Method Article

Een eenvoudige en snelle methode voor gelijktijdige isolatie van primaire eilandjes en primaire alvleesklier-acinaire cellen van muizen

DOI:

10.3791/68960

⸱

January 9th, 2026

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Clinical Medical College, Yangzhou University, 2Department of Gastroenterology, Shanghai Institute of Pancreatic Diseases, Changhai Hospital, National Key Laboratory of Immunity and Inflammation, Naval Medical University, 3Department of Gastroenterology. Affiliated Yueqing Hospital, Wenzhou Medical University

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Deze studie ontwikkelde een vereenvoudigde methode om efficiënt functionele primaire eilandjes en acinaire cellen uit de muizenalvleesklier te extraheren, wat een waardevol hulpmiddel biedt voor het bestuderen van intercellulaire communicatie in de pathogenese van Acute Pancreatitis-geïnduceerde Diabetes.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

In het onderzoek naar de pathogenese van postacute pancreatitis diabetes mellitus (PPDM-A) is abnormale bidirectionele communicatie tussen pancreasacinaire cellen (PAC's) en eilandcellen een belangrijk aandachtspunt. Echter, geïmmortaliseerde cellijnen kunnen pathofysiologische omstandigheden niet repliceren, waardoor het extraheren van hoogwaardige primaire cellen cruciaal is. Huidige methoden om primaire eilandjes van muizen te extraheren zijn grotendeels afhankelijk van in-vivo pancreasperfusie via galbuiscannulatie, wat een hoge technische drempel heeft en niet bevorderlijk is voor gebruik door onderzoekers zonder ervaring.

Deze studie wijzigde de methode, waardoor complexe, in-vivo perfusie niet meer nodig was. SPF-klasse C57BL/6J-muizen (6-8 weken oud) werden verdoofd en geëuthanaseerd, gevolgd door isolatie van de alvleesklier. De alvleesklier werd in vitro verteerd met collagenase P; primaire eilandjes werden gescheiden via Ficoll-dichtheidsgradiëntcentrifugatie, en acinaire cellen werden verkregen door celzeffiltratie en centrifugatie. Cellevensvatbaarheid en functie werden geëvalueerd met calcein/propidiumjodide (Calcein/PI) kleuring, glucose-gestimuleerde insulinesecretietest en detectie van amylaseactiviteit.

De resultaten toonden aan dat de aangepaste methode eenvoudig te bedienen was: de opbrengst per muis was (120 ± 5) primaire eilandjes en 1,6-1,95 × 10⁷ acinaire cellen; De levensvatbaarheidspercentages van eilandjes en acinaire cellen waren respectievelijk (97,52 ± 0,16)% en (96,55 ± 0,95%). Bovendien vertoonden de eilandjes een normale insulineafgiftecapaciteit en waren de acinaire cellen gevoelig voor ceruleinestimulatie. Deze methode is eenvoudig en betrouwbaar, en biedt een haalbaar kader voor het bestuderen van de exacriene interacties tussen de alvleesklier en de PPDM-A. Het heeft echter beperkingen, zoals een niet-gevalideerde toepassing bij ratten.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Acute pancreatitis (AP) kan de endocriene functie van de pancreatische creatische aandoening verstoren via meerdere routes, zoals pancreasparenchymale schade en inflammatoire cascades, waardoor postacute pancreatitis diabetes mellitus (PPDM-A)1,2 wordt geïnduceerd. Momenteel blijft de kernpathogenese van PPDM-A onduidelijk, en is abnormale bidirectionele communicatie tussen de pancreasendocriene en exocriene compartimenten een belangrijkonderzoeksfocus. Hoewel bestaande geïmmortaliseerde β-cellijnen (bijv. INS-1, MIN6) veelgebruikte hulpmiddelen zijn voor in-vitro diabetische celmodellen, leidt hun tumorafgeleide aard tot aanzienlijke verschillen met normale primaire eilandcellen wat betreft glucoseresponsiviteit en cellulaire heterogeniteit. Daardoor kunnen ze de pathofysiologische toestand onder de micro-omgeving van acute pancreatitis 4,5 niet echt repliceren. Daarom is het verkrijgen van hoogwaardige primaire eilandjes en acinaire cellen de kerntechnische basis geworden om het mechanisme van hun interactie te verduidelijken.

Huidige methoden om primaire eilandjes van muizen te isoleren zijn voornamelijk gebaseerd op duct cannulation-technologie, waarbij precieze lokalisatie en cannulatie van de galweg vereist om collagenaseoplossing in het pancreasparenchym te injecteren voor in vivo perfusie 6,7. Voor het isoleren van primaire eilandjes van neonatale muizen behaalden Huang et al.8 uitstekende resultaten met in-vitro vertering zonder in-vivo pancreasperfusie. Op basis van de praktische ervaring van ons onderzoeksteam is het uitvoeren van optimale alvleesklierperfusie via galwegcannulatie een uitdaging om snel en effectief te realiseren zonder gespecialiseerde training. Geïnspireerd door de methode om primaire eilandjes van neonatale muizen te isoleren, paste ons team het extractieprotocol aan om het eenvoudiger en toegankelijker te maken voor onderzoekers zonder perfusie-ervaring. Deze aangepaste aanpak biedt ook een eenvoudiger alternatief om primaire eilandjes te isoleren van jonge muizen of muizen met gevoelige galgangen. Bovendien biedt deze methode voordelen in zowel de isolatie-efficiëntie (hoeveelheid) als de zuiverheid (kwaliteit) van eilandjes en acinaire cellen. Het stelt onderzoekers in staat experimenten uit te voeren binnen dezelfde pathologische en fysiologische context, waardoor diepgaande analyse van het interactiemechanisme tussen eilandjes en acinaire cellen mogelijk is.

