Hier presenteren we een protocol om de stappen voor het anastomoseren van de diepe cervicale lymfeklier of het afferente lymfevaat met de achterste gezichtsader bij de rat duidelijk te definiëren, om de invloed van andere variabelen te minimaliseren en de uitvoering van chirurgisch onderzoek te standaardiseren.
Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.
Methodenartikel
Chirurgische protocollen voor diepe cervicale lymfoveneuze anastomose in een rattenmodel: lymfeklier- en lymfevatenanastomosen
* These authors contributed equally
In dit artikel
Samenvatting
Samenvatting
Diepe cervicale lymfoveneuze anastomose (dcLVA) is een veelbelovende behandelingsstrategie geworden voor de ziekte van Alzheimer (AD) en biedt aanzienlijke verbeteringen in vergelijking met de huidige beperkte behandelingsopties. Het onderliggende mechanisme van dcLVA blijft echter onduidelijk. Hoewel klinische proeven aan de gang zijn, bieden diermodellen die dcLVA simuleren een waardevol hulpmiddel om het mechanisme ervan te onderzoeken. Deze studie heeft tot doel een gestandaardiseerd protocol te ontwikkelen voor het maken van dcLVA-modellen bij dieren om fundamenteel onderzoek te vergemakkelijken en klinische uitdagingen aan te pakken. We beschrijven de chirurgische ingrepen en de belangrijkste stappen voor het anastomoseren van de diepe cervicale lymfeklier (dcLN) en het afferente lymfevaat (ALV) met de achterste gezichtsader (PFV), waarbij we deze twee verschillende chirurgische methoden beschrijven: diepe cervicale lymfeklier-ader anastomose (dcLnVA) en diepe cervicale lymfevaat-ader anastomose (dcLaVA). Naast het bevorderen van lymfedrainage, helpt de vergelijking van deze twee chirurgische methoden ons ook om de rol van de diepe cervicale lymfeklier en het diepe cervicale lymfestelsel in de pathogenese van AD te begrijpen en te onderzoeken. Over het algemeen helpt de volledige en duidelijke presentatie van de chirurgische ingreep en de belangrijkste anatomische oriëntatiepunten bij de rat om het chirurgische protocol te standaardiseren, die verstorende factoren kunnen minimaliseren en interexperimentele variabiliteit kunnen verminderen, waardoor een solide methodologische basis wordt gelegd voor een dieper begrip van de betrokken mechanismen.
Inleiding
De ziekte van Alzheimer (AD) is een geleidelijk progressieve neurodegeneratieve aandoening die vaak leidt tot cognitieve achteruitgang. De kenmerkende pathologische kenmerken van AD zijn amyloïde-bèta (Aβ) plaques en neurofibrillaire knopen, die worden gevormd door abnormaal gefosforyleerde tau-eiwitten. Recent onderzoek naar het lymfestelsel van de hersenen heeft nieuwe therapeutische wegen geopend voor de behandeling van AD. Dit systeem vergemakkelijkt de afvoer van Aβ uit de interstitiële vloeistof (ISF) naar de cerebrospinale vloeistof (CSF) en vervolgens naar de diepe cervicale lymfeklieren via de meningeale lymfevaten (mLV's)1. In 2024 rapporteerde het team van professor Xie het eerste geval van cognitieve verbetering bij een AD-patiënt na diepe cervicale lymfoveneuze anastomose (dcLVA) en startte vervolgens een klinische studie (NCT06530732)2.
Hoewel dcLVA, als een nieuwe therapeutische benadering voor AD, veelbelovende perspectieven biedt voor patiënten, moeten de precieze mechanismen die ten grondslag liggen aan de therapeutische effecten ervan verder worden opgehelderd3. Diermodellen bieden een onmisbaar platform om deze mechanismen te onderzoeken. Een uitgebreid begrip van de therapeutische mechanismen van dcLVA zal niet alleen ons begrip van de pathogenese van AD vergroten, maar ook chirurgische technieken optimaliseren, behandelingsindicaties verduidelijken en uiteindelijk grotere klinische voordelen voor patiënten opleveren.
Het team van professor Xie rapporteerde onlangs een dcLVA-model, dat de haalbaarheid aantoont van het verbinden van zijrivieren van de externe halsader met de diepe cervicale lymfeklier4. De beschrijving van het model is echter nog niet voldoende. Ten eerste is de beschrijving van de diepe cervicale lymfeklier (dcLN) en de omringende anatomie ontoereikend. Ten tweede is er geen objectieve, kwantitatieve beoordeling van postoperatieve doorgankelijkheid. Wat nog belangrijker is, er is een gebrek aan gedetailleerde beschrijvingen van de stappen voor anastomose van dcLN en aders, evenals duidelijke en intuïtieve foto's en video's die handig zijn voor het lesgeven.
