Method Article

Geïntegreerd PCR-gebaseerd moleculair detectiesysteem voor de gelijktijdige detectie van vier zoönotische darmparasieten uit meerdere bronnen

DOI:

10.3791/69180

⸱

October 28th, 2025

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Key Laboratory of Public Health Molecular Biology, Yancheng Center for Disease Control and Prevention, 2Clinical Laboratory, Yancheng Maternal and Child Health Care Hospital Affiliated to Yangzhou University, 3Jiangsu Provincial Center for Disease Control and Prevention

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Hier presenteren we een protocol om vier zoönotische darmparasieten uit meerdere bronnen tegelijk te detecteren op basis van een combinatie van een op polymerasekettingreactie (PCR) gebaseerd geïntegreerd moleculair detectiesysteem.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Infectieziekten zijn kritieke factoren die van invloed zijn op de menselijke gezondheid, economische ontwikkeling en sociale stabiliteit. Onder hen zijn zoönotische intestinale parasitaire ziekten in toenemende mate een aandachtspunt van wereldwijde zorg geworden als opkomende, opnieuw opduikende infectieziekten, met name Cryptosporidium, Enterocytozoon bieneusi, Blastocystis en Giardia. Er zijn slechts enkele studies gepubliceerd over de epidemiologie van de bovengenoemde parasieten, vergezeld van kwesties als afzonderlijke detectiedoelen, lage detectiepercentages en hoge ontbrekende detectiepercentages. Deze studie heeft tot doel een geïntegreerd moleculair detectiesysteem op te zetten op basis van een combinatie van PCR-tests voor gelijktijdige detectie van de bovengenoemde vier zoönotische darmparasieten in monsters verzameld van wilde muizen, gezelschapsdieren en vee (runderen en schapen), om een efficiënte technische ondersteuning te bieden voor routinematige detectie van parasieten in meerdere scenario's, inclusief interfaces tussen dier en omgeving, vooral in lokale bewakingsfaciliteiten.

In deze studie, waarbij de detectie van Enterocytozoon bieneusi in ontlasting van 95 wilde muizen en 30 katten en honden (25 van katten en 5 van honden) als primaire test werd genomen, toen twee sets primers werden gebruikt om het ITS-gen te amplificeren, waren de positieve resultaten van elke PCR precies hetzelfde (5,26%), maar de combinatie van 2 sets polymerasekettingreactie (PCR)-tests resulteerde in een hoger positief percentage (6,32%) voor Enterocytozoon bieneusi. Voor Giardia werden 9 positieve monsters gedetecteerd met behulp van het bèta-giardin (BG)-gen, terwijl er geen positieven werden gedetecteerd met behulp van de glutamaatdehydrogenase (GDH) en triosefosfaatisomerase (TPI) genen. De bovenstaande resultaten toonden aan dat een combinatie van PCR-tests voor meerdere genetische doelsegmenten de detectiecapaciteit voor aangewezen pathogenen verbeterde in vergelijking met een enkele PCR-test. Doelsequenties werden bevestigd door Sanger-sequencing. Dit systeem is ontworpen om de bewaking van de infectiestatus, verspreiding en fylogenetische evolutie van zoönotische darmparasieten uit meerdere bronnen te verbeteren en te vergemakkelijken, en biedt een basis voor nauwkeurige en gevoelige waarschuwingen in een vroeg stadium. Dit heeft tot doel een technische brug te slaan voor het bereiken van de One Health-doelstelling op de raakvlakken tussen mens, dier en omgeving.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De Cryptosporidium, Enterocytozoon bieneusi, Blastocystis en Giardia zijn veel voorkomende en gemakkelijk te verwaarlozen protozoaire pathogenen met een wereldwijde prevalentie. In de afgelopen jaren is als gevolg van factoren zoals terugwinning en indringing in de ecologische niches van natuurlijke brandpunten, de populariteit van het fokken van gezelschapsdieren en de ontwikkeling van vee- en pluimveefokkerij, de prevalentie van zoönotische darmparasitaire ziekten uit meerdere bronnen bij knaagdieren, gezelschapsdieren (katten en honden) en vee (runderen en schapen) steeds meer een aandachtspunt geworden, uitbraak en opnieuw opduikende infectieziekten in binnenlandse en landelijke gebieden, waardoor de menselijke gezondheid en de wereldwijde volksgezondheidsbeveiliging ernstig in gevaar worden gebracht 1,2,3,4.