De methode vereist strikte controle van de verteringstijd van de alvleesklier; Het fijnhakken van de alvleesklier vóór de spijsvertering is ook een cruciale stap. Daarnaast moet aandacht besteden aan de intensiteit van mechanische verspreiding van alvleesklierweefsel na de spijsvertering. Deze factoren beïnvloeden allemaal de hoeveelheid en kwaliteit van geïsoleerde eilandjes en acinaire cellen. Deze methode is niet gevalideerd bij ratten en kan momenteel niet worden opgeschaald voor productie.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Procedures met betrekking tot dieren zijn goedgekeurd door de Ethische Commissie of de Ethiekcommissie van het Laboratoriumdierencentrum van het Changhai Ziekenhuis (Goedkeuringsnummer: CHEC (A.E)-2025-026). SPF-klasse C57BL/6J muizen (6-8 weken oud, 18-25 g, mannelijk of vrouwelijk, n = 3) werden onderhouden op een licht/donker cyclus van 12 uur met vrije toegang tot voedsel (onderhoudsdieet) en water.

Afval van scherpe middelen zoals spuiten en naalden wordt verzameld in de speciale scherpe containers van het laboratorium en afgevoerd door gekwalificeerde professionele instanties. In overeenstemming met de Richtlijnen voor ethisch gedrag bij de verzorging en het gebruik van niet-menselijke dieren in onderzoek, moeten muizenkarkassen in de speciale vriezer van het laboratorium worden geplaatst en door professionele instanties worden verbrand.

1. Voorbereiding van reagens

OPMERKING: Oplossingen zoals het steriele dichtheidsgradiëntmedium worden verzameld in de "Chemische Afvalverzameltrommel" van het laboratorium. Alle chemische afvalmaterialen moeten worden afgevoerd door gekwalificeerde professionele instanties zoals geregeld door het laboratorium.

  1. Bereiding van collagenase P-oplossing
    1. In een 50 mL centrifugebuis weeg achtereenvolgens 25 mg collagenase P, 42 mg watervrij calciumchloride en 0,02 g trypsine-remmer. Voeg 45,5 mL Hank's Balanced Salt Solution en 500 μL HEPES-oplossing toe, en laat het vortex tot het volledig is opgelost. Steriliseer de oplossing door filtratie via een 0,22 μm filter en breng de gefilterde oplossing over in een nieuwe steriele 50 mL centrifugebuis. Dit levert een 0,5 mg/mL collagenase P-oplossing op, die wordt gebruikt voor de daaropvolgende vertering van alvleesklierweefsel.
  2. Behandeling van steriele dichtheidsgradiëntoplossing
    1. Filter de steriele dichtheidsgradiëntoplossing door een 0,22 μm filter voor sterilisatie en breng deze vervolgens over in een nieuwe steriele 50 mL centrifugebuis. Label duidelijk de oplossingsinformatie en bewaar deze bij 4 °C voor later gebruik. Hierna wordt het aangeduid als "Ficoll".
  3. Voorbereiding van stopbuffer en volledig medium
    1. Voeg respectievelijk 10% foetaal rundereserum (FBS) en 1% penicilline-streptomycineoplossing toe aan het blanco DMEM-medium en RPMI-1640-medium, om het DMEM-volledige medium en het RPMI-1640-volledige medium (ook de stopbuffer voor de alvleeskliervertering) te bereiden. Label duidelijk de oplossingsinformatie en bewaar op 4 °C voor later gebruik.
  4. Bereiding van glucoseoplossingen met verschillende concentraties
    1. Voeg in een 50 mL centrifugebuis 50 mL Krebs-Ringer bicarbonaat HEPES buffer (KRBH) en 0,25 g Bovine Serum Albumine (BSA)-V toe om een KRBH-oplossing te bereiden met 0,5% BSA. Voeg vervolgens in 28,33 mL van de 0,5% BSA-houdende KRBH-oplossing 168 μL glucose (1 M) en 1,5 mL calciumchlorideoplossing (50 mM) toe om een 5,6 mM glucoseoplossing te bereiden. In 9,28 mL van de 0,5% BSA-houdende KRBH-oplossing voeg je 220 μL glucose (1 M) en 500 μL calciumchlorideoplossing (50 mM) toe om een 22 mM glucoseoplossing te bereiden.

2. Isolatie van pancreaseilandjes en pancreasacinaire cellen (PAC's)

OPMERKING: Alle chirurgische instrumenten moeten een autoclave-sterilisatie ondergaan.

