Methodenartikel

Detectie van doelgerichte veranderingen bij niet-kleincellige longkanker met behulp van sequencing van de volgende generatie

DOI:

10.3791/69091

⸱

10 oktober 2025

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Pathology, State Key Laboratory of Molecular Oncology, National Cancer Center/National Clinical Research Center for Cancer/Cancer Hospital, Chinese Academy of Medical Sciences and Peking Union Medical College, 2Department of Education, National Cancer Center/National Clinical Research Center for Cancer/Cancer Hospital, Chinese Academy of Medical Sciences and Peking Union Medical College

* These authors contributed equally

In dit artikel

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dit protocol beschrijft een geautomatiseerde, door de ISO15189 geaccrediteerde sequencing-workflow van de volgende generatie voor het detecteren van doelgerichte genomische veranderingen in niet-kleincellige longkanker (NSCLC) in formaline gefixeerde, in paraffine ingebedde weefsels.

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Het succes van gerichte therapie bij niet-kleincellige longkanker (NSCLC) hangt af van de nauwkeurige identificatie van driververanderingen, waaronder mutaties, genfusies en amplificaties. Next-generation sequencing (NGS) is naar voren gekomen als een uitgebreid moleculair diagnostisch hulpmiddel, dat in staat is om zowel bekende als nieuwe genomische afwijkingen te detecteren en cruciale ondersteuning te bieden voor gepersonaliseerde NSCLC-behandeling. NGS blijft echter een complexe en technisch uitdagende methode. Ondanks de wijdverbreide acceptatie staat NGS nog steeds voor enkele uitdagingen, waaronder technische complexiteit en langere doorlooptijden. Hier wordt de ISO15189-gecertificeerde NGS-workflow geïntroduceerd die in het klinische laboratorium is geïmplementeerd. Het gestandaardiseerde protocol omvatte beoordeling van de cellulariteit van tumoren (≥20%), DNA-extractie uit in formaline gefixeerde, in paraffine ingebedde (FFPE) weefsels (DNA-invoer ≥ 50 ng), geautomatiseerde bibliotheekvoorbereiding en bio-informatica-analyse. Door bij elke stap strenge kwaliteitscontrolemaatregelen (QC) te integreren, zorgt de workflow voor een hoge betrouwbaarheid van de gegevens. Bovendien was de belangrijkste innovatie in de workflow de automatisering van de bouw van NGS-bibliotheken. Het geautomatiseerde systeem van NGS-bibliotheekconstructie omvatte eindreparatie, A-tailing, adapterligatie, hybridisatie-opname en zuivering, waardoor menselijke fouten effectief werden geminimaliseerd, de experimentele reproduceerbaarheid werd verbeterd, de hands-on tijd werd verkort en de efficiëntie werd verbeterd. De ervaring leert dat rigoureuze QC en geautomatiseerde bibliotheekvoorbereiding essentieel zijn voor het behoud van nauwkeurigheid en schaalbaarheid bij klinische NGS-tests. Deze geoptimaliseerde aanpak zorgt niet alleen voor naleving van ISO15189 normen, maar ondersteunt ook de groeiende vraag naar precisie-oncologie in de behandeling van NSCLC.

Inleiding

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Niet-kleincellige longkanker (NSCLC) is verantwoordelijk voor 75%-85% van alle gevallen van longkanker, wat zowel een klinische prioriteit als een therapeutische uitdaging vertegenwoordigt 1,2,3. In de afgelopen jaren, met de succesvolle ontwikkeling en klinische toepassing van moleculair gerichte geneesmiddelen zoals epidermale groeifactorreceptortyrosinekinaseremmers (EGFR-TKI's), is de behandeling van gevorderde NSCLC het tijdperk van gepersonaliseerde precisietherapieën ingegaan 4,5,6. Gerichte therapie biedt nauwkeurige werkzaamheid, hoge specificiteit en minimale bijwerkingen 7,8. Deze verschuiving in de behandeling heeft tegelijkertijd de vraag naar moleculaire diagnostische technologieën doen toenemen.

Momenteel is uitgebreid tumorgericht testen een onmisbaar onderdeel van de klinische praktijk geworden dat kan helpen bij het ophelderen van nauwkeurige genetische mutatieprofielen en zo een betrouwbare basis biedt voor daaropvolgend gericht medicijngebruik, monitoring van resistentie tegen geneesmiddelen en prognosebeoordeling voor patiënten. Met name op NGS gebaseerde multi-gentesten, waarbij gebruik wordt gemaakt van technische voordelen met een hoge doorvoer en hoge gevoeligheid, is al aanbevolen voor klinische toepassing 9,10,11,12.