Deze parasieten hebben complexe intra-generieke soorten en een uitgebreid aanpassingsvermogen van de gastheer. Ze kunnen niet alleen knaagdieren, gezelschapsdieren, herkauwers, pluimvee en vogels infecteren, maar ook zoönotische soorten, die mensen kunnen infecteren en klinische symptomen kunnen veroorzaken zoals buikpijn, diarree en braken. Ze zijn bijzonder vatbaar voor kinderen, ouderen, zwangere vrouwen en immuungecompromitteerde bevolkingsgroepen, en kunnen worden overgedragen via water, voedsel en lucht, wat aanzienlijke zoönotische risico's voor de volksgezondheid met zich meebrengt 3,5,6.

Momenteel is de identificatie van de bovenstaande vier parasieten voornamelijk gebaseerd op morfologie, die vatbaar is voor verkeerde identificatie vanwege morfologische overeenkomsten binnen geslachten en subjectieve factoren, met name bij het onderscheiden tussen soorten en genotypen. Moleculaire biologische technieken zijn op grote schaal gebruikt voor het identificeren van soorten, geslachten en genotypen van deze parasieten. Voor Blastocystis en Cryptosporidium richt de detectie zich voornamelijk op het kleine subeenheid ribosomaal ribonucleïnezuur (SSU rRNA) gen 3,7,8; voor Enterocytozoon bieneusi, het gen voor de interne getranscribeerde spacer (ITS) 4,9; en voor Giardia, de genen bèta-giardin (BG), glutamaatdehydrogenase (GDH) en triosefosfaatisomerase (TPI)10,11. Hoewel geneste conventionele polymerasekettingreactie (PCR) de identificatie- en typeringsmogelijkheden van deze vier parasieten sterk heeft verbeterd, is het onvoldoende om gemiste gevallen op te sporen en nieuwe soorten of quasisoorten met significante genetische kenmerken te identificeren. Dit heeft vaak invloed op de efficiëntie van epidemiologisch onderzoek, overdracht en ziektebestrijding bij mensen, dieren en andere gastheren, wat grote uitdagingen met zich meebrengt voor de beveiliging van de volksgezondheid bij mensen, dieren en het milieu.

Vanwege de overeenkomsten in symptomen, transmissieroutes en gastheerbereik van deze vier parasieten, is er nog geen geïntegreerd moleculair systeem voor efficiënte detectie, terwijl ontbrekende detectie wordt vermeden en nieuwe soorten of quasisoorten met significante genetische verschillen nauwkeurig worden geïdentificeerd. Deze studie heeft een volwassen geïntegreerd moleculair detectiesysteem opgezet op basis van PCR-high-throughput sequencing-technologie door literatuur te bekijken voor de gelijktijdige detectie van de vier zoönotische darmparasieten in monsters uit meerdere bronnen (wilde muizen, gezelschapsdieren, runderen en schapen). In combinatie met bio-informatica-analyse werd dit systeem toegepast om zoönotische darmparasieten uit meerdere bronnen te identificeren, epidemiologische factoren zoals infectieverspreiding en fylogenetische evolutie te monitoren, en vroegtijdig te waarschuwen voor infecties bij mens en dier en milieuverontreiniging.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De studie werd goedgekeurd en uitgevoerd door de dierethische commissie van het Jiangsu Provincial Center for Disease Control and Prevention. Deze studie werd uitgevoerd in overeenstemming met de 2020-editie van de American Veterinary Medical Association Guidelines on Animal Euthanasia, de leidende principes van de Regulations on the Administration of Experimental Animals (Order No. 2 van de State Science and Technology Commission van de Volksrepubliek China, 1988) en de leidende principes voor de humane behandeling van dieren uitgegeven door het ministerie van Wetenschap en Technologie van de Volksrepubliek China.