  1. Voeg Hank's Balanced Salt Solution en collagenase P-oplossing toe aan de 12-wells plaat. En voeg 3 ml collagenase P-oplossing toe aan een 50 mL centrifugebuis voor de volgende vertering.
    OPMERKING: Voeg 2 ml Hank's Balanced Salt Solution toe aan drie putten en 2 ml collagenase P-oplossing aan één put.
  2. Weeg en verdoof de muis met intraperitoneale injectie van 1,25% tribromoethanol bij een dosis van 0,025 mL/g vóór de operatie, controleer de anesthesiestatus door in de voet van de muis te knijpen: de diepte van de anesthesie wordt bepaald door een geleidelijke afname van de ademhalingsfrequentie en geen reactie op het knijpen van de voetkussen. Zodra diepe anesthesie is bevestigd, euthanasen de muizen door cervicale dislocatie. Dompel de muizen 5 minuten onder in 75% ethanol voor desinfectie, en breng ze daarna over in een bioveiligheidskast voor isolatie van de alvleesklier.
    OPMERKING: Tribromoethanol (1,25%) wordt bij aankoop als voorbereide oplossing geleverd; Er is geen handmatige voorbereiding nodig. Onderzoekers moeten gedurende het hele experiment handschoenen en mondkapjes dragen. Als huidcontact optreedt tijdens de injectie van 1,25% tribromoethanol, veeg dan onmiddellijk het resterende reagens af met watervrije ethanol, spoel 5 minuten met stromend water en breng een moisturizer aan om droogheid te verlichten. Er zijn geen corrosieve chemicaliën betrokken bij deze studie. Afvalchemische reagentia, zoals 1,25% tribromoethanol, moeten worden verzameld in speciale afgesloten containers met het label "Gevaarlijk Chemisch Afval".
  3. Maak een V-vormige buikincisie om de buikholte van de muis te openen. Het donkerrode lymfoïde orgaan in het linker hypochondergebied is de milt, en het witte orgaan dat aan de milt vastzit is de alvleesklier. Voer voorzichtig een stomp dissectie uit van de alvleesklier langs de onderkant van de maag en de pancreaticoduodenale overgang.
  4. Was het geïsoleerde alvleesklierweefsel in Hank's Balanced Salt Solution en verwijder resterende mesenterische aanhechtingen, de milt en het peripancreasvetweefsel.
  5. Breng de voorbewerkte alvleesklier naar een plaat met 12 putjes met 2 mL collagenase P-oplossing. Houd de alvleesklier op zijn plaats met een pincet met de linkerhand en gebruik een 1 ml spuit met de rechterhand om collagenase P-oplossing in het pancreasparenchym te injecteren totdat het alvleesklierweefsel doorschijnend en oematisch lijkt.
    OPMERKING: Het volume collagenase P-oplossing voor perfusie is 600-800 μL.
  6. Snijd de alvleesklier snel in 1-2 mm³ weefselstukken met een chirurgische schaar.
    OPMERKING: De grootte van de weefselstukken is ongeveer gelijk aan de binnendiameter van een standaard pipettip van 200 μL.
  7. Snijd de distale 1-1,5 cm van een 1 mL pipettip af (om de opening te vergroten) en gebruik deze aangepaste tip om de pancreasweefselstukken samen met 2 mL collagenase P-oplossing over te brengen in een 50 mL centrifugebuis die vooraf is geladen met 3 mL collagenase P-oplossing.
  8. Incubeer de centrifugebuis in een 37 °C waterbad gedurende 12 minuten, waarbij je de buis elke 5-6 minuten zachtjes schudt gedurende deze periode.
    OPMERKING: Het doel van het schudden van de centrifugebuis is om volledig contact te garanderen tussen het alvleesklierweefsel en de collagenase P-oplossing.
  9. Voeg 10 mL RPMI-1640 complete medium toe om het spijsverteringseffect van collagenase P-oplossing te beëindigen.
  10. Pipetteer de pellet herhaaldelijk met een 5 mL Pasteur-pipet (15-20 op-en-neer slagen) totdat er geen duidelijke grote weefselklonten meer overblijven.
  11. Voeg 10 mL RPMI-1640 complete medium toe, centrifugeer dan op 180 × g gedurende 2 minuten bij 4 °C, en gooi het supernatant weg.
  12. Suspendeer de pellet opnieuw met 20 mL RPMI-1640 complete medium. Filter de suspensie door een zeef van 40 maas en centrifugeer dan op 180 × g gedurende 2 minuten bij 4 °C.
  13. Gooi het supernatant voorzichtig weg, voeg 20 mL Ficoll-oplossing toe om de pellet opnieuw te laten ophangen, en voeg langzaam 15 mL RPMI-1640 complete medium toe.
    OPMERKING: Op dit punt kan een grens van heldere vloeistof worden waargenomen.
  14. Centrifugeer zachtjes op 640 × g gedurende 20 minuten op 25 °C.
    OPMERKING: Vermijd hevig schudden tijdens centrifugatie om verstoring van de interface te voorkomen.
  15. Verwijder voorzichtig de centrifugebuis en aspireer de bovenste rode medium laag met een 5 mL Pasteur-pipet. Vervolgens aspireer je voorzichtig de vloeistof met de eilandjes aan de vloeistoflaaggrens en breng deze over in een nieuwe 50 mL centrifugebuis. Voeg 20 mL RPMI-1640 complete medium toe, centrifugeer op 180 × g gedurende 2 minuten bij 4 °C, en gooi het supernatant weg.
  16. Suspendeer de pellet opnieuw met 20 mL RPMI-1640 complete medium, centrifugeer op 180 × g gedurende 2 minuten bij 4 °C, en gooi het supernatant weg.
  17. Suspensie de pellet opnieuw met 10 mL RPMI-1640 complete medium en breng deze over in een 60 mm celkweekschaal.
  18. Onder een omgekeerde biologische microscoop (100x vergroting) wordt handmatig de eilandjes geplukt met een 20 μL pipet. Breng de geselecteerde eilandjes over naar een 24-put celkweekplaat voorgeladen met 500 μL RPMI-1640 volledig medium per put.
  19. Verwijder de Ficoll-oplossingslaag, suspendeer de pellet (vanaf stap 2.15) opnieuw met 10 mL DMEM complete medium, filter door een 100 μm celzeef, centrifugeer bij 180 × g gedurende 2 minuten bij 4 °C, en gooi het supernatant weg.
  20. Sussen de pellet opnieuw met 10 mL DMEM complete medium, centrifugeer op 180 × g gedurende 2 minuten bij 4 °C en gooi het supernatant weg. Daarna wordt de pellet opnieuw opgeëist met 5 mL DMEM complete medium voor volgende experimenten.

