Deze procedure toont transversaal transport van de tibiale cortex bij ratten aan, waardoor visualisatie en analyse van revascularisatie tijdens ledemaat-ischemie mogelijk is.
Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.
Methodenartikel
Een rattenmodel van transversale transport van de tibiale cortex voor de behandeling van ischemie in de onderbenen
* These authors contributed equally
In dit artikel
Samenvatting
Samenvatting
Tibiale cortex transversaal transport (TTT) is een opkomende chirurgische techniek die wordt gebruikt om revascularisatie in ischemische onderbenen te bevorderen. Deze video toont een reproduceerbaar rattenmodel van TTT, waarin de chirurgische creatie van een corticaal botfragment, het transportprotocol en postoperatieve beoordelingen worden beschreven. De procedure maakt gecontroleerde op- en neergaande transport van een botfragment mogelijk om angiogene reacties te stimuleren. Representatieve röntgenfoto's gemaakt op postoperatieve dagen 1, 7 en 12, samen met microvasculaire perfusiebeeldvorming op dag 19 na euthanasie, tonen duidelijke botfragmentbeweging en verbeterde ledematenperfusie na TTT.
Dit model biedt een praktisch en reproduceerbaar platform voor het onderzoeken van de moleculaire mechanismen die ten grondslag liggen aan TTT-geïnduceerde angiogenese en het evalueren van potentiële therapeutische strategieën voor ischemische ziekten. Om dit model te construeren, simuleerden we de klinische TTT-procedure bij Sprague-Dawley-ratten, waarbij drie hoofdchirurgische stappen betrokken waren: ligatie van de oppervlakkige femorale arterie, creatie en mobilisatie van een corticaal botfragment, en het aanbrengen van een op maat gemaakte externe fixator. Gedurende 12 dagen werd het fragment geleidelijk vooruit en daarna achteruit vervoerd. Perfusiebeeldvorming bevestigde verbeterde vascularisatie in het ischemische ledemaat na voltooiing van de transportcyclus. Al met al bootst dit gestandaardiseerde rattenmodel klinische TTT-procedures nauw na en biedt het een waardevol experimenteel systeem voor het bestuderen van mechanotransductie, angiogenese en vasculaire regeneratie bij ischemische ledemaataandoeningen.
Inleiding
Ischemische aandoeningen van de onderledematen, zoals arteriosclerosis obliterans (ASO), thromboangiitis obliterans (TAO) en diabetische voet (DF), worden gekenmerkt door een beperkte arteriële bloedtoevoer naar de onderste ledematen 1,2. In de vroege stadia ervaren patiënten meestal intermitterende claudicatio en rustpijn. Naarmate de ziekte vordert, kan langdurige ischemie leiden tot weefselnecrose, infectie en, in ernstige gevallen, amputatie van ledemaat1. Huidige standaardbehandelingen – waaronder farmacologische therapie, endovasculaire interventies en open chirurgische ingrepen – leveren vaak beperkte effectiviteit op, vooral in gevorderde stadia vande ziekte.
Tibiale cortex transversaal transport (TTT) is een innovatieve therapeutische strategie voor de behandeling van diverse ischemische aandoeningenvan de onderleden. Geworteld in de Ilizarov-methode en de "spanning-stressregel"5,6, houdt deze techniek in dat een mobiel corticaal botflapfragment in het scheenbeen wordt gecreëerd via osteotomie. Vervolgens wordt een continue, langzame en gecontroleerde afleidingskracht toegepast om de regeneratie van bot, bloedvaten en omliggende zachte weefsels te stimuleren. Dit regeneratieve proces faciliteert het herstel van de microcirculatie en helpt de zuurstoftoevoer in het aangedane ledemaat te herstellen. Uiteindelijk leidt TTT tot een verbeterde bloedperfusie en functioneel herstel in ischemische weefsels7.
Conventionele vasculaire reconstructietechnieken voor onderbenischemie kunnen de bloedstroom herstellen in grote slagaders van de kuit, maar zijn vaak niet effectief in het revasculariseren van kleinere slagaders in de voet of het bevorderen van herstel en regeneratie van beschadigde microvaten, waardoor hun vermogen om ischemie8 volledig op te lossen wordt beperkt. TTT brengt continu tractie uit op het bot en omliggende zachte weefsels, waardoor de robuuste afgifte van chemotactische factoren en cytokineswordt geïnduceerd. Deze chemotactische factoren reguleren verschillende functies van stamcellen en worden, onder ischemische omstandigheden, overvloedig in de circulatie afgescheiden. Ze rekruteren actief endogene stamcellen op de plekken van de verwonding, waardoor vasculaire reparatie en regeneratie mogelijk wordt gemaakt zonder directe stamceltransplantatie. Dankzij deze voordelen is TTT uitgegroeid tot een veelbelovende therapeutische strategie voor onderledemaatischemie en wordt het steeds vaker toegepast bij de behandeling van diverse ischemische aandoeningen die de onderste ledematenaantasten.