1. Bereiding van verse uitwerpselen van wilde muizen, gezelschapsdieren en vee (runderen en schapen)

  1. Verdoof muizen door kooldioxide-inhalatie uit een ingeblikte gecomprimeerde kooldioxidebron in een transparante luchtdichte plastic doos, met een vervangingspercentage van 30%-70% van het containervolume per minuut. Na volledige anesthesie en coma voert u cervicale dislocatie uit op de muizen.
  2. Verse fecale monsterafname: Verzamel fecale monsters van honden, katten, runderen en schapen binnen 1 uur na de ontlasting, met één buisje per uitwerpselen van het dier, en vermijd kruisbesmetting.
    1. Vang knaagdieren met behulp van aaskooien met vrijlatingsapparaten in verschillende wilde habitats. Plaats de gevangen muizen in muizenzakken en vervoer ze onmiddellijk naar het laboratorium. Ontleed de muizen bij steriel gebruik in een bioveiligheidskast om het rectum met uitwerpselen te verzamelen, plaats het in een cryobuis van 2 ml en bewaar het bij -80 °C voor latere detectie.
    2. Selecteer honden en katten uit dierenwinkels in verschillende regio's als onderzoeksobjecten. Verzamel vers uitgescheiden uitwerpselen onmiddellijk, in cryobuisjes van 5 ml, gelabeld met volledige monsterinformatie, en transporteer ze onmiddellijk naar het laboratorium voor opslag bij -80 °C.
    3. Selecteer runderen en schapen van veehouderijen (intensief of scharrel) als onderzoeksobjecten. Verzamel vers uitgescheiden uitwerpselen onmiddellijk in cryobuisjes van 50 ml, gelabeld met volledige monsterinformatie, en transporteer ze onmiddellijk naar het laboratorium voor opslag bij -80 °C.

2. Extractie van totaal DNA uit verse uitwerpselen van wilde muizen, gezelschapsdieren en vee (runderen en schapen)

  1. Fecale voorbehandeling:
    OPMERKING: QIAamp Fast DNA Stool Mini Kit werd gebruikt.
    1. Voeg bij steriel gebruik in een bioveiligheidskast ongeveer 200 mg ontlasting uit verschillende bronnen toe aan de met fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS) buffer, voeg stalen kralen toe en homogeniseer grondig met behulp van een tissueslijper.
    2. Verwarm dit 5 minuten op 70 °C en centrifugeer 10 minuten bij 10.000 × g bij kamertemperatuur (15-25 °C).
    3. Voeg 600 μL supernatans toe aan een centrifugebuis van 2 ml die 25 μL proteïnase K bevat, voeg 600 μL Buffer AL toe en vortex gedurende 15 s.
    4. Incubeer gedurende 10 minuten bij 70 °C. Voeg 600 μL 100% watervrije ethanol toe aan het lysaat en de vortex om te mengen.
  2. Voeg voorzichtig 600 μL lysaat toe aan een spinkolom, centrifugeer gedurende 1 minuut op 14000 × g en plaats de spinkolom in een nieuwe opvangbuis van 2 ml. Herhaal deze stap nog een keer.
  3. Open voorzichtig de centrifugekolom, voeg 500 μL Buffer AW1 toe, centrifugeer 1 minuut op maximale snelheid en plaats de spinkolom in een nieuwe opvangbuis van 2 ml. Open voorzichtig de centrifugekolom, voeg 500 μL Buffer AW2 toe en centrifugeer gedurende 3 minuten op maximale snelheid.
  4. Plaats de centrifugekolom in een nieuwe opvangbuis van 2 ml (apart bereid) en centrifugeer gedurende 3 minuten op 14000 × g . Plaats de spinkolom in een nieuw geëtiketteerde centrifugebuis van 1.5 ml en voeg 100 μL elutiebuffer rechtstreeks toe aan het membraan van de spinkolom.
  5. Incubeer 1 minuut bij kamertemperatuur (15-25 °C) en centrifugeer gedurende 1 minuut bij 14000 g × g om DNA te elueren.
  6. Bepaal de concentratie en zuiverheid van het DNA met behulp van een ultra-microspectrofotometer. Gebruik het geëxtraheerde DNA voor latere detectie of bewaar het bij -20 °C voor langdurige bewaring.
    OPMERKING: De verhouding A260/A280 moet 1,8-2,0 zijn om de integriteit en zuiverheid van het geëxtraheerde DNA te waarborgen.