3. Levensvatbaarheidsdetectie van alvleeskliereilandjes en acinaire cellen

  1. Breng de geïsoleerde eilandjes en een passend aantal acinaire cellen over naar 12-well/24-well celkweekplaten met respectievelijk 1 mL RPMI-1640 volledig medium en 1 mL DMEM complete medium. Plaats de platen 15 minuten in een incubator met 37 °C, 5% CO₂-cel om in evenwicht te komen.
  2. Centrifugeer de 12-well/24-well celkweekplaten op 180 × g gedurende 30 seconden bij 25 °C. Bereid ondertussen het kleuringsreagens voor volgens de instructies van de Calcein/Propidium Jodide (Calcein/PI) Cell Viability and Cytotoxicity Assay Kit (bescherm tegen licht tijdens de voorbereiding).
  3. Verwijder het medium voorzichtig, was de eilandjes en acinaire cellen één keer met fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS), en centrifugeer dan onder dezelfde omstandigheden als stap 3.2.
  4. Verwijder het PBS en suspendeer de eilandjes en acinaire cellen opnieuw met het voorbereide kleuringsreagens. Wikkel de kweekplaat in aluminiumfolie (ter bescherming tegen licht) en incubeer in een 37 °C, 5% CO₂-cel incubator gedurende 30 minuten.
  5. Onder een lichtbeschermde omgeving maakt u beelden met een fluorescentiemicroscoop (100x vergroting) en voert u een cellevensvatbaarheidsanalyse uit met ImageJ.

4. Acinar amylase-assay

  1. Zaad de acinaire cellen in een plaat met 12 putten met een dichtheid van 1,5 × 106 cellen per put met 1 mL medium. Stel de controlecellen (Ctrl) en cerulein-gestimuleerde cellen in (10 nM, 20 nM, 50 nM; gelabeld als C10, C20, C50). Na 30 minuten stimulatie verzamel je supernatanten voor amylaseactiviteitsdetectie volgens de instructies van de fabrikant.

5. Glucose-gestimuleerde insulineafgifte-assay

  1. Zaai 10 eilandjes per put in een plaat met 24 putten. Stabiliseer de eilandjes in een volledig RPMI-1640 medium gedurende 2 uur en gooi het medium dan weg.
  2. Incubeer de eilandjes in 1 mL 5,6 mM glucoseoplossing gedurende 1 uur. Verzamel daarna het supernatantant.
  3. Was de eilandjes met KRBH-buffer. Vervolgens incubeer je de eilandjes in een glucoseoplossing van 22 mM gedurende 1 uur en verzamel je het supernatant opnieuw.
  4. Detecteer de insulineconcentraties in de twee supernatanten (uit de lage glucose en hoge glucose omstandigheden) met een Mouse INS (Insulin) ELISA Kit. Bereken de glucose-gestimuleerde insuline-index (GSI):
    GSI = Insulineconcentratie in een medium met een hoog glucosegehalte / Insulineconcentratie in een medium met een laag glucosegehalte

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Na de centrifugatie van Ficoll-oplossingsdichtheidsgradiënt werden eilandjes waargenomen nabij het grensvlak tussen de transparante kleurloze vloeistoflaag en het medium, waarbij PAC's als sediment aanwezig waren op de bodem van de buis (Figuur 1).

Onder een optische microscoop waren de eilandjes meestal rond of ovaal en goudbruin van kleur, met een stabiele opbrengst van (120 ± 5) eilandjes per muis (Figuur 2A,B). Vers geïsoleerde PAC's waren bolvormig en voornamelijk verspreid in clusters (3-8 acinaire cellen per cluster). De apicale uiteinden van de acinaire cellen waren donkerder van kleur, met duidelijk zichtbare zymogenkorrels; er werden geen granules of vesiculaire structuren rond de cellen waargenomen, en de oplossingsachtergrond was helder. De opbrengst van acinaire cellen varieerde van 1,6 tot 1,95 × 10⁷ cellen per muis [(1,77 × 107) ± (1,75 × 106)] (Figuur 2C,D).

Calcein/PI-kleuringsresultaten van eilandjes en acinaire cellen zijn te zien in Figuur 3A: Calcein-gekleurde cellen (groen) vormden het merendeel, terwijl PI-gekleurde cellen (rood) zeldzaam waren. Kwantitatieve analyse van de levende/dode kleurbeelden werd uitgevoerd met ImageJ. De resultaten toonden aan dat de levensvatbaarheidspercentages van de geïsoleerde eilandjes en acinaire cellen respectievelijk (97,52 ± 0,16)% en (96,55 ± 0,95%) % waren (Figuur 3B).