Hoewel konijnen en honden vaak worden gebruikt in fundamenteel TTT-onderzoek, beperkt het gebrek aan geschikte analytische instrumenten voor deze soorten mechanistische onderzoeken. Daarentegen biedt het rat TTT-model een grotere compatibiliteit met beschikbare moleculaire en beeldvormingstechnieken, terwijl het praktisch en lagere kosten blijft, waardoor het een toegankelijker en reproduceerbaarder platform is voor mechanistische studies. Tot op heden is er echter geen enkele studie die systematisch de effectiviteit van TTT heeft beschreven of geëvalueerd in een ratmodel van onderlichaamsischemie.
Het ratten-TTT-model vereist verfijnde microchirurgische vaardigheden vanwege de kleine tibiale grootte en dunne cortex, en het afleidingsbereik wordt beperkt door de corticale dikte. Deze praktische beperkingen moeten worden meegenomen bij het evalueren van de geschiktheid van het model voor specifieke onderzoeksomgevingen.
In deze studie ontwikkelden we een rat-specifiek TTT-model door de kernstructuur en operationele principes van het klinische tibiale transversale transportapparaat te repliceren. De procedure werd verfijnd van klinisch gevalideerde protocollen om haalbaarheid en consistentie bij kleine dieren te waarborgen. Ons doel is het opzetten en valideren van een gestandaardiseerd en reproduceerbaar ratten-TTT-model dat geschikt is voor het onderzoeken van angiogenese en mechanotransductie bij ischemische ledemaatziekte.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Protocol
Alle dierproeven werden goedgekeurd door de Animal Ethics Committee van het Eerste Geaffilieerde Ziekenhuis van de Guangxi Medische Universiteit (goedgekeurd nr. 2025-E0642). Mannelijke Sprague-Dawley ratten (300-350g) werden gehuisvest in het Guangxi Medical University Animal Research Center onder gestandaardiseerde omstandigheden. Ratten kregen regelmatig voedsel en schoon drinkwater ad libitum en werden gehouden op een kunstmatige licht/donkercyclus van 12 uur. De dierenfaciliteit werd gehouden op een gecontroleerde temperatuur van 20-26 °C met een relatieve luchtvochtigheid van 40%-70%. Alle chirurgische instrumenten werden grondig gesteriliseerd voor gebruik. Gedetailleerde informatie over alle reagentia en materialen die in deze studie zijn gebruikt, is te vinden in Tabel 1.
Euthanasie werd uitgevoerd door intraperitoneale injectie van een overdosis natriumpentobarbital. De dood werd bevestigd door het permanent stoppen van hartslag en ademhaling, pupilverwijding en het ontbreken van een reactie op schadelijke prikkels. Alle procedures werden uitgevoerd door getraind personeel om dierenschade te minimaliseren, en het euthanasieprotocol was vooraf beoordeeld en goedgekeurd door de Institutional Animal Care and Use Committee.
1. Externe fixator voor TTT
- Gebruik een verkleinde, op maat gemaakte versie van de klinische tibiale cortex transversale transport externe fixator (TTT-EF), bestaande uit een botfragmenttractie-eenheid en een extern fixatieframe.
- Maak verticale mobilisatie van beide componenten mogelijk door een intern schroefschroefdraadmechanisme te integreren (Figuur 1).
- Boor twee doorlopende gaten aan elke zijde van de dwarsdoorsneden van zowel de tractie-eenheid als het fixatieframe om Kirschner-draden in te brengen.
- Steek de Kirschner-draden door de aangewezen gaten en zet ze zijwaarts vast met zeshoekige schroeven om stabilisatie te garanderen.
- Verbind het tractiecomponent van de TTT-EF met het botfragment met 0,8 mm Kirschner-draden.
- Veranker het fixatiecomponent aan de proximale en distale uiteinden van het scheenbeen met 1,0 mm Kirschner-draad.