3. Geneste conventionele PCR-detectie van Cryptosporidium en Blastocystis gericht op klein subeenheid ribosomaal RNA (SSU rRNA)

OPMERKING: Voor deze stap werd Dream Taq Green PCR Mix gebruikt.

  1. Bereid het PCR-reactiesysteem op ijs voor met behulp van PCR Mix: 25 μL 2× Taq-buffer, 2 μL van elk van de voorwaartse en achterwaartse primers, 16 μL ddH2O en 5 μL sjabloon, met een totaal volume van 50 μL.
  2. Volg voor Cryptosporidium de stappen 3.2.1-3.2.2.
    1. Gebruik F1R11 en F-1R1-1 8,11 als de eerste ronde reactieprimers. Stel het reactieprogramma in: eerste denaturatie bij 94 °C gedurende 5 min, 30 denaturatiecycli bij 94 °C gedurende 40 s, gloeien bij 55 °C gedurende 40 s en verlenging bij 72 °C gedurende 90 s, met een uiteindelijke rek bij 72 °C gedurende 7 min.
    2. Gebruik F2R21 en F-1R2-1 8,11 als primers in de tweede ronde, met het volgende reactieprogramma: eerste denaturatie bij 94 °C gedurende 5 min, 30 denaturatiecycli bij 94 °C gedurende 40 s, gloeien bij 55 °C gedurende 40 s, en verlenging bij 72 °C gedurende 1 min, met een uiteindelijke rek bij 72 °C gedurende 7 min.
  3. Volg voor Blastocystis de stappen 3.3.1-3.3.4.
    1. Gebruik F1R13 en F1-1R-1 3,12 als de eerste ronde reactieprimers. Stel het reactieprogramma voor F1R1 als volgt in: initiële denaturatie bij 94 °C gedurende 5 min, 30 denaturatiecycli bij 94 °C gedurende 40 s, gloeien bij 60 °C gedurende 40 s en verlenging bij 72 °C gedurende 100 s, met een uiteindelijke rek bij 72 °C gedurende 7 min.
    2. Stel het reactieprogramma voor F1-1R-1 als volgt in: initiële denaturatie bij 94 °C gedurende 5 min, 30 denaturatiecycli bij 94 °C gedurende 40 s, gloeien bij 55 °C gedurende 40 s en verlenging bij 72 °C gedurende 1 min, met een uiteindelijke rek bij 72 °C gedurende 7 min.
    3. Gebruik F2R23 en F2-1R-1 3,12 als primers voor de tweede ronde. Stel het reactieprogramma voor F2R2 als volgt in: initiële denaturatie bij 94 °C gedurende 5 min, 30 denaturatiecycli bij 94 °C gedurende 40 s, gloeien bij 60 °C gedurende 40 s en verlenging bij 72 °C gedurende 1 min, met een uiteindelijke rek bij 72 °C gedurende 7 min.
    4. Stel het reactieprogramma voor F2-1R-1 als volgt in: initiële denaturatie bij 94 °C gedurende 5 min, 30 denaturatiecycli bij 94 °C gedurende 40 s, gloeien bij 55 °C gedurende 40 s en verlenging bij 72 °C gedurende 50 s, met een uiteindelijke rek bij 72 °C gedurende 7 min.
      OPMERKING: Primersequenties worden weergegeven in Tabel 1 1,3,8,11,12.
PathogeenVerwachte productgrootte (bp)Primer sequenties (5′-3")Verwijzingen
Cryptosporidium830F1: CCATTTCCTTCGAAACAGGA1
R1: TTCTAGAGCTAATACATGCG
F2: AAGGAGTAAGGAACAACCTCCA
R2: GGAAGGGTTGTATTTATTAGATAAAG
607F-1: GACATATCATTCAAGTTTCTGACC8,11
R1-1: CTGAAGGAGTAAGGAACAACC
R2-1: TCTAAGAATTTCACCTCTGACTG
Blastocystis600F1: GGGATCCTGATCCTTCCGCAGGTTCACCTAC3
R1: GGAAGC TTATCTGGTTGATCCTGCCAGTA
F2: ATCTGGTTGATCCTGCCAGT
R2: GAGCTTTTTAACTGCAACAACG
460F1-1: TGCTTTCGCACTTGTTCATC3,12
F2-1: GATTTATTGTCACTACCTCC
R-1: ATCTGGTTGATCCTGCCAGT

Tabel 1: Primersequenties voor SSU rRNA van Cryptosporidium en Blastocystis.