De basale amylaseactiviteit van de geïsoleerde acinaire cellen van de alvleesklier was (0,79 ± 0,01) U/mL. Na stimulatie met caeruleïne bij concentraties van 10 nM, 20 nM en 50 nM waren de amylase-activiteiten van de acinaire cellen respectievelijk (1,45 ± 0,03) U/mL, (1,65 ± 0,05) U/mL en (1,39 ± 0,02) U/mL. Eenrichtingsresultaten van ANOVA gaven aan dat vergeleken met de controlegroep (Ctrl) alle cerulein-gestimuleerde groepen significante verschillen vertoonden in amylase-activiteit (alle P < 0,001). Daarnaast werd een significant verschil in amylase-activiteit waargenomen tussen de 20 nM- en 10 nM-ceruleinegroepen (P < 0,001) (Figuur 4A).

Wanneer gestimuleerd met 5,6 mM glucoseoplossing, was de insulinesecretie van de geïsoleerde eilandjes (0,27 ± 0,04) ng/mL/eilandje/h. Wanneer gestimuleerd met 22 mM glucoseoplossing, was de insulinesecretie van de geïsoleerde eilandjes (0,94 ± 0,04 ng/mL/eilandje/uur, met een GSI van 3,44. De resultaten geven aan dat de geïsoleerde eilandjes een typische en effectieve insulinesecretierespons vertonen onder stimulatie met glucoseoplossingen van verschillende concentraties (Figuur 4B).

Leden van ons onderzoeksteam observeerden dat de hoeveelheid en kwaliteit van geïsoleerde eilandjes en acinaire cellen nauw samenhangen met de verteringstijd, die strikte controle tijdens de werking vereist en minder wordt beïnvloed door verschillende operators. Ondertussen zijn fluctuaties in opbrengst en levensvatbaarheid ook nauw verbonden met de volledige ontleding van de alvleesklier en de mechanische scheiding van alvleesklierweefsel, wat aandacht vereist tijdens de operatie.

figure-results-1
Figuur 1: Resultaten van de centrifugatie van dichtheidsgradiënt van Ficoll-oplossingen. De eilandlaag bevindt zich op de grens tussen de kleurloze, transparante vloeistoflaag en het kweekmedium. Het neerslag onderaan de centrifugebuis is PAC. Afkorting: PACs: pancreasacinaire cellen. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

figure-results-2
Figuur 2: Morfologische en kwantitatieve kenmerken van eilandjes en PAC's. (A) Morfologie van eilandjes geïsoleerd uit muizenpancreasweefsel. Schaalbalk = 100 μm. (B) Kwantitatieve analyse van het aantal eilandjes geïsoleerd uit muizenalvleesklierweefsel (n = 3). (C) Morfologie van PAC's die uit muizenpancreasweefsel zijn geïsoleerd. Schaalbalk = 100 μm. (D) Kwantitatieve analyse van het aantal PAC's geïsoleerd uit muizenalvleesklierweefsel (n = 3). Alle gegevens werden uitgedrukt als gemiddelde ± SD. Afkorting: PACs: pancreasacinaire cellen. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

figure-results-3
Figuur 3: Levensvatbaarheidsbeoordeling van eilandjes en PAC's. (A) Calcein/propidiumjodide fluorescentiekleuring voor het evalueren van de levensvatbaarheid van muiseilandjes en PAC's. Groen: levende cellen. Rood: dode cellen. Schaalbalk = 100 μm. (B) Kwantitatieve analyse van de levensvatbaarheid van eilandjes en PAC's (n = 3). Alle gegevens werden uitgedrukt als gemiddelde ± SD. Afkortingen: PAC's: pancreasacinaire cellen; PI = propidiumjodide. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

figure-results-4
Figuur 4: Beoordeling van amylaseactiviteit van PAC's en insulinesecretiecapaciteit van eilandjes. (A) Amylaseactiviteit van PACs onder stimulatie met verschillende concentraties ceruleïne (Ctrl: Controlegroep; C10, C20 en C50: De concentraties ceruleine waren 10 nM, 20 nM en 50 nM (n = 3). (B) Kwantitatieve analyse van door glucose gestimuleerde insulinesecretieconcentraties (n = 3). Alle gegevens werden uitgedrukt als gemiddelde ± SD. ***P < 0,001. Afkortingen: GSI = Glucose-gestimuleerde insuline-index; PAC's: acinaire cellen van de alvleesklier. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

In de afgelopen jaren heeft post-pancreatitis diabetes mellitus (PPDM)brede aandacht gekregen. Het onderzoeken van de moleculaire mechanismen waarmee PACs de afscheiding van eilandjeshormonen beïnvloeden in de context van AP is van groot belang.

De pathogenese van AP wordt voornamelijk geassocieerd met de overmatige activatie van alvleesklierenzymen in acinaire cellen, wat leidt tot autodigestie van alvleesklierweefsel11,12. Hoewel cellijnen zoals AR42J, 266-6 (acinaire cellijnen) en MIN6, INS-1 (β-celllijnen) momenteel beschikbaar zijn, kunnen deze in-vitro celmodellen de fysiologische complexiteit van primaire acinaire cellen en eilandjes 4,5 niet volledig repliceren. Daarom is het isoleren van primaire acinaire cellen en eilandjes cruciaal voor diepgaande studies naar de interactie tussen de exocriene en endocriene compartimenten van de alvleesklier. Momenteel zijn methoden voor isolatie van eilandjes goed gevestigd; De meeste voldoen echter niet aan de onderzoeksbehoeften om de interactie tussen eilandjes en alvleesklieracinarcellente bestuderen 6,7,8.