2. Chirurgische ingreep
- Voer de TTT-procedure uit bij 8 weken oude mannelijke Sprague-Dawley (SD) ratten. Verdoof de ratten door intraperitoneale injectie van 0,35 mg/kg natriumpentobarbital en 0,3 mg/kg chloralhydraat.
- Beoordeel het verdovingseffect door de terugtrekkingsreflex van het pedaal en het hoornvlies te testen. Houd de vitale functies en de diepte van de anesthesie continu in de gaten gedurende de procedure. Breng oogzalf aan op de ogen van de rat vóór de operatie om het hoornvlies te beschermen, volgens de Richtlijnen voor het Gebruik van Laboratoriumdieren.
- Schaf het operatiegebied en dien 0,5% lidocaïne toe om postoperatieve pijn te minimaliseren.
- Maak een incisie van 10 mm in het rechter liesgebied met een scalpel nr. 11.
- Ontleed de fascia bot om de oppervlakkige femorale slagader bloot te leggen.
- Isoleer de slagader tussen de femurnervus en de oppervlakkige femorale vena met behulp van oogpincetten. Ligater en snijd beide uiteinden van de slagader door.
- Naai de incisie met 4-0 absorbeerbare hechtingen.
- Maak een verticale incisie van 15 mm op het mediale bovenste scheenbeen met een scalpel nr. 11.
- Scheid het subcutane weefsel en de onderliggende spier zorgvuldig om periostale schade te voorkomen. Ontleed voorzichtig het zachte weefsel om het mediale tibiale oppervlak volledig bloot te leggen.
- Omlijnt het botfragmentgebied (8 mm × 4 mm) op het mediale tibia-oppervlak met een chirurgisch mes. Boor dicht bij elkaar gelegen perforaties langs de gemarkeerde grens met een 0,6 mm boor. Maak een botraamfragment (8 mm × 4 mm) op het bovenste mediale scheenbeen.
- Implanteer twee 0,8 mm schroefdraad van Kirschner in het botfragment, met een afstand van 0,5 mm, om transport te vergemakkelijken. Verbind de Kirschner-draden met de TTT-EF en zet ze vast.
- Plaats twee 1,0 mm Kirschner-draden aan weerszijden van het fragment, die de achterste cortex van het scheenbeen doorboren.
- Assembleer en installeer de TTT-EF.
- Voer osteotomie uit volgens de gemarkeerde lijn met een oogschaar.
- Verhoog het botfragment voorzichtig om verticale mobiliteit mogelijk te maken en mergschade te voorkomen.
- Spoel de operatieplaats met 10% povidonjodium gevolgd door steriele zoutoplossing.
- Hecht de incisie in lagen met 4-0 absorbeerbare hechtingen.
- Dien buprenorfine (0,05 mg/kg) direct na de operatie subcutaan toe. Blijf tot 3 dagen elke 12 uur doseren om een effectieve analgesie te garanderen.
3. Postoperatieve monitoring
- Houd de dieren na de operatie nauwlettend in de gaten om een goed herstel te waarborgen en mogelijke complicaties vroegtijdig te detecteren. Onderzoek dieren elke 6-8 uur tijdens de eerste 48 uur postoperatief. Beoordeel de algemene activiteit, houding, verzorgingsgedrag, voedsel- en waterinname en de staat van de chirurgische incisie.
- Voer minstens één keer per dag monitoring uit vanaf postoperatieve dag 3 tot en met de afleidings- en consolidatiefasen. Bevestig voldoende herstel door te controleren op normale beweging, stabiel lichaamsgewicht, regelmatige voedsel- en waterinname, en afwezigheid van wondafscheiding, overmatige zwelling of gedragsmatige pijntekenen.
- Blijf pijnstillend indien nodig in overeenstemming met de institutionele richtlijnen.
- Behandel wondinfecties (bijv. erythema, zwelling, etterige afscheiding) met lokale wondverzorging en systemische antibiotica, volgens veterinaire aanbevelingen.
- Corrigeer het losmaken of verplaatsen van de externe fixator direct onder korte narcose om de uitlijning te behouden en nauwkeurige afleiding mogelijk te maken.
- Beoordeel en beheer snel eventuele complicaties. Evalueer dieren met ernstige complicaties die de mobiliteit, voeding of wondgenezing beïnvloeden in overleg met veterinair personeel.
- Euthanaseer dieren op een humane manier als ze voldoen aan vooraf gedefinieerde criteria voor humane uiteindelijkheid.