4. Geneste conventionele PCR-detectie van het ITS-gen Enterocytozoon bieneusi en de Giardia BG-, GDH- en TPI-genen

OPMERKING: Voor deze stap werd Dream Taq Green PCR Mix gebruikt.

  1. Bereid het PCR-reactiesysteem op ijs voor met behulp van een PCR-mengsel: 25 μl 2× Taq-buffer, 2 μl voorwaartse en achterwaartse primers, 16 μl ddH2O en 5 μl sjabloon, met een totaal volume van 50 μl.
  2. Volg voor Enterocytozoon bieneusi de stappen 4.2.1-4.2.2.
    1. Gebruik F1R19 en F1-1R1-12 als de eerste ronde reactieprimers. Stel het reactieprogramma als volgt in: eerste denaturatie bij 94 °C gedurende 5 min, 30 denaturatiecycli bij 94 °C gedurende 40 s, gloeien bij 55 °C gedurende 40 s en verlenging bij 72 °C gedurende 50 s, met een uiteindelijke rek bij 72 °C gedurende 7 min.
    2. Gebruik F2R29 en F2-1R2-12 als de primers van de tweede ronde, met het reactieprogramma als volgt: eerste denaturatie bij 94 °C gedurende 5 min, 30 denaturatiecycli bij 94 °C gedurende 40 s, gloeien bij 55 °C gedurende 40 s, en verlenging bij 72 °C gedurende 50 s, met een uiteindelijke rek bij 72 °C gedurende 7 min.
  3. Volg voor Giardia de stappen 4.3.1-4.3.3.
    1. Gebruik BG-F1R1, GDH-F1R1 en TPI-F1R1 2,10 als de eerste ronde reactieprimers voor de drie doelgenen. Stel het reactieprogramma in de eerste ronde voor alles als volgt in: eerste denaturatie bij 94 °C gedurende 5 min, 30 denaturatiecycli bij 94 °C gedurende 40 s, gloeien bij 50 °C gedurende 40 s en verlenging bij 72 °C gedurende 1 min, met een uiteindelijke rek bij 72 °C gedurende 7 min.
    2. Stel het reactieprogramma in de tweede ronde voor BG-F2R2 2,10 en TPI-F2R2 2,10 als volgt in: eerste denaturatie bij 94 °C gedurende 5 min, 30 denaturatiecycli bij 94 °C gedurende 40 s, gloeien bij 55 °C gedurende 40 s en verlenging bij 72 °C gedurende 50 s, met een uiteindelijke rek bij 72 °C gedurende 7 min.
    3. Stel het reactieprogramma in de tweede ronde voor GDH-F2R2 2,10 als volgt in: eerste denaturatie bij 94 °C gedurende 5 minuten, 30 denaturatiecycli bij 94 °C gedurende 40 s, gloeien bij 60 °C gedurende 40 s en verlenging bij 72 °C gedurende 50 s, met een uiteindelijke rek bij 72 °C gedurende 7 minuten.
      OPMERKING: Primersequenties worden weergegeven in Tabel 2 2,9,10.
PathogeenVerwachte productgrootte (bp)Primer sequenties (5′-3")Verwijzingen
Enterocytozoon bieneusi390F1: GGTCATAGGGATGAAGAG9
R1: TTCGAGTTCTTTCGCGCTC
F2: GCTCTGAATATCTATGGCT
R2: ATCGCCGACGGATCCAAGTG
390F1-1: GATGGTCATAGGGATGAAGAGCTT2
R1-1: TATGCTTAAGTCCAGGGAG
F2-1: AGGGATGAAGAGCTTCGGCTCTG
R2-1: AGTGATCCTGTATTAGGGATATT
Giardia511BG-F1: AAGCCCGACGACCTCACCCGCAGTGC2,10
BG-R1: GAGGCCGCCCTGGATCTTCGAGACGAC
BG-F2: GAACGAACGAGATCGAGGTCCG
BG-R2: CTCGACGAGCTTCGTGTT
530GDH-F1: TTCCGTRTYCAGTACAACTC2,10
GDH-R1: ACCTCGTTCTGRGTGGCGCA
GDH-F2: ATGACYGAGCTYCAGAGGCACGT
GDH-R2: GTGGCGCARGGCATGATGCA
530TPI-F1: AAATIATGCCTGCTCGTCG2,10
TPI-R1: CAAACCTTITCCGCAAACC
TPI-F2: CCCTTCATCGGIGGTAACTT
TPI-R2: GTGGCCACCACICCCGTGCC