In vergelijking met traditionele moleculaire diagnostische technieken vertoont NGS baanbrekende voordelen. Het belangrijkste voordeel van NGS ligt in de mogelijkheid om een hoge doorvoer te maken. Het maakt de gelijktijdige detectie van meerdere genen mogelijk, waaronder zowel bekende als onbekende genetische veranderingen 13,14. Ondertussen bereikt NGS uitgebreide tests in één run, waardoor de kosten, het monsterverbruik en de doorlooptijd van het testen relatief worden verlaagd15,16. Gezien deze voordelen wordt NGS in toenemende mate toegepast in de klinische praktijk. De processen van NGS zijn echter complex, waaronder beoordeling van tumorcellulariteit, nucleïnezuurextractie, geautomatiseerde bibliotheekvoorbereiding en bio-informatica-analyse. De kwaliteit van de initiële monsterverwerking heeft een directe invloed op de prestaties van latere bio-informaticaanalyses17. Vooral de voorbereiding van bibliotheken omvat een reeks stappen om ruwe nucleïnezuurmonsters om te zetten in gestandaardiseerde bibliotheken die compatibel zijn met sequencing-instrumenten. De voorbereiding van de bibliotheek omvat fragmentatie, eindreparatie, ligatie van adapters en PCR-amplificatie18. Dit complexe proces introduceert vaak verschillende technische vooroordelen: fragmentatie kan bijvoorbeeld leiden tot de ondervertegenwoordiging van heterochromatineregio's; De substraatvoorkeur van ligase tijdens het afbinden van de adapter kan leiden tot het verlies van bepaalde sequenties; en PCR-amplificatie heeft de neiging om een ongelijke dekking te veroorzaken in regio's met een extreem GC-gehalte19. Deze systemische vertekeningen verminderen niet alleen de kwaliteit van de sequentiegegevens, maar kunnen ook leiden tot verkeerde conclusies in latere bio-informaticaanalyses. Daarom is het opzetten van een rigoureus QC-systeem essentieel om de betrouwbaarheid en consistentie van experimentele resultaten te garanderen.

Om deze langdurige technische uitdagingen aan te gaan, heeft het laboratorium een volledig geautomatiseerd NGS-systeem ingevoerd. Het systeem is ontworpen om de handmatige verwerkingstijd te verkorten en de totale doorlooptijden te verkorten. Het bevat programmeerbare protocollen om zowel operationele flexibiliteit als verwerkingsprecisie te garanderen, terwijl geïntegreerde modules en eenheden worden gebruikt om mogelijke technische vooroordelen bij elke stap effectief te minimaliseren. Bovendien verbetert deze geautomatiseerde oplossing niet alleen de reproduceerbaarheid en doorvoer van de bibliotheekvoorbereiding, maar, nog belangrijker, zorgt het ervoor dat de sequentiegegevens de moleculaire samenstelling van de originele monsters nauwkeuriger weerspiegelen. Hier wil het laboratorium het systeem introduceren door de detectie van driververanderingen met behulp van op DNA gebaseerde NGS.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Het protocol kreeg een IRB-ontheffing voor geanonimiseerde archiefmonsters.

