke, a retrospective observational study. Neuropsychiatr Dis Treat. 19, 283-292 (2023).
  3. Wang, J., Shan, A., Shi, F., Zheng, Q. Molecular and clinical characterization of ang expression in gliomas and its association with tumor-related immune response. Front Med (Lausanne). 10, 1044402(2023).
  4. Ma, W., et al. Effects of ischemic postconditioning and long noncoding RNAs in ischemic stroke. Bioengineered. 13 (6), 14799-14814 (2022).
  5. Deng, Y., et al. High-throughput sequencing to investigate lncRNA-circRNA-miRNA-mRNA networks underlying the effects of beta-amyloid peptide and senescence on astrocytes. Front Genet. 13, 868856(2022).
  6. Li, R. B., Yang, X. H., Zhang, J. D., Cui, W. Gas6-as1, a long noncoding RNA, functions as a key candidate gene in atrial fibrillation-related stroke determined by ceRNA network analysis and WGCNA. BMC Med Genomics. 16 (1), 51(2023).
  7. Shu, J., Yang, L., Wei, W., Zhang, L. Identification of programmed cell death-related gene signature and associated regulatory axis in cerebral ischemia/reperfusion injury. Front Genet. 13, 934154(2022).
  8. Zou, J. B., et al. Reconstruction of the lncRNA-miRNA-mRNA network based on competitive endogenous RNA reveal functional lncRNAs in cerebral infarction. Sci Rep. 9 (1), 12176(2019).
  9. Zheng, H. Y., et al. Longitudinal transcriptome analyses show robust T cell immunity during recovery from COVID-19. Signal Transduct Target Ther. 5 (1), 294(2020).
  10. Lu, Z., Deng, M., Ma, G., Chen, L. Trim38 protects h9c2 cells from hypoxia/reoxygenation injury via the traf6/tak1/nf-κb signalling pathway. PeerJ. 10, e13815(2022).
  11. Zhang, C., et al. Long noncoding RNAs in intracerebral hemorrhage. Front Mol Neurosci. 16, 1119275(2023).
  12. Wei, R., Zhang, L., Hu, W., Wu, J., Zhang, W. Long noncoding RNA ak038897 aggravates cerebral ischemia/reperfusion injury via acting as a cerna for mir-26a-5p to target dapk1. Exp Neurol. 314, 100-110 (2019).
  13. Retraction: LncRNA snhg1 regulates cerebrovascular pathologies as a competing endogenous RNA through hif-1α/vegf signaling in ischemic stroke. J Cell Biochem. 126 (4), e70017(2025).
  14. Yu, Z., et al. Tnf-α stimulation enhances the neuroprotective effects of gingival MSCs-derived exosomes in retinal ischemia-reperfusion injury via the meg3/mir-21a-5p axis. Biomaterials. 284, 121484(2022).
  15. Li, Y., et al. Profiling immune cell-related gene features and immunoregulatory ceRNA in ischemic stroke. Mol Biomed. 5 (1), 72(2024).
  16. Fan, R., et al. Integrated analysis of circRNA-associated ceRNA network in ischemic stroke. Front Genet. 14, 1153518(2023).
  17. Cheng, L., Zhao, Y., Ke, H. Comprehensive analysis of lncRNA-miRNA-mRNA cerna network in ischemic stroke. Heliyon. 10 (9), e29651(2024).
  18. Li, S., et al. Construction of lncRNA-mediated ceRNA network for investigating immune pathogenesis of ischemic stroke. Mol Neurobiol. 58 (9), 4758-4769 (2021).
  19. Wang, X. Z., et al. Construction of circRNA-mediated immune-related ceRNA network and identification of circulating circRNAs as diagnostic biomarkers in acute ischemic stroke. J Inflamm Res. 15, 4087-4104 (2022).
  20. Movassaghi, S., et al. Effect of pentoxifylline on ischemia-induced brain damage and spatial memory impairment in rats. Iran J Basic Med Sci. 15 (5), 1083-1090 (2012).
  21. Saund, J., Dautan, D., Rostron, C., Urcelay, G. P., Gerdjikov, T. V. Thalamic inputs to dorsomedial striatum are involved in inhibitory control: Evidence from the five-choice serial reaction time task in rats. Psychopharmacology (Berl). 234 (16), 2399-2407 (2017).
  22. Fei, C., et al. Effects of tao hong si wu decoction on circular rna expression profiles in rats with middle cerebral artery occlusion. Chinese Pharmacological Bulletin. 40 (05), 954-963 (2024).