Gezien het feit dat deze techniek ingewikkelde chirurgische manipulatie met zich meebrengt en rekening houdend met de anatomische verschillen tussen ratten en mensen, kunnen variaties in chirurgische procedures en technische details in rattenmodellen leiden tot aanzienlijke discrepanties in experimentele resultaten. Daarom is het zowel van cruciaal belang als urgent om de relevante anatomische oriëntatiepunten bij ratten duidelijk te illustreren en gedetailleerde technische beschrijvingen van de anastomoseprocedure te geven. Dergelijke inspanningen zijn essentieel om de reproduceerbaarheid en standaardisatie van het chirurgische protocol te verbeteren, waardoor een bredere toepassing door onderzoekers wordt ondersteund en gerelateerd wetenschappelijk onderzoek wordt bevorderd. Bovendien, gezien de diversiteit van klinische chirurgische technieken, zoals lymfeklier-naar-ader anastomose en lymfatische anastomose, en het potentieel voor variërende uitkomsten afhankelijk van de chirurgische benadering, zijn vergelijkende studies gerechtvaardigd om hun relatieve werkzaamheid te evalueren. Als antwoord op deze uitdagingen presenteren we twee zeer reproduceerbare dcLVA-methoden: diepe cervicale lymfeklier-naar-ader anastomose (dcLnVA) en diepe cervicale lymfevaat-ader anastomose (dcLaVA). Deze methoden zijn bedoeld om het proces voor het maken van modellen te standaardiseren en daaropvolgend fundamenteel onderzoek te vergemakkelijken.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Protocol
Deze studie werd uitgevoerd met de goedkeuring van de Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) van de Harbin Medical University (goedkeuring nr. SYDW2025-037). De proefpersonen waren mannelijke Sprague-Dawley (SD) ratten, met een gewicht van 400-500 g en in de leeftijd van 12-14 weken, ter beschikking gesteld door het dierencentrum van de universiteit. Het centrum onderhoudt een Specific Pathogen-Free (SPF) faciliteit en voldoet aan de nationale foknormen.
OPMERKING: Deze studie onderzoekt voornamelijk twee methoden van anastomose tussen de diepe cervicale lymfe en aders. Het tot stand brengen van een chirurgische verbinding tussen de dcLN en de achterste aangezichtsader (PFV); deze techniek wordt dcLnVA genoemd. Het creëren van een anatomische verbinding tussen het diepe cervicale lymfevaat (dcLaV) en de PFV; deze techniek wordt dcLaVA genoemd. We beschrijven beide microchirurgische ingrepen in detail, inclusief hun operatieve methodologieën en evaluatie na anastomose.
1. Preoperatieve voorbereiding
- Verdoving de rat via intraperitoneale injectie van natriumpentobarbital (50 mg/kg). Houd de reacties van de rat nauwlettend in de gaten. Ga alleen verder als de pedaalreflex volledig afwezig is.
- Dien met behulp van een naald met stompe punt langzaam Evans blue (EB) oplossing (ongeveer 60-100 μL/kg, 5%)5 toe in het neusslijmvlies van een eenzijdige neusholte. Plaats de rat in een semi-laterale liggende positie, met de buik naar boven en het EB-geïnjecteerde neusgat naar beneden. Zet het hoofd vast om te voorkomen dat EB het contralaterale neusgat of de luchtwegen binnendringt.
- Scheer het haar in de nek van de rat om een vrij operatieveld te garanderen. Breng vaseline aan op beide ogen om uitdroging of beschadiging van het hoornvlies tijdens de operatie te voorkomen.
2. Chirurgische incisie
- Desinfecteer de middellijn van de nek van de rat drie keer met jodiumtinctuur om een steriel operatieveld te garanderen.
- Maak een incisie in de middellijn van ongeveer 3 cm lang met behulp van een chirurgische schaar.
OPMERKING: Zorg ervoor dat u de submaxillaire klier (SMG) en bloedvaten niet beschadigt tijdens dissectie. - Trek de chirurgische incisie in om de sternothyroïdspier (STM), de sternocleidomastoïde spier (SCM) en de omohyoïde spier (OHM) bloot te leggen.