4. Protocol voor het transport van botfragmenten
- Gebruik de tibiale cortex transversale transport externe fixator (TTT-EF) om postoperatief botfragmenttransport uit te voeren.
- Wijs dag 1 na de operatie aan als de latentieperiode.
OPMERKING: Manipuleer het botfragment niet tijdens deze periode. - Start de opwaartse transportfase op dag 2. Beweeg het botfragment elke 12 uur 5 opeenvolgende dagen (Dag 2-Dag 6) met een snelheid van 0,5 mm naar voren. Pauzeer het transportproces op dag 7 om stabilisatie mogelijk te maken.
- Start de neerwaartse transportfase op dag 8.
- Trek het botfragment met dezelfde snelheid van 0,5 mm elke 12 uur terug gedurende 5 dagen (dag 8-dag 12). Zorg ervoor dat het botfragment tegen het einde van dag 12 weer op zijn oorspronkelijke plek staat.
- Ga verder met een consolidatiefase van 2 dagen (dagen 13-14), zonder verder transport.
- Verwijder de externe fixator aan het einde van de consolidatiefase.
OPMERKING: Zie Figuur 2 voor een visuele tijdlijn van de TTT-transportprocedure en evaluatieschema.
5. Evaluatie
OPMERKING: Gebruik beeldvormingstechnieken om zowel de positie van het botfragment als het herstel van de bloedstroom te evalueren.
- Voer röntgenbeeldvorming uit van de onderste ledematen op dag 1, 7 en 12 om de progressie en de uiteindelijke positie van het getransporteerde botfragment te monitoren.
- Verdoof ratten op aangewezen beeldvormingsmomenten met 2,0% isofluraan in zuurstof.
- Plaats elke rat op een temperatuurgehouden beeldplatform dat is uitgerust met een verwarmingskussen om onderkoeling tijdens de procedure te voorkomen.
- Monitor de diepte van de anesthesie door de ademhalingsfrequentie en pedaalreflex te beoordelen om stabiele immobilisatie te waarborgen.
- Plaats de ledematen en de externe fixator in een gestandaardiseerde oriëntatie over alle dieren om de variabiliteit bij röntgenopname te minimaliseren.
- Maak röntgenfoto's om de verplaatsing en herpositionering van botfragmenten te bevestigen.
- Voer op dag 19 postoperatief een vasculaire perfusiebeeldvorming uit om de microvasculaire perfusie in de onderbenen te beoordelen.
- Euthanaser de ratten en geef een contrastmiddel via de arteria femoralis om de vasculatuur te visualiseren.
- Plaats de geëuthanaseerde ratten in een gestandaardiseerde rugligging voor een consistente beeldvorming.
- Laat volledige vasculaire vulling toe door het contrastmiddel door de femorale arteria onder stabiele kamertemperatuur te perfuseren.
- Voer vasculaire beeldvorming uit om de microvasculaire architectuur en perfusie te beoordelen. Zorg ervoor dat alle exemplaren consistent zijn uitgelijnd met identieke ledemaatoriëntatie en fixatoruitlijning om reproduceerbaarheid te ondersteunen tijdens beeldvormingssessies.
- Gebruik de resulterende beelden om het herstel van de bloedstroom en de vasculaire architectuur in de onderste ledematen te evalueren.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Resultaten
Figuur 3 illustreert de procedure voor het construeren van een met TTT behandeld diermodel voor ischemie in de onderledematen. In onze handen toonde de procedure een chirurgisch succespercentage van ongeveer 90%. Het beperkte aantal falen was grotendeels toe te schrijven aan technische problemen zoals het losraken van de externe fixator of een intraoperatieve botfragmentbreuk, waardoor latere afleiding onmogelijk werd. Het mo...
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Discussie
Alle procedures waarbij anesthesie en chirurgie betrokken waren, werden uitgevoerd met zorgvuldige aandacht voor dierenveiligheid en de richtlijnen voor institutionele dierenzorg. De diepte van de anesthesie werd vóór de incisie bevestigd met behulp van pedaalterugtrekking of corneale reflextesten en werd regelmatig gecontroleerd gedurende de procedure. Er werd voldoende thermische ondersteuning (zoals een verwarmingskussen) geboden om onderkoeling te voorkomen, en oogzalf werd aangebrac...
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Openbaarmakingen
De auteurs hebben geen concurrerende belangen om te verklaren.