  23. Ma, R., et al. Correlation of thrombin and lc3II/I expression in different ischemic phases and different brain regions in the MCAO model rats. J Hunan Univ Chinese Med. 42 (06), 899-905 (2022).
  24. Li, S., et al. Regulation of nr4a1 by taohong siwu decoction inhibits endothelial cell apoptosis in cerebral ischemia-reperfusion injury. J Ethnopharmacol. 353 (Pt A), 120285(2025).
  25. Ji, Z. J., et al. Neuroprotective effect of taohong siwu decoction on cerebral ischemia/reperfusion injury via mitophagy-NLRP3 inflammasome pathway. Front Pharmacol. 13, 910217(2022).
  26. Duan, X., et al. RNA sequencing for gene expression profiles in a rat model of middle cerebral artery occlusion. Biomed Res Int. 2018, 2465481(2018).
  27. Duan, X., et al. Identification and functional analysis of microRNAs in rats following focal cerebral ischemia injury. Mol Med Rep. 19 (5), 4175-4184 (2019).
  28. Zerbino, D. R., et al. Ensembl 2018. Nucleic Acids Res. 46 (D1), D754-D761 (2018).
  29. Ji, X., et al. A comprehensive rat transcriptome built from large-scale RNA-seq-based annotation. Nucleic Acids Res. 48 (15), 8320-8331 (2020).
  30. Zheng, Y., et al. Npinter v5.0: NcRNA interaction database in a new era. Nucleic Acids Res. 51 (D1), D232-D239 (2023).
  31. Oliveira, L. A., et al. The widespread misuse of stringtie's gene identifier tags as de facto gene symbols does not allow consistent gene identification in published research. Gene. 954, 149440(2025).
  32. Pertea, M., et al. Stringtie enables improved reconstruction of a transcriptome from RNA-seq reads. Nat Biotechnol. 33 (3), 290-295 (2015).
  33. Zaghlool, A., et al. Characterization of the nuclear and cytosolic transcriptomes in human brain tissue reveals new insights into the subcellular distribution of RNA transcripts. Sci Rep. 11 (1), 4076(2021).
  34. Zhang, W., et al. Transcriptomic data of peach varieties with different chilling requirement levels. BMC Genom Data. 25 (1), 99(2024).
  35. Chamorro Petronacci, C. M., et al. Identification of prognosis-associated microRNAs in HNSCC subtypes based on the TCGA dataset. Medicina (Kaunas). 56 (10), 535(2020).
  36. Wang, X., et al. Exosomes activate hippocampal microglia in atrial fibrillation through long-distance heart-brain communication. BMC Cardiovasc Disord. 24 (1), 627(2024).
  37. Jiang, P., et al. Circrna-phf21a_0002 promotes pyroptosis to aggravate hepatic ischemia/ reperfusion injury by sponging let-7b-5p. Heliyon. 10 (16), e34385(2024).
  38. Faraldi, M., et al. Circulating biomarkers associated with walking performance in elderly subjects: Exploring miRNAs, metabolic and inflammatory biomarkers. Geroscience. 47 (3), 3977-3996 (2025).
  39. Jiang, H., et al. Reconstruction and analysis of the lncRNA-miRNA-mRNA network based on competitive endogenous RNA reveal functional lncRNAs in rheumatoid arthritis. Mol Biosyst. 13 (6), 1182-1192 (2017).
  40. Alipour, S., et al. Innovative targets of the lncRNA-miRNA-mRNA network in response to low-dose aspirin in breast cancer patients. Sci Rep. 12 (1), 12054(2022).
  41. Ono, K., et al. Cytoscape web: Bringing network biology to the browser. Nucleic Acids Res. 53 (W1), W203-W212 (2025).
  42. Shannon, P., et al. Cytoscape: A software environment for integrated models of biomolecular interaction networks. Genome Res. 13 (11), 2498-2504 (2003).
  43. Huckvale, E. D., Moseley, H. N. B. Predicting the pathway involvement of all pathway and associated compound entries defined in the Kyoto Encyclopedia of genes and genomes. Metabolites. 14 (11), (2024).
  44. Yu, G., Wang, L. G., Han, Y., He, Q. Y. Clusterprofiler: An R package for comparing biological themes among gene clusters. Omics. 16 (5), 284-287 (2012).
  45. Ueno, Y., et al. Axonal outgrowth and dendritic plasticity in the cortical peri-infarct area after experimental stroke. Stroke. 43 (8), 2221-2228 (2012).