Tabel 2: Primersequenties voor het Enterocytozoon bieneusi ITS-gen en de Giardia BG-, GDH- en TPI-genen.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Muizen Cryptosporidium, Blastocystis SSU rRNA-gen, Enterocytozoon bieneusi ITS-gen en Giardia BG-gen PCR-testresultaten
Alle 95 rectale fecale monsters van muizen werden getest op het ITS-gen van Enterocytozoon bieneusi met behulp van twee sets primers, wat resulteerde in 5 positieve monste...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De Cryptosporidium, Enterocytozoon bieneusi, Blastocystis en Giardia zijn veel voorkomende zoönotische darmparasieten; de eerste twee zijn geclassificeerd als biologische pathogenen van categorie B door de Amerikaanse National Institutes of Health (NIH), en alle vier staan op de lijst van de Wereldgezondheidsorganisatie (WHO) als 24 van de belangrijkste door voedsel overgedragen parasieten wereldwijd. Ze kunnen mogelijk mensen en dieren infecteren en h...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De auteurs hebben niets te onthullen.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Deze studie werd ondersteund door de Jiangsu Provincial Health Commission (subsidienrs. Ym2023024), Yancheng Municipal Medical Research Project (subsidienr. YK2023085), en het Open Fonds van het Key Laboratory of Pathogenic Microbiology for Emerging and Re-emerging Infectious Diseases (Jiangsu Provincial Center for Disease Control and Prevention) (PM202402).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Agarose Qingke TechTSJ001
Qiaquick gel extractie kitQiagen 28704DNA gel extractie kit
100 bp Plus DNA LadderTransGen BiotechBM311DNA Ladder
4S Green Plus NucleïnezuurvlekBBIA616696-0500DNA vlek
10×TBE BufferSolarbioT1051elektroforese buffer
Qubit 4.0Thermohttps://www.thermofisher.com/in/en/home
/industrial/spectroscopy-elemental
-isotope-analysis/molecular-spectroscopy/
fluorometers/qubit/models/qubit-4.html?
ef_id=:G:s&s_kwcid=AL!3652!10!77515
785702067!!!!77516061528018!!380468
453!1240249321530142&cid=bid_pca_
aqb_r01_co_cp1359_pjt0000_bid
00000_0se_bng_bt_pur_con		Fluorescentie kwantitatief instrument
MINI Space 1000Tanonhttp://en.biotanon.com/PRODUCT/
PRODUCTLIST?ID=3040&
TYPE=DETAIL		Gel beeldvorming
 Fast DNA Stool Mini Kit voor DNA extractieQIAGEN51604Nucleïnezuur extractie kit
ProFlex BaseThermohttps://www.thermofisher.com/
in/en/home/life-science/pcr/
thermal-cyclers-realtime-
instruments/thermal-cyclers
/proflex-pcr-system.html		PCR
Dream Taq Green PCR MixThermoK1082Pcr versterking 