Dit experimentele protocol optimaliseert de alvleescrutineperfusieprocedure, verlaagt de technische drempel en stelt onderzoekers zonder gespecialiseerde training in galwegcannulatie in staat experimenten uit te voeren. Tegelijkertijd zorgt het voor de hoeveelheid en kwaliteit van geïsoleerde eilandjes en acinaire cellen, waardoor een eenvoudige en snelle methode wordt geboden voor gelijktijdige isolatie van primaire muiseilandjes en primaire pancreas-acinarcellen.

Hoewel deze methode het isolatieproces van eilandjes vereenvoudigt, vereisen belangrijke stappen nog steeds strikte controle om hoge opbrengsten en effectieve scheiding van eilandjes en acinaire cellen van de alvleesklier te waarborgen. Deze stappen omvatten voldoende alvleesklierperfusie, juiste weefselverstoornis (zorgen voor grondig fijnhakken), alvleeskliervertering (nauwkeurige controle van de verteringstijd en handmatig schudden tijdens de spijsvertering) en mechanisch pipetteren (het regelen van het aantal en de intensiteit van pipetslagen). Voor de selectie van eilandjes moeten opnieuw opgehangen eilandjes ongeveer 10 minuten in een celincubator worden gestabiliseerd om het kiezen van eilandjes efficiënter te maken.

Het is belangrijk op te merken dat tijdens de alvleesklierperfusie betere resultaten worden behaald wanneer helderdere vloeistofblaasjes worden geïnjecteerd; Het gehele alvleesklierweefsel moet volledig worden doorbloed, maar de perfusietijd moet binnen 1-2 minuten worden gecontroleerd. Als er een lage cellenlevensvatbaarheid wordt vastgesteld, pas dan de contacttijd tussen alvleesklierweefsel en collagenase P aan (inclusief perfusietijd en waterbadverteringstijd). Let daarnaast op mechanische schade tijdens isolatie – vermijd bijvoorbeeld overmatige kracht bij het verspreiden van alvleesklierweefsel. De aseptische techniek moet worden gehandhaafd tijdens de isolatie van eilandjes en acinaire cellen om besmetting te voorkomen. Voorbereide reagentia moeten door een 0,22 μm filter worden gefilterd. Het isolatieproces moet worden uitgevoerd in een bioveiligheidskast, en alle instrumenten en verbruiksmaterialen die tijdens isolatie worden gebruikt, moeten steriel zijn. De twee voorbereide complete media bevatten ook 1% penicilline-streptomycineoplossing.

Voor muisanesthesie: fixeer de nekhuid van de muis met de linkerduim en wijsvinger en ondersteun de buik met de ring- en kleine vingers (met een houding naar beneden en buik omhoog om de buikholte bloot te leggen). Houd de spuit met de rechterhand vast, steek deze onder een hoek van 30° in de huid van de onderste linkerbuik van de muis (1 cm van de lies en 0,5 cm van de middenlijn), injecteer langzaam het verdovingsmiddel en druk na het onttrekken van de naald 10 seconden met een steriel wattenstaafje op de injectieplaats om lekkage van medicijnen te voorkomen. Euthanace de muis pas door cervicale dislocatie nadat deze volledig is verdoofd.

Als je wordt geprikt door een besmette naald (blootgesteld aan muizenbloed of -weefsel) of door een muis wordt gebeten, knijp dan onmiddellijk in het gebied rond de wond bij de dichtstbijzijnde gootsteen (knijp van het proximale tot het distale uiteinde van de wond om een kleine hoeveelheid bloed te verdampen), spoel de wond continu 15 minuten af met stromend water en desinfecteer deze vervolgens met 75% ethanol of 0,5% povidonjodium.

Resultaten van acinaire cel amylaseactiviteitsassays toonden aan dat de geïsoleerde acinaire cellen van de pancreas een laag niveau van basale activatie hadden en gevoelig waren voor ceruleinestimulatie: de amylaseactiviteit nam geleidelijk toe met stijgende ceruleineconcentratie, bereikte het hoogste niveau bij 20 nM cerulein, en nam licht af bij de ceruleineconcentratie van 50 nM. De resultaten van de glucose-gestimuleerde insulinesecretietest toonden aan dat de geïsoleerde eilandjes een typische en effectieve insulinesecretierespons vertoonden onder stimulatie met glucoseoplossingen van verschillende concentraties. Deze resultaten geven aan dat de acinaire cellen en eilandjes die met dit protocol worden geëxtraheerd, geschikt zijn voor latere in-vitro experimenten.

De isolatieprocedure van eilandjes en acinaire cellen van dit experimentele protocol is eenvoudig te bedienen. Experimentele resultaten tonen aan dat de eilandjes en acinaire cellen die via dit protocol zijn geïsoleerd, een uitstekende hoeveelheid en levensvatbaarheid vertonen. Daarnaast hebben meerdere teamleden dit protocol gevalideerd met meerdere muizen; De validatieresultaten geven aan dat het een goede reproduceerbaarheid, betrouwbare data en minimale fluctuaties in celopbrengst heeft. Dit protocol kent echter ook bepaalde beperkingen. Hoewel het weinig afhankelijk is van de technische vaardigheden van de operator, vereist het toch dat de operator basiskennis heeft van de muizenanatomie om de muizenalvleesklier volledig te kunnen ontleden – dit is een vereiste voor het hele isolatieproces. Bij het tegelijkertijd isoleren van alvleesklierweefsels van meerdere muizen, moet de hoeveelheid collagenase P-oplossing en andere reagentia dienovereenkomstig worden aangepast. Daarnaast wordt gelijktijdige isolatie van meer dan twee muizen niet aanbevolen: het tijdsverschil tussen het verwerken van alvleesklierweefsels van verschillende muizen tijdens dissectie, perfusie en maalen beïnvloedt de contacttijd tussen alvleesklierweefsel en collagenase P, waardoor de efficiëntie en levensvatbaarheid van celisolatie worden verminderd. Daarom kan de grootschalige toepassing beperkt zijn. Bovendien is dit protocol niet gevalideerd bij ratten. Als je eilandjes en acinaire cellen van ratten isoleert, moeten de dosering van sommige reagentia en de verteringstijd mogelijk verder worden aangepast.