1. Pre-teststappen en QC

  1. Registreer monsterinformatie in het laboratoriuminformatiebeheersysteem (tabel 1). Vul het formulier voor geïnformeerde toestemming in voor het testen van genmutaties.
  2. Ontvang NSCLC FFPE-monster. Zorg ervoor dat het monster dat voor het testen wordt gebruikt, een paraffineweefselmonster is dat niet langer dan 2 jaar is bewaard. Zorg ervoor dat de monsters worden verwerkt en opgeslagen volgens de standaard pathologische methoden.
    OPMERKING: Deze studie richt zich voornamelijk op de methodologische workflow, in plaats van het uitvoeren van een grootschalige klinische analyse. Daarom werd voor deze fase van het onderzoek geen specifieke eis gesteld aan het aantal monsters.
  3. Snijd secties met behulp van wegwerpmicrotoommesjes. Vervang de messen, pincetten en microbuisjes van 1,5 ml tussen de monsters om kruisbesmetting te voorkomen en vermijd het introduceren van door de gebruiker afgeleide verontreinigingen (bijv. haar, huidcellen, speeksel).
    OPMERKING: Grote steekproefgrootte (≥ 0,5 cm x 0,5 cm) 6-10 μL, vijf vellen; kleine steekproefgrootte (< 0,5 cm x 0,5 cm) en prikmonsters, 6-10 μL, 10 vellen.
  4. Voer routinematige hematoxyline-eosine (HE)-kleuring uit om de tumorcelinhoud te evalueren.
  5. Selecteer monsters met ≥20% kwaadaardige tumorcellen voor stroomafwaartse analyse. De tumorinhoud wordt door pathologen beoordeeld op HE-glas-in-looddia's20.
    OPMERKING: Als het tumorgehalte minder dan 20% is, schraap dan onder begeleiding van de gemarkeerde tumorgebieden op het HE-objectglaasje het overeenkomstige tumorweefselgebied eraf. Dit proces zorgt voor verrijking van tumorweefsel door omliggende niet-neoplastische componenten effectief te verwijderen, waardoor het percentage tumorcellen in het verzamelde materiaal aanzienlijk wordt verhoogd.
  6. Voer nucleïnezuurextractie uit met behulp van een geautomatiseerd zuiveringssysteem zoals hieronder beschreven.
    1. Snijd het FFPE-blok met behulp van een microtoom om een lint te verkrijgen. Plaats het lint in een microcentrifugebuisje van 1,5 ml. Breng het lint over naar de aangewezen monsterinvoerlocatie op het geautomatiseerde extractie-instrument.
    2. Gebruik een automatisch extractie-instrument met een automatische extractiekit en vervang handmatig pipetteren door een automatisch nucleïnezuurextractiesysteem met magnetische parel.
      OPMERKING: Het automatiseren van deze stap helpt bij het garanderen van automatische extractie om zeer nauwkeurige en reproduceerbare DNA-productie te garanderen voor downstream NGS-toepassingen.
    3. Raadpleeg de instructies van de volautomatische nucleïnezuurreiniger en het nucleïnezuurextractiereagens om nucleïnezuur te extraheren.
    4. Selecteer vervolgens het C1102-programma, kies de incubatietijd van het monster voor het verwijderen van was als 16 uur en het elutievolume als 100 μL.
      OPMERKING: Als de geëxtraheerde DNA-oplossing niet onmiddellijk wordt getest, mag deze niet langer dan 6 maanden bij -20 °C worden bewaard.
  7. Beoordeel de kwaliteit van nucleïnezuren (tabel 2) zoals hieronder beschreven.
    1. Gebruik agarosegelelektroforese om de grootte van het DNA-fragment te bepalen. Gebruik Agilent2100 en andere microfluïdische capillaire elektroforese-analysesystemen voor monsters met een lage input.
    2. Los 1 g agarose op in 100 ml TAE-oplossing. Verwarm het mengsel in een waterbad tot het transparant is. Koel de oplossing af tot ongeveer 60 °C.
    3. Sluit aan op de positieve elektrode (rood) op het elektroforese-instrument. Voer minpool (zwart) uit naar spanning 180 V, laat 15 min21,22 draaien.
    4. Volgens de resultaten van agarosegelelektroforese, categoriseert u de fragmentgroottes in vier niveaus (AD; Tabel 3) en selecteer het nucleïnezuur van de niveaus A-C voor volgende bewerkingen.
    5. Gebruik spectrofotometrie om de zuiverheid te verifiëren. Zorg voor een OD260/OD280 > 1.8; OD260/OD230 > 2.0 om aanvaardbare verontreinigingsniveaus23,24 aan te geven.
    6. Gebruik een detectiekit (Tabel met materialen) op basis van sequentiespecifieke fluorescerende kleurstoffen voor fluorometrische tests om de DNA-concentratie nauwkeurig te meten.
    7. Voeg 1 μL te testen DNA toe aan 199 μL werkoplossing, meng vervolgens, centrifugeer kort en meet de concentratie met behulp van een fluorometer (Materiaaltabel).