  46. Arkelius, K., et al. Lox-1 and mmp-9 inhibition attenuates the detrimental effects of delayed rt-PA therapy and improves outcomes after acute ischemic stroke. Circ Res. 134 (8), 954-969 (2024).
  47. Hou, L., et al. Itgam is a critical gene in ischemic stroke. Aging (Albany, NY). 16 (8), 6852-6867 (2024).
  48. Miao, M., Lyu, M., Zhong, C., Liu, Y. Correlation between mmp9 promoter methylation and transient ischemic attack/mild ischemic stroke with early cognitive impairment. Clin Interv Aging. 18, 1221-1232 (2023).
  49. Li, W., et al. Clec7a knockdown alleviates ischemic stroke by inhibiting pyroptosis and microglia activation. J Integr Neurosci. 23 (12), 219(2024).
  50. Shi, Y., et al. C5ar1 mediates the progression of inflammatory responses in the brain of rats in the early stage after ischemia and reperfusion. ACS Chem Neurosci. 12 (21), 3994-4006 (2021).
  51. Yan, Y., Chen, L., Zhou, J., Xie, L. Snhg12 inhibits oxygen-glucose deprivation-induced neuronal apoptosis via the mir-181a-5p/negr1 axis. Mol Med Rep. 22 (5), 3886-3894 (2020).
  52. Wei, X. Y., et al. Long noncoding RNA RPL34-AS1 ameliorates oxygen-glucose deprivation-induced neuronal injury via modulating miR-223-3p/igf1r axis. Hum Cell. 35 (6), 1785-1796 (2022).
  53. Zhou, X., et al. Long noncoding RNA norad protects against cerebral ischemia/reperfusion injury-induced brain damage, cell apoptosis, oxidative stress, and inflammation by regulating miR-30a-5p/ywhag. Bioengineered. 12 (2), 9174-9188 (2021).
  54. Gao, H., et al. Long noncoding RNA Peg13 alleviates hypoxic-ischemic brain damage in neonatal mice via mir-20a-5p/xiap axis. Neurochem Res. 47 (3), 656-666 (2022).
  55. Fluri, F., Schuhmann, M. K., Kleinschnitz, C. Animal models of ischemic stroke and their application in clinical research. Drug Des Devel Ther. 9, 3445-3454 (2015).
  56. Zhao, W., et al. Comparison of RNA-seq by poly (a) capture, ribosomal RNA depletion, and DNA microarray for expression profiling. BMC Genomics. 15 (1), 419(2014).
  57. Wang, C., et al. The construction and analysis of lncRNA-miRNA-mRNA competing endogenous RNA network of Schwann cells in diabetic peripheral neuropathy. Front Bioeng Biotechnol. 8, 490(2020).
  58. Pillai-Kastoori, L., et al. Antibody validation for Western blot: By the user, for the user. J Biol Chem. 295 (4), 926-939 (2020).
  59. Liu, Q., et al. Mir-190a potentially ameliorates postoperative cognitive dysfunction by regulating tiam1. BMC Genomics. 20 (1), 670(2019).
  60. Vella, D., Zoppis, I., Mauri, G., Mauri, P., Di Silvestre, D. From protein-protein interactions to protein co-expression networks: A new perspective to evaluate large-scale proteomic data. EURASIP J Bioinform Syst Biol. 2017 (1), 6(2017).
  61. Panfil, K., Deavours, A., Kirkpatrick, K. Effects of the estrous cycle on impulsive choice and interval timing in female rats. Horm Behav. 149, 105315(2023).
  62. Ouyang, S., et al. Comprehensive bioinformatics analysis to reveal key RNA targets and hub competitive endogenous RNA network of keratoconus. Front Genet. 13, 896780(2022).
  63. Chen, X., et al. Cx3cl1/cx3cr1 axis attenuates early brain injury via promoting the delivery of exosomal microRNA-124 from neuron to microglia after subarachnoid hemorrhage. J Neuroinflammation. 17 (1), 209(2020).
  64. Karim, M. R., et al. Explainable AI for bioinformatics: Methods, tools and applications. Brief Bioinform. 24 (5), bbad236(2023).
  65. Shainer, I., et al. Transcriptomic neuron types vary topographically in function and morphology. Nature. 638 (8052), 1023-1033 (2025).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

Toestemming aanvragen

Trefwoorden

Ischemisch infarctlncRNA expressiemiRNA expressieceRNA netwerkfunctionele verrijkingcalciumsignaleringgap junction signaleringWestern blot

Gerelateerde artikelen