3. Bereiding van de PFV
- Identificeer de PFV, een zijrivier van de externe halsader (EJV), langs de laterale rand van de SCM.
- Sluit bij de splitsing tussen de PFV en de EJV de PFV af met behulp van een microvasculaire clip.
- Ga door met het botweg ontleden van de PFV om voldoende lengte te verkrijgen en klem deze aan het distale uiteinde. Zorg ervoor dat het PFV-segment zo los mogelijk blijft om latere tractie mogelijk te maken tijdens anastomose met de dcLN.
- Maak een longitudinale incisie evenwijdig aan de vaatas met behulp van een microvasculaire schaar.
OPMERKING: Zorg ervoor dat de PFV-incisie in de lengterichting is, aangezien de transversale incisie kan worden vergroot en gescheurd door tractie. - Spoel het geïsoleerde vasculaire segment grondig met gehepariniseerde zoutoplossing (0,1% natriumheparine in 0,9% NaCl) totdat de intravasculaire erytrocyten volledig zijn geklaard.
4. Lymfeklier-ader anastomose
- Verken en belicht dcLN en zijn afferente lymfevaat (ALV) in het midden van de STM en SCM4.
- Ontleed de dcLN geleidelijk met behulp van een botte techniek. Snijd voorzichtig de fascia tussen de dcLN en de omliggende weefsels in en vermijd schade aan zowel de dcLN als de ALV.
OPMERKING: Zorg ervoor dat PFV en dcLN dicht bij elkaar liggen om spanning na anastomose te minimaliseren. - Maak een incisie aan het distale uiteinde van de dcLN. Zorg ervoor dat de breedte van de incisie kleiner is dan of vergelijkbaar is met de diameter van de PFV, zodat de PFV-bloedstroom niet significant wordt beïnvloed.
- Gebruik een 12-0 nylon hechtdraad om het proximale uiteinde van de PFV-incisie te anastomoseren met het proximale uiteinde van de dcLN-incisie.
- Ga door met het uitbreiden van de incisielengte van de PFV naar het distale uiteinde, zodat deze iets groter is dan de lengte van de dcLN-incisie.
- Steek de naald achtereenvolgens door de buitenrand van de dcLN-transsectie en de binnenrand van de PFV-incisie, waardoor de dcLN-transsectie in het lumen van PFV wordt getrokken.
- Voer een continue hechting uit van de inferieure naar de superieure rand van de dcLN-doorsnijding. Dien heparinenatrium nog een keer toe vlak voor het voltooien van de laatste hechting om trombusvorming in het PFV-lumen te voorkomen. Zorg voor de juiste spanning op de hechtdraad tijdens de continue sluiting om een veilige sluiting te garanderen en latere lekkage te voorkomen.
- Plaats onderbroken hechtingen op plaatsen waar de continue anastomose los zit.
5. Lymfevaat-ader anastomose
- Transecteer de ALV en bewaar het omringende weefsel om als hechtankerpunt te dienen.
- Gebruik een 12-0 hechtnaald om deze ongeveer 2 mm proximaal van de PFV-incisie in te brengen en deze naar buiten te brengen door de opening van de PFV-incisie.
- Ga met de hechtnaald het weefsel in de buurt van de stomp van ALV in om de ALV op te vangen.
- Steek de naald in de PFV-incisie en naar buiten door de proximale rand, en bind vervolgens de hechtdraad vast aan de fixatie van de ALV-stomp in het lumen van PFV.
OPMERKING: Steek de ALV-stomp volledig in het lumen van PFV en richt deze in de proximale richting om de fysiologische drainage te behouden. - Hecht het omringende weefsel nabij de stomp van ALV aan de binnenrand van de PFV-incisie om externe fixatie te bieden. Geef heparine-natrium voor de laatste steek om het PFV-lumen vrij van stolsels te houden.
6. Hechtdraad en postoperatieve zorg
- Voer continu hechten uit voor de onderhuidse fascia en onderbroken hechten voor de opperhuid.
- Desinfecteer het operatiegebied met jodiumtinctuur. Breng vervolgens erytromycinezalf gelijkmatig rond de incisie aan om infectie te voorkomen.
- Postoperatief toedienen penicilline-natrium (800.000 eenheden/kg) via intraperitoneale injectie eenmaal daags gedurende vijf opeenvolgende dagen om het risico op infectie te verminderen.
7. Validatie van anastomose
- Identificeer en ontleed de voorste gezichtsader (AFV), een zijrivier van de EJV, lateraal van de PFV.