2. Voorbereiding van de bibliotheek en QC (Figuur 1)

  1. Bereid fragment genomisch DNA voor met behulp van ultrasone trillingen (materiaaltabel) zoals hieronder beschreven.
    1. Meng 200 ng genomisch DNA in 50 μL lage Tris-EDTA (TE) buffer. Bewaar het monsterbuisje vervolgens in een voorgekoeld (8 °C) monsterrek.
    2. Stel de instrumentparameter in volgens tabel 4. Start vervolgens fragmentatie.
    3. Gebruik agarosegelelektroforese om het fragmentatie-effect te verifiëren. Deze stap genereert DNA-fragmenten met beschadigde uiteinden die aan de uiteinden moeten worden gerepareerd om ze om te zetten in stompe uiteinden voor volgende stappen.
  2. Voer de eindreparatie en toevoeging van A bij 3' uit zoals hieronder beschreven.
    1. Repareer de beschadigde uiteinden van FFPE-DNA met enzymen om platte uiteinden te vormen, waardoor 3'-OH en 5'-P worden gegarandeerd. Voeg A toe aan de afgeplatte dubbelstrengs 3'-uiteinden.
    2. Bereid het ERA-mengsel voor door 7 μL eindreparatiebuffer en 3 μL eindreparatie-enzym toe te voegen, schud voorzichtig handmatig 3x-5x en centrifugeer gedurende 1-3 s.
    3. Voeg ERA-mengsel toe aan 50 μL gebroken DNA-monster, meng voorzichtig en centrifugeer gedurende 1-3 s.
    4. Plaats het in het PCR-instrument en selecteer het ERA-programma (20 °C gedurende 30 min; 65 °C gedurende 30 min; 4 °C vasthouden; Deksel 85 °C). Voer de volgende handeling binnen 2 uur uit.
  3. Voer de ligatie van de adapter uit zoals hieronder beschreven.
    1. Bereid de LIG-mix van het reactiesysteem voor door 30 μl ligatiebuffer, 10 μl DNA-ligase en 10 μl DNA-adapter toe te voegen. Veeg vervolgens lichtjes handmatig 3x-5x en centrifugeer gedurende 1-3 s.
    2. Voeg 50 μL LIG-mengsel toe aan het 60 μL product van de vorige stap, meng voorzichtig en centrifugeer vervolgens gedurende 1-3 s.
    3. Plaats het mengsel in een PCR-instrument en selecteer vervolgens het LIG-programma (20 °C gedurende 15 minuten zonder het deksel te verwarmen; 70 °C gedurende 10 minuten (verwarmingsdeksel); 4 °C vasthouden; Deksel 85 °C).
  4. Voer magnetische parelzuivering uit.
    1. Neem 1,5 ml centrifugebuis met lage adsorptie en voeg 88 μl gehomogeniseerde magnetische kralen en 110 μl adapter-geligeerd product toe. Draai en meng goed, en incubeer 5 minuten bij kamertemperatuur.
    2. Centrifugeer het geïncubeerde monster onmiddellijk 1-3 s en plaats de centrifugebuis op een magnetisch rek. Wacht tot de oplossing is verdwenen (ongeveer 3-5 minuten).
    3. Met de buis op de magneet bevestigd, opent u de dop en zuigt u het geklaarde bovenstaande middel voorzichtig op met behulp van een pipet zonder de kralenkorrel te verstoren.
    4. Houd de buis op de magneet en voeg 300 μL vers bereide 75% ethanol toe aan elke buis.
    5. Wacht 1 minuut om de magnetische kralen volledig te laten bezinken. Draai de centrifugebuis langzaam één keer horizontaal om ethanol te absorberen.
    6. Herhaal stap 2.4.4 en 2.4.5 één keer, voor een totaal van 2x.
    7. Voer onmiddellijke centrifugatie uit gedurende 1-3 s, plaats de buis terug in het magnetische rek en wacht 30 s. Gebruik een pipet om eventuele resterende ethanol te verwijderen en houd het buisdeksel open.
    8. Droog de magnetische kralen 2 minuten bij kamertemperatuur totdat het kralenoppervlak er mat uitziet en geen scheuren vertoont.
    9. Elueer het ligatieproduct met 28 μL elutiebuffer (EB).
      OPMERKING: Magnetische kralen moeten voor gebruik ten minste 30 minuten bij kamertemperatuur worden geëquilibreerd.
  5. Versterk en zuiver de pre-bibliotheek zoals hieronder beschreven.
    1. Bereid het voormengsel van het reactiesysteem voor door 10 μl PCR-buffer, 10 μl PCR-primers, 1,5 μl dNTP-mix en 1 μl PCR-enzym toe te voegen. Tik voorzichtig handmatig 3x-5x en centrifugeer gedurende 1-3 s.
    2. Voeg 22,5 μL voormengsel toe aan 27,5 μL van het gezuiverde product uit de vorige stap, meng voorzichtig en centrifugeer vervolgens gedurende 1-3 s.