Dankbetuigingen
Geen enkele
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Materialen
| Naam | Bedrijf | Catalogusnummer | Opmerkingen |
|---|---|---|---|
| Micro Transverse Retractor | Tianjin Xinzhong Medical Equipment Co., Ltd | A61B17/66 | Voer botfragmenttractie uit |
| Kleine orthopedische boor | Yancheng Ruiao Technology Co. LTD | RA-II | Voor osteotomie door middel van tibiaal boren |
| 0,6 mm roestvrijstalen boortje | Changzhou Borche Medical Equipment Co., Ltd | - | Voor osteotomie door middel van tibiaal boren |
| 0,8 mm draadtype Kirschner-draad | Changzhou Borche Medical Equipment Co., Ltd | - | Voor het bevestigen van botflappen en retractor |
| 1,0 mm draadtype Kirschner-draad | Changzhou Borche Medical Equipment Co., Ltd | - | Voor de bevestiging van de retractor |
| Pentobarbital natrium | Shanghai Pharmaceuticals Holding Co., Ltd | - | Voor het verdoven van dieren |
| Inbussleutel | Changzhou Borche Medical Equipment Co., Ltd | - | Voor het bevestigen van schroeven |
| Buprenorfine | Shanghai Pharmaceuticals Holding Co., Ltd | Voor pijnstilling bij dieren | |
| MICROFIL | Flow Tech,Inc Co., Ltd | Angiografie van dieren | |
| Isofluraan | Hebei Yipin Pharmaceutical Co., Ltd. | Voor inductie en onderhoud van inhalatieanesthesie | |
| Lidocaine Hydrochloride (0,5%) | Hebei Yipin Pharmaceutical Co., Ltd. | Gebaten voor lokale infiltratie om pijn na de operatie te verminderen en weefselirritatie tijdens chirurgische ingrepen tot een minimum te beperken |
Referenties
- Jones, D. W., Farber, A. Review of the global vascular guidelines on the management of chronic limb-threatening ischemia. JAMA Surg. 155 (2), 161(2020).
- Levin, S. R., Arinze, N., Siracuse, J. J. Lower extremity critical limb ischemia: a review of clinical features and management. Trends Cardiovasc Med. 30 (3), 125-130 (2020).
- Aboyans, V., Chastaingt, L. What LEADs to the under-treatment of patients with lower-extremity artery disease. Eur J Prev Cardiol. 30 (11), 1090-1091 (2023).
- Liu, Z., Xu, C., Yu, Y., Tu, D., Peng, Y., Zhang, B. Twenty years development of tibial cortex transverse transport surgery in PR China. Orthop Surg. 14 (6), 1034-1048 (2022).
- Ilizarov, G. A. The tension-stress effect on the genesis and growth of tissues: part II. The influence of the rate and frequency of distraction. Clin Orthop Relat Res. 239, 263-285 (1989).
- Ilizarov, G. A. The tension-stress effect on the genesis and growth of tissues: part I. The influence of stability of fixation and soft-tissue preservation. Clin Orthop Relat Res. 238, 249-281 (1989).
- Chen, Y., et al. Proximal tibial cortex transverse distraction facilitating healing and limb salvage in severe and recalcitrant diabetic foot ulcers. Clin Orthop Relat Res. 478 (4), 836-851 (2020).
- Beckman, J. A., Schneider, P. A., Conte, M. S. Advances in revascularization for peripheral artery disease: revascularization in PAD. Circ Res. 128 (12), 1885-1912 (2021).
- Zhu, Y. L., Qu, L., Ye, Z. M. Tibial cortex transverse distraction for primary lymphoedema in the lower limb: a case report. J Orthop Transl. 25, 25-27 (2020).
- Yang, Y., et al. Tibial cortex transverse transport accelerates wound healing via enhanced angiogenesis and immunomodulation. Bone Joint Res. 11 (4), 189-199 (2022).
- Hasanpour, M., Mitricheva, E., Logothetis, N., Noori, H. R. Intensive longitudinal characterization of multidimensional biobehavioral dynamics in laboratory rats. Cell Rep. 35 (2), 108987(2021).
- Modlinska, K., Pisula, W. The Norway rat, from an obnoxious pest to a laboratory pet. eLife. 9, e50651(2020).
- Su, H., et al. Finite element analysis safety of tibial cortex transverse transport. Bone Joint Res. 14 (4), 281-291 (2025).
- Zhen, P., et al. Finite element analysis of biomechanical effects in rat tibia during tibial cortex transverse transport. Front Bioeng Biotechnol. 13, 1670040(2025).
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Herprints en machtigingen