Samenvattend biedt dit experimentele protocol een eenvoudige en snelle methode voor de gelijktijdige isolatie van primaire muizeneilandjes en primaire alvleesklier-acinarcellen. Het is geschikter voor onervaren onderzoekers om isolatie van eilandjes en acinaire cellen uit te voeren, terwijl het ook een praktisch experimenteel kader biedt voor in-vitro studies naar interacties tussen exocriene en endocriene pancreas.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De auteurs hebben geen belangenconflicten om te melden.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

X.T., H.C. en J.L. droegen evenveel bij aan dit werk. Het werk werd ondersteund door de National Natural Science Foundation of China (subsidienummers 82370658, 82170657, 82370655 en 82400760) en de Natural Science Foundation van de provincie Zhejiang (subsidie nr. LGF22H030014). De auteurs bedanken bioRender (www.biorender.com) voor hun hulp bij het maken van de afbeeldingen.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
0.22 μm filterMillexSLGPR33RBFilter the prepared collagenase P solution
0.25 M Calcium chloride (Sterile)BeyotimeST365Calcium-dependent signaling pathway for activating insulin secretion
1 ml syringeJierui10084692516405Used for collagenase P perfusion into pancreatic tissue.
1.25% tribromoethanol solutionBeijing Yosida Biotechnology Co., Ltd.JT0781Anesthesia
1.5 mL Centrifuge TubeEppendorf30121589Collect the cell supernatant for centrifugation and storage.
1x Hank’s balanced salt solutionBiosharpBL561APrepare the collagenase P solution and rinse the pancreatic tissue
12-well cell culture plateSARSTEDT83.3921Hold the pancreatic tissue and the extracted acinar from culture
15 mL centrifuge tubeBeijing Labgic Technology Co., Ltd.CT-002-15AHolding solutions during the experiment
24-well cell culture plateSARSTEDT83.3922Culture the extracted islets
40-mesh  sieveWeidan InstrumentsN/AFilter pancreatic tissue
5 mL Pasteur pipetteBiosharpBS-XG-03LPipetting liquids and physically disrupting pancreatic tissue
50 mL centrifuge tubeBeijing Labgic Technology Co., Ltd.CT-002-50AHolding solutions during the experiment, containing tissues, and centrifuging
60 mm cell culture dishesBeijing Labgic Technology Co., Ltd.12211Container for holding culture medium containing islets for easy picking
75% Ethanol solutionHYNAUTN/ASoak the mice for disinfection.
Adobe Photoshop 2023Adobe Inc.N/AGenerate images.
Beckman Allegra X-12/X-12R CentrifugeBECKMANAllegra X-12/X-12RCentrifuge
Bovine serum albumin (BSA)-VSolarbioA8020Maintain the normal physiological function of islets and use (it/this) to prepare glucose solutions of different concentrations.
C57BL/6J mice, SPF-grade, 6–8 weeks old, weighing 18–25 gLaboratory Animal Center of Naval Medical University 
Calcein/PI Cell Viability and Cytotoxicity Assay KitBeyotimeC2015LDetect cell viability and cytotoxicity of animal cells based on Calcein-AM (Calcein AM) and Propidium iodide (PI) double fluorescence staining of viable and dead cells simultaneously.
Calcium chloride (anhydrous)Sangon Biotech10043-52-4Prepare the collagenase P solution
Cell strainer (100 μm)BiosharpBS-100-XBSFiltering acinar cells
Collagenase PSigma11213857001Digest pancreatic tissue
D-(+)-Glucose solution (20%, Sterile)BeyotimeST491Stimulate insulin secretion from islets.
DMEM basic (1x) (Dulbecco’s modified eagle medium)GibcoC11995500BTCulture acinar cells
Fetal bovine serum (FBS)BiowestS140B-500Prepare the culture medium
Ficoll-Paque PREMIUM sterile solutionCytiva17544203density gradient medium for density gradient stratification
GraphPad Prism 8.0.1GraphPad Software, LLCN/AGenerate images and perform statistical analysis.
HEPES solution (1 M)BiosharpBL1061APrepare the collagenase P solution
High-speed/refrigerated centrifugeSigma3K15Centrifuge
ImageJNational Institutes of Health Laboratory for Optical and Computational Instrumentation(LOCI)N/AAnalyze cell fluorescence images and calculate cell viability.
Inverted Biological MicroscopeLeicaN/AObserve the cell morphology and select the islets.
Inverted fluorescence microscopeOLYMPUSIX73Observe the cellular fluorescent signals and capture fluorescent images.
Krebs-Ringer bicarbonate HEPES bufferLEAGENECZ0103Maintain the normal physiological function of islets and use (it/this) to prepare glucose solutions of different concentrations.
Mouse INS (Insulin) ELISA KitWuhan Fine Biotech Co., Ltd.EM0260Detect the insulin secretion level of islets.
Ophthalmic forceps (10 cm, curved with hook)Qingyi Medical DevicesN/AAssist in the dissection
Ophthalmic forceps (10 cm, straight with tooth)Qingyi Medical DevicesN/AAssist in the dissection and sudden separation of pancreatic tissue and the extraction of pancreatic tissue
Penicillin streptomycin solutionGibco15140-122Prepare the culture medium to prevent contamination
RPMI-1640 medium,KeyGEN BioTECHKGL1501-500Terminate the collagenase P digestive solution and culture the islets
Trypsin inhibitor from Glycine max (soybean)SigmaT6522Prepare the collagenase P solution
Urgical scissors (10 cm, straight-pointed)Qingyi Medical DevicesN/AAssistance in anatomy and cut the pancreatic tissue into small pieces
Water BathOAICLABOW-HFMaintain the digestion temperature.
α-amylase and β-amylase activity assay kitElabscienceE-BC-K006-MDetect the levels of amylase secreted by acinar cells under different conditions