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Zhao, Q., et al. Cryptosporidium spp. in large-scale sheep farms in China: prevalence and genetic diversity. Sci Rep. 14 (1), 11218(2024).
  2. Li, F., Wang, R., Guo, Y., Li, N., Feng, Y., Xiao, L. Zoonotic potential of Enterocytozoon bieneusi and Giardia duodenalis in horses and donkeys in northern China. Parasitol Res. 119 (3), 1101-1108 (2020).
  3. Jinatham, V., Maxamhud, S., Popluechai, S., Tsaousis, A. D., Gentekaki, E. Blastocystis One Health approach in a rural community of Northern Thailand: prevalence, subtypes and novel transmission routes. Front Microbiol. 12 (1), 746340(2021).
  4. Deng, L., et al. Occurrence and genetic characteristics of Cryptosporidium spp. and Enterocytozoon bieneusi in pet red squirrels (Sciurus vulgaris) in China. Sci Rep. 10 (1), 1026(2020).
  5. Zhao, W., Zhou, H. H., Ma, T. M., Cao, J., Lu, G., Shen, Y. J. PCR-based detection of Cryptosporidium spp. and Enterocytozoon bieneusi in farm-raised and free-ranging geese (Anser anser f. domestica) from Hainan Province of China: natural infection rate and the species or genotype distribution. Front Cell Infect Microbiol. 9 (1), 416(2019).
  6. Feng, Y., Xiao, L. Zoonotic potential and molecular epidemiology of Giardia species and giardiasis. Clin Microbiol Rev. 24 (1), 110-140 (2011).
  7. Zhao, G. H., et al. Genotyping Cryptosporidium andersoni in cattle in Shaanxi Province, Northwestern China. PLoS One. 8 (4), e60112(2013).
  8. Ryan, U., Xiao, L., Read, C., Zhou, L., Lal, A. A., Pavlasek, I. Identification of novel Cryptosporidium genotypes from the Czech Republic. Appl Environ Microbiol. 69 (7), 4302-4307 (2003).
  9. Gui, B. Z., et al. Novel genotypes and multilocus genotypes of Enterocytozoon bieneusi in two wild rat species in China: potential for zoonotic transmission. Parasitol Res. 119 (1), 283-290 (2020).
  10. Ye, J., et al. Occurrence of human-pathogenic Enterocytozoon bieneusi, Giardia duodenalis and Cryptosporidium genotypes in laboratory macaques in Guangxi, China. Parasitol Int. 63 (1), 132-137 (2014).
  11. Alves, M., Xiao, L., Sulaiman, I., Lal, A. A., Matos, O., Antunes, F. Subgenotype analysis of Cryptosporidium isolates from humans, cattle, and zoo ruminants in Portugal. J Clin Microbiol. 41 (6), 2744-2747 (2003).
  12. Santín, M., Gómez-Muñoz, M. T., Solano-Aguilar, G., Fayer, R. Development of a new PCR protocol to detect and subtype Blastocystis spp. from humans and animals. Parasitol Res. 109 (1), 205-212 (2011).
  13. Bouwknegt, M., et al. Prioritisation of food-borne parasites in Europe, 2016. Euro Surveill. 23 (9), 17(2018).
  14. Xiao, L., Fayer, R. Molecular characterisation of species and genotypes of Cryptosporidium and Giardia and assessment of zoonotic transmission. Int J Parasitol. 38 (11), 1239-1255 (2008).
  15. Cacciò, S. M., Beck, R., Lalle, M., Marinculic, A., Pozio, E. Multilocus genotyping of Giardia duodenalis reveals striking differences between assemblages A and B. Int J Parasitol. 38 (13), 1523-1531 (2008).
  16. Wawrzyniak, I., et al. Blastocystis, an unrecognized parasite: an overview of pathogenesis and diagnosis. Ther Adv Infect Dis. 1 (5), 167-178 (2013).
  17. Honigsbaum, M. Disease X and other unknowns. Lancet. 393 (10180), 1496-1497 (2019).
  18. A scientific framework for epidemic and pandemic research preparedness. , WHO. At https://cdn.who.int/media/docs/default-source/consultation-rdb/prioritization-pathogens-v6final.pdf?sfvrsn=c98effa7_7&download=true (2024).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

PCR DetectionZoonotic ParasitesIntestinal ParasitesMolecular DetectionCryptosporidium DetectionEnterocytozoon BieneusiBlastocystis DetectionGiardia DetectionSanger SequencingOne Health

Related Articles