    3. Selecteer het programma PRE: 98 °C 45 s; (98 °C 15 s, 60 °C 30 s, 72 °C 30 s) 12 cycli; 72 °C 2 min; 4 °C vasthouden; Deksel 105 °C.
    4. Nadat het PCR-programma is voltooid, voert u magnetische parelzuivering uit met vers bereide 75% ethanol. Eluteer het product met 18 μL EB.
  6. Leg hybride vast zoals hieronder beschreven.
    1. Bereid reactiesysteem A voor door 15 μL pre-bibliotheek en 4 μL blocker-mix toe te voegen.
    2. Plaats op PCR en voer het PCR-programma HYB uit (95 °C gedurende 5 min; 65 °C Hold; Deksel 105 °C).
    3. Bereid het reactiesysteem B HYB-mengsel voor door 10 μL hybridisatiebuffer, 0,5 μL RNase-remmerblokker en 1 μL sonde toe te voegen. Veeg voorzichtig 3x-5x en centrifugeer gedurende 1-3 s.
      OPMERKING: De naam van de sonde is LCOO1 en de sondegenen omvatten EGFR, KRAS, BRAF, ALK, ENZ.
    4. Wanneer de temperatuur van het PCR-instrument daalt tot 65 °C, voegt u 11,5 μL HYB-mengsel toe aan reactiesysteem A, mengt u voorzichtig, bedek u het deksel van het PCR-instrument en gaat u door met de incubatie gedurende 16-24 uur.
    5. Incubeer wasbuffer 2 in een conische buis van 15 ml met een metalen verwarmer bij 65 °C met een dosering van 600 μl per monster.
    6. Haal SCB magnetische kralen op, keer om en meng 5x, vortex gedurende 10 s en balanceer bij kamertemperatuur gedurende 30 minuten. Vortex gedurende 10 s, breng 25 μL over naar een centrifugebuis van 1,5 ml met lage adsorptie, plaats deze 3 minuten op een magnetisch rek en gooi het supernatant weg.
    7. Voeg 200 μL Beads Wash Buffer toe aan de 25 μL SCB magnetische kralen, vortex en meng gedurende 3 s, centrifugeer even gedurende 1-3 s, laat 3 minuten op het magnetische rek staan en gooi het supernatant weg.
    8. Herhaal stap 2.6.7 2x, in totaal drie keer.
    9. Voeg 200 μL wasbuffer voor kralen toe aan de magnetische kralen, vortex en meng gedurende 3 s, suspendeer opnieuw voor later gebruik.
    10. Breng ongeveer 30 μL van het hybride monster over naar geresuspendeerde SCB magnetische kralen, vortex en meng, plaats op een roterende mixer, incubeer 30 minuten bij kamertemperatuur en centrifugeer gedurende 1-3 s.
    11. Plaats de mengselbuis gedurende 3 minuten op een magnetisch rek en zuig vervolgens ongeveer 230 μL supernatant op. Voeg 500 μL wasbuffer 1 toe, vortex gedurende 5 s, plaats op een roterende mixer en incubeer vervolgens 15 minuten bij kamertemperatuur. Onmiddellijke centrifuge gedurende 1-3 s.
    12. Plaats de magnetische buis van het kralenmonster op een magnetisch rek en laat deze 3 minuten staan. Zuig vervolgens ongeveer 500 μl boven- en restvloeistof op.
    13. Verwarm 150 μL wasbuffer 2 voor op 65 °C, vortex gedurende 10 s, plaats op een mixer met constante temperatuur, schud en incubeer op 65 °C gedurende 10 minuten met een snelheid van 600 tpm. Voer onmiddellijke centrifugatie uit gedurende 1-3 s, plaats deze gedurende 3 minuten op een magnetisch rek en zuig ongeveer 150 μL supernatans en restvloeistof op.
    14. Herhaal stap 2.6.13 3x, in totaal vier keer.
    15. Centrifugeer onmiddellijk gedurende 1-3 s om eventuele resterende vloeistof uit de monsterbuis te verwijderen. Voeg 20 μL EB toe, meng 8x-10x op en neer, meng goed en plaats op ijs voor later gebruik.
  7. Voorbereiding en zuivering van de uiteindelijke bibliotheek.
    1. Bereid het POST-mengsel van het reactiesysteem voor door 25 μL versterkingsmix, 5 μL index en 20 μL magnetische kralenbibliotheek toe te voegen. Tik zachtjes 3x-5x en centrifugeer gedurende 1-3 s. Meng voorzichtig, centrifugeer gedurende 1-3 s.
    2. Kies programma POST: 98 °C 45 s; (98 °C 15 s, 60 °C 30 s, 72 °C 30 s) 12 cycli; 72 °C 10 min; 4 °C vasthouden; Deksel 105 °C.
    3. Nadat het PCR-programma is voltooid, voert u magnetische parelzuivering uit met vers bereide 75% ethanol. Eluteer de uiteindelijke bibliotheek met 20 μL EB.