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Diabetes mellitus as a consequence of acute severe pancreatitis: unraveling the mystery. World J Diabetes. 14 (8), 1212-1225 (2023).">Manrai, M., et al. Diabetes mellitus as a consequence of acute severe pancreatitis: unraveling the mystery. World J Diabetes. 14 (8), 1212-1225 (2023).
  2. Post-acute pancreatitis diabetes: a complication waiting for more recognition and understanding. World J Gastroenterol. 29 (28), 4405-4415 (2023).">García-Compeán, D., et al. Post-acute pancreatitis diabetes: a complication waiting for more recognition and understanding. World J Gastroenterol. 29 (28), 4405-4415 (2023).
  3. Risk of diabetes mellitus after first-attack acute pancreatitis: a national population-based study. Am J Gastroenterol. 110 (12), 1698-1706 (2015).">Shen, H. N., Yang, C. C., Chang, Y. H., Lu, C. L., Li, C. Y. Risk of diabetes mellitus after first-attack acute pancreatitis: a national population-based study. Am J Gastroenterol. 110 (12), 1698-1706 (2015).
  4. Isolation of INS-1-derived cell lines with robust ATP-sensitive K⁺ channel-dependent and -independent glucose-stimulated insulin secretion. Diabetes. 49 (3), 424-430 (2000).">Hohmeier, H. E., et al. Isolation of INS-1-derived cell lines with robust ATP-sensitive K⁺ channel-dependent and -independent glucose-stimulated insulin secretion. Diabetes. 49 (3), 424-430 (2000).
  5. Cell lines derived from pancreatic islets. Mol Cell Endocrinol. 228 (1-2), 121-128 (2004).">Hohmeier, H. E., Newgard, C. B. Cell lines derived from pancreatic islets. Mol Cell Endocrinol. 228 (1-2), 121-128 (2004).
  6. A method for mouse pancreatic islet isolation and intracellular cAMP determination. J Vis Exp. (88), e50374(2014).">Neuman, J. C., Truchan, N. A., Joseph, J. W., Kimple, M. E. A method for mouse pancreatic islet isolation and intracellular cAMP determination. J Vis Exp. (88), e50374(2014).
  7. A simple high-efficiency protocol for pancreatic islet isolation from mice. J Vis Exp. (150), e57048(2019).">Villarreal, D., et al. A simple high-efficiency protocol for pancreatic islet isolation from mice. J Vis Exp. (150), e57048(2019).
  8. Effective isolation of functional islets from neonatal mouse pancreas. J Vis Exp. (119), e55160(2017).">Huang, C., Gu, G. Effective isolation of functional islets from neonatal mouse pancreas. J Vis Exp. (119), e55160(2017).
  9. Global epidemiology and holistic prevention of pancreatitis. Nat Rev Gastroenterol Hepatol. 16 (3), 175-184 (2019).">Petrov, M. S., Yadav, D. Global epidemiology and holistic prevention of pancreatitis. Nat Rev Gastroenterol Hepatol. 16 (3), 175-184 (2019).
  10. Global incidence and mortality of pancreatic diseases: a systematic review, meta-analysis, and meta-regression of population-based cohort studies. Lancet Gastroenterol Hepatol. 1 (1), 45-55 (2016).">Xiao, A. Y., et al. Global incidence and mortality of pancreatic diseases: a systematic review, meta-analysis, and meta-regression of population-based cohort studies. Lancet Gastroenterol Hepatol. 1 (1), 45-55 (2016).
  11. Cathepsin B-mediated activation of trypsinogen in endocytosing macrophages increases severity of pancreatitis in mice. Gastroenterology. 154 (3), 704-718.e10 (2018).">Sendler, M., Weiss, F. U., Golchert, J., et al. Cathepsin B-mediated activation of trypsinogen in endocytosing macrophages increases severity of pancreatitis in mice. Gastroenterology. 154 (3), 704-718.e10 (2018).
  12. Biochemical analyses of cystatin-C dimers and cathepsin-B reveals a trypsin-driven feedback mechanism in acute pancreatitis. Nat Commun. 16 (1), 1702(2025).">Modenbach, J. M., Möller, C., Asgarbeik, S., et al. Biochemical analyses of cystatin-C dimers and cathepsin-B reveals a trypsin-driven feedback mechanism in acute pancreatitis. Nat Commun. 16 (1), 1702(2025).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Primary Islet IsolationPancreatic Acinar CellsFicoll Density GradientCollagenase P DigestionMouse Pancreas IsolationCell Sieve FiltrationGlucose Stimulated Insulin SecretionCalcein PI StainingAmylase Activity DetectionExocrine Endocrine Interaction

Related Articles