- Controleer het succes van de anastomose door significant intensere kleuring in de PFV te observeren in vergelijking met de aangrenzende AFV.
- Kwantificeer kleurveranderingen objectief met behulp van de gestandaardiseerde CIE LAB-kleurruimte. Definieer en extraheer Regions of Interest (ROI's) in Fiji om de gemiddelde CIE L*a*b*-waarden te verkrijgen en bereken vervolgens de tinthoek (h°) in graden met behulp van de formule:
h° = atan2(b, a) × (180/π)6,7.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Resultaten
De chirurgische ingrepen en postoperatieve resultaten van dcLnVA en dcLaVA worden geïllustreerd met elk één representatief geval. In het geval van dcLnVA werd PFV (2 mm in diameter) geïdentificeerd en gedissocieerd van de laterale rand van de SCM (Figuur 1A, Figuur S1A). In de opening tussen de SCM en STM, ongeveer 4 mm mediaal ten opzichte van de PFV, werd een lange ovale dcLN (5 mm × 4 mm × 2 mm) gevonden en fijn gescheiden (<...
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Discussie
In 2012 beschreven ILif et al. voor het eerst het glymfatisch systeem8. In 2015 identificeerden Louveau et al. T-celaggregaten in het lumen van lymfevaten en noemden deze structuren meningeale lymfevaten. Ze toonden verder aan dat meningeale lymfevaten verbonden zijn met zowel het glymfatische systeem als dcLN. Samenvattend, onder de regulatie van het lymfestelsel van de hersenen, inclusief zowel het glymfatische systeem als meningeale lymfevaten, wordt Aβ in de i...
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Openbaarmakingen
De auteurs hebben niets te onthullen.
Dankbetuigingen
Dit werk werd ondersteund door de National Natural Science Foundation of China (82173384 en 81773161), het Key Research and Development Program van de provincie Heilongjiang (2023ZX06C11) en het Genertec Medical Scientific Research Fund Project (TYYLKYJJ-2024-043).
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Materialen
| Naam | Bedrijf | Catalogusnummer | Opmerkingen |
|---|---|---|---|
| 0.9% steriele zoutoplossing | Shandong Qidu Pharmaceutical Co., Ltd. | R9824041307 | |
| Erythromycine zalf | Sanqi Pharmaceutical Co., Ltd. | H34020307 | |
| Evans blauwe kleurstof 5% (50mL) | LEAGENE | DK0053 | |
| Heparine-natriumoplossing 0,1% | BIOSCO | BAC006 | |
| Micro-tang | ANLIXIN | AT-15 | |
| Microvasculaire klem | Tigergene | TG-AC-18-Z | |
| Penicilline-natrium | Hebei Yuanzheng Hemu Pharmaceutical Co., Ltd | JFT230602 | |
| Witte vaseline | Tiancheng | 20250202 |
Referenties
- Formolo, D. A., et al. Leveraging the glymphatic and meningeal lymphatic systems as therapeutic strategies in Alzheimer's disease: an updated overview of nonpharmacological therapies. Mol Neurodegener. 18 (1), 26(2023).
- Li, X., et al. Promising outcomes 5 weeks after a surgical cervical shunting procedure to unclog cerebral lymphatic systems in a patient with Alzheimer's disease. Gen Psychiatr. 37 (3), e101641(2024).
- Chen, J. Y., et al. Deep cervical lymphovenous anastomosis (LVA) for Alzheimer's disease: microsurgical procedure in a prospective cohort study. Int J Surg. 111 (7), 4211-4221 (2025).
- Fang, R., et al. A novel microsurgical model of cervical lymph node-to-vein anastomosis (LNVA) for studying brain lymphatic outflow. J Craniofac Surg. 36 (6), 2160-2163 (2025).
- Maloveska, M., et al. Dynamics of Evans blue clearance from cerebrospinal fluid into meningeal lymphatic vessels and deep cervical lymph nodes. Neurol Res. 40 (5), 372-380 (2018).
- Mazur, F., Han, Z., Tjandra, A. D., Chandrawati, R. Digitalization of colorimetric sensor technologies for food safety. Adv Mater. 36 (42), e2404274(2024).
- Karamucki, T., Rybarczyk, A., Jakubowska, M., Sulerzycka, A. A comparison of two methods of determining colour change in the assessment of the quality of pork. Acta Sci Pol Technol Aliment. 16 (3), 321-329 (2017).
- Iliff