3. Volledig geautomatiseerde bibliotheekvoorbereiding (Tabel 5)

  1. Druk op de aan/uit-knop om het systeem te activeren en wacht op initialisatie. Navigeer naar Programma-instelling en selecteer Protocol uitvoeren en selecteer vervolgens Protocol: Burning Rock HS.
  2. Stel de aliquot QC-parameters in als Voorbeeldtype: DNA van hoge kwaliteit; Input Hoeveelheid (ng): 50; Pre-PCR-cycli: 12; Post-PCR-cycli: 12. Klik op UITVOEREN.
  3. Plaats de voorverpakte reagenscartridge in de daarvoor bestemde sleuf (valideert automatisch de plaatsing en status van het reagens).
  4. Druk na het laden van samples op Start om het systeem autonoom te laten werken. Let op LED-indicatoren om de voortgang te volgen.
  5. Nadat het programma is afgelopen, klikt u op OK en het programma brengt de uiteindelijke bibliotheek automatisch over naar de bibliotheekbuis, waardoor de bibliotheekvoorbereiding wordt voltooid.

4. Sequencing en QC

  1. Voer kwantificering en QC van de bibliotheek uit zoals hieronder beschreven.
    1. Meet de pre-bibliotheek en de totale bibliotheekconcentratie met behulp van fluorometrie.
    2. Detecteer de fragmentgrootte van de bibliotheek. Gebruik een kit om de fragmentgrootte van de bibliotheek en de aanwezigheid van adapters te beoordelen (Materiaaltabel).
      OPMERKING: Als de uiteindelijke bibliotheek primerdimeren bevat, moet een extra zuiveringsstap worden toegevoegd voordat de monsters op de machine worden gemengd. De gekwalificeerde norm voor het invoegen van fragmenten is ≥ 150 bp en de verwachte afvangefficiëntie is ≥ 40%.
    3. Verdun de sequencingbibliotheek tot 1,6 pM en 1300 μL voor sequencingbewerkingen.
  2. Voer een sequentiebepaling van de omgeving uit zoals hieronder beschreven.
    1. Regel de sequencing-omgeving, inclusief binnentemperatuur (19-25 °C), luchtvochtigheid binnenshuis (20%-80%).
    2. Volledige QC van de uitvoergegevens van het instrument, inclusief basis boven Q30 en het doorlaatfilter voor clusterdichtheid (PF).

5. Sequencing data-analyse en QC

  1. Voer ruwe gegevensverwerking en moleculaire profilering uit zoals hieronder beschreven.
    1. Gebruik Burrows-Wheeler Aligner (versie 0.7.10) om de sequentiegegevens uit te lijnen met hg19.
    2. Voer lokale uitlijning, optimalisatie, duplicatiemarkering en het aanroepen van varianten uit met behulp van Genome Analysis Tool Kit (versie 3.2) en Vardict (versie 1.5.1).
    3. Filter varianten met behulp van de VarScan (versie 2.4.3) fpfilter-pijplijn en verwijder loci met een diepte van minder dan 50. Classificeer en sluit varianten met een populatiefrequentie van meer dan 0,1% uit in de ExAC-, 1000 Genomes-, dbSNP- of ESP6500SI-V2-databases als single nucleotide polymorphisms (SNP's).
    4. Annoteer de resterende varianten met behulp van SnpEff (versie 3.6).
    5. Analyseer structurele varianten (SV's), inclusief grote genomische herschikkingen (LGR's), met behulp van MarkSV (Burning Rock-algoritmetool). Analyseer copy number variants (CNV's) op basis van de diepte van de dekkingsgegevens van opname-intervallen.
    6. Correcte dekkingsgegevens voor sequentievertekeningen als gevolg van het guanine-cytosinegehalte en het ontwerp van de sonde.
  2. Beoordeel de kwaliteit van het monster, inclusief gemiddelde diepte, mediane diepte, unieke diepte, invoeggrootte, lib-complexiteit, dekking, Q30-ratio en gepaarde samplecorrelatieverhouding zoals beschreven in25.
  3. Controleer voor het genereren van rapporten de pijplijnversie en parameters om de beoordeling van de bio-informatica te voltooien. Gebruik relevante richtlijnen om de pathogeniteit van mutaties te evalueren 26,27. Eindverslag uitbrengen.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Met behulp van een geautomatiseerde NGS-analyseworkflow met strenge kwaliteitscontroles voerde het laboratorium uitgebreide genomische profilering van NSCLC-monsters uit. De geoptimaliseerde detectieworkflow (Figuur 2) identificeerde op betrouwbare wijze verschillende klinisch bruikbare genomische veranderingen in representatieve tumormonsters (Figuur 3).

De sequencingresultaten toonden een hoogfreque...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Elk gekwalificeerd NGS-rapport ligt ten grondslag aan een rigoureus proces, dat complex en tijdrovend blijft28. Om deze problemen aan te pakken, ontwikkelde het laboratorium een volledig geautomatiseerd NGS-systeem. Deze bewerking vermindert handmatige interventie aanzienlijk, minimaliseert experimentele fouten en verkort de doorlooptijd aanzienlijk. Daarom heeft dit systeem gezorgd voor een betrouwbaardere en efficiëntere strategie voor NGS, waardoor een nieuwe k...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De auteurs hebben geen belangenconflicten te onthullen.

Dankbetuigingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Deze studie werd ondersteund door subsidies van de Beijing Natural Science Foundation van de Volksrepubliek China (7252122), Beijing Xisike Clinical Oncology Research Foundation van de Volksrepubliek China (Y-HS202402-0021), het Residency Training Teaching Research Fund van het Cancer Hospital, de Chinese Academie van Medische Wetenschappen en Peking Union Medical College (E2025004), en de National High Level Hospital Clinical Research Funding (2025-LYZX-R-B03).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
 Agilent  High Sensitivity DNA Kit Agilent5067-4626Voor gebruik met het  Agilent 2100 Bioanalyzer System
 Agilent DNA 1000 Reagents Kit Agilent5067-1504Voor gebruik met het  Agilent 2100 Bioanalyzer System
Agilent 2100 BioanalyzerAgilentG2939ABeoordeel de fragmentgrootte van de bibliotheek en de aanwezigheid van adapters. 
Concert Volledig automatisch nucleïnezuur zuiveringsinstrumentCONCERTMC1002Gebaat voor DNA-extractie
Equalbit 1×dsDNA HS Assay KitVazymeEQ121-02-AAVoor gebruik met de  Qubit 3.0 Fluorometer
Human EGRR/KRAS/BRAF/ALK genmutatie gecombineerde detectiekitBurning RockBR-LC00102bibliotheekconstructie
Magnis BRAgilent TechnologiesG7595AAAutomatische NGS bibliotheekvoorbereiding
ME220 Focused-ultrasonicatorCovaris500396ultrasone behandeling
NanoDrop One/OneCThermo FisherND-ONE-WVolle golflengte UV zichtbare spectrofotometrische detectie
NextSeq 550DxIllumina20005715sequence
NSQ 500/550 Hi Output KT v2.5(300CYS)Illumina20024908Voor gebruik met de NextSeq 550Dx
Nucleïnezuur extractiereagensCONCERTRC1102Gebaat voor DNA-extractie
Qubit 3.0 FluorometerLifeQ33216Gebaat voor nucleïnezuur of bibliotheekconcentratie detectie
Qubit dsDNA HS Assay KitLifeQ32851Voor gebruik met de  Qubit 3.0 Fluorometer

Referenties

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Feng, R. M., Zong, Y. N., Cao, S. M., Xu, R. H. Current cancer situation in China: Good or bad news from the 2018 global cancer statistics. Cancer Commun (Lond). 39 (1), 22(2019).
  2. Siegel, R. L., Kratzer, T. B., Giaquinto, A. N., Sung, H., Jemal, A. Cancer statistics, 2025. CA Cancer J Clin. 75 (1), 10-45 (2025).
  3. Sung, H., et al. Global cancer statistics 2020: Globocan estimates of incidence and mortality worldwide for 36 cancers in 185 countries. CA Cancer J Clin. 71 (3), 209-249 (2021).
  4. Fukuoka, M., et al. Multi-institutional randomized phase II trial of gefitinib for previously treated patients with advanced non-small-cell lung cancer. J Clin Oncol. 41 (6), 1162-1171 (2023).
  5. Kris, M. G., et al. Efficacy of gefitinib, an inhibitor of the epidermal growth factor receptor tyrosine kinase, in symptomatic patients with non-small cell lung cancer: A randomized trial. JAMA. 290 (16), 2149-2158 (2003).
  6. Zhou, C., et al. Erlotinib versus chemotherapy as first-line treatment for patients with advanced EGFR mutation-positive non-small-cell lung cancer (OPTIMAL, CTONG-0802): A multicentre, open-label, randomised, phase 3 study. Lancet Oncol. 12 (8), 735-742 (2011).
  7. Wu, K., House, L., Liu, W., Cho, W. C. Personalized targeted therapy for lung cancer. Zhongguo Fei Ai Za Zhi. 16 (8), C21-C34 (2013).
  8. Sharma, S. V., Settleman, J. Oncogenic shock: Turning an activated kinase against the tumor cell. Cell Cycle. 5 (24), 2878-2880 (2006).
  9. Kumar, S. S., et al. High early growth response 1 (EGR1) expression correlates with resistance to anti-EGFR treatment in vitro and with poorer outcome in metastatic colorectal cancer patients treated with cetuximab. Clin Transl Oncol. 19 (6), 718-726 (2017).
  10. Li, D., et al. Status of 10 targeted genes of non-small cell lung cancer in Eastern China: A study of 884 patients based on NGS in a single institution. Thorac Cancer. 11 (9), 2580-2589 (2020).
  11. Wen, S., et al. Genomic signature of driver genes identified by target next-generation sequencing in Chinese non-small cell lung cancer. Oncologist. 24 (11), e1070-e1081 (2019).
  12. Tan, N., Li, Y., Ying, J., Chen, W. Histological transformation in lung adenocarcinoma: Insights of mechanisms and therapeutic windows. J Transl Int Med. 12 (5), 452-465 (2024).
  13. Coco, S., et al. Next generation sequencing in non-small cell lung cancer: New avenues toward personalized medicine. Curr Drug Targets. 16 (1), 47-59 (2015).
  14. Yang, X., et al. The molecular and cellular choreography of early mammalian lung development. Med Rev. 4 (3), 192-206 (2024).
  15. Wang, R., Wang, G., Zhang, N., Li, X., Liu, Y. Clinical evaluation and cost-effectiveness analysis of serum tumor markers in lung cancer. Biomed Res Int. 2013, 195692(2013).
  16. McGinn, S., Gut, I. G. DNA sequencing-spanning the generations. Nat Biotechnol. 30 (4), 366-372 (2013).
  17. Larson, N. B., Oberg, A. L., Adjei, A. A., Wang, L. A clinician's guide to bioinformatics for next-generation sequencing. J Thorac Oncol. 18 (2), 143-157 (2023).
  18. McCombie, W. R., McPherson, J. D., Mardis, E. R. Next-generation sequencing technologies. Cold Spring Harb Perspect Med. 9 (11), a036798(2019).
  19. Van Dijk, E. L., Jaszczyszyn, Y., Thermes, C. Library preparation methods for next-generation sequencing: Tone down the bias. Exp Cell Res. 322 (1), 12-20 (2014).
  20. Rao, W., et al. Potential unreliability of ALK variant allele frequency in the efficacy prediction of targeted therapy in NSCLC. Front Med. 17 (3), 493-502 (2023).
  21. Koontz, L. Agarose gel electrophoresis. Methods Enzymol. 529, 35-45 (2013).
  22. Holmes, D. L., Stellwagen, N. C. Electrophoresis of DNA in oriented agarose gels. J Biomol Struct Dyn. 7 (2), 311-327 (1989).
  23. Liu, D., et al. Quality control of next-generation sequencing-based in vitro diagnostic test for onco-relevant mutations using multiplex reference materials in plasma. J Cancer. 9 (9), 1680-1688 (2018).
  24. Zhang, C., et al. An improved NGS library construction approach using DNA isolated from human cancer formalin-fixed paraffin-embedded samples. Anat Rec (Hoboken). 302 (6), 941-946 (2019).
  25. Wood, D. E. National comprehensive cancer network (NCCN) clinical practice guidelines for lung cancer screening. Thorac Surg Clin. 25 (2), 185-197 (2015).
  26. Chinese Society of Pathology Quality Control, Chinese Medical Association Chinese Society of Oncology, China Anti-Cancer Association Chinese Society of Lung Cancer, Chinese Thoracic Oncology Group. Guidelines on clinical practice of molecular tests in non-small cell lung cancer in China. Zhonghua Bing Li Xue Za Zhi. 50 (4), 323-332 (2021).
  27. Rao, W., et al. Developing an effective quality evaluation strategy of next-generation sequencing for accurate detecting non-small cell lung cancer samples with variable characteristics: A real-world clinical practice. J Cancer Res Clin Oncol. 149 (8), 4889-4897 (2023).
  28. Hutchins, R. J., et al. Practical guidance to implementing quality management systems in public health laboratories performing next-generation sequencing: Personnel, equipment, and process management (Phase 1). J Clin Microbiol. 57 (8), e00261-e00319 (2019).
  29. Haile, S., et al. Automated high throughput nucleic acid purification from formalin-fixed paraffin-embedded tissue samples for next generation sequence analysis. PLoS One. 12 (6), e0178706(2017).
  30. Larguinho, M., et al. Development of a fast and efficient ultrasonic-based strategy for DNA fragmentation. Talanta. 81 (3), 881-886 (2010).
  31. Xuan, J., Yu, Y., Qing, T., Guo, L., Shi, L. Next-generation sequencing in the clinic: Promises and challenges. Cancer Lett. 340 (2), 284-295 (2013).
  32. Senst, A., Bonsiepe, H., Kron, S., Schulz, I. Application of the Agilent 2100 bioanalyzer instrument as quality control for next-generation sequencing. J Forensic Sci. 69 (6), 2192-2196 (2024).
  33. Li, W., Qiu, T., Ling, Y., Gao, S., Ying, J. Subjecting appropriate lung adenocarcinoma samples to next-generation sequencing-based molecular testing: Challenges and possible solutions. Mol Oncol. 12 (5), 677-689 (2018).
  34. Li, W., et al. Potential unreliability of uncommon ALK, ROS1, and RET genomic breakpoints in predicting the efficacy of targeted therapy in NSCLC. J Thorac Oncol. 16 (3), 404-418 (2021).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

Toestemming aanvragen

Trefwoorden

Doelgerichte therapiegenomische alteratiesDNA extractiegeautomatiseerde library preparatiebepaling van tumorcellulariteitformaline gefixeerd paraffin ingebedbio informatica analyseprecisie oncologie

Gerelateerde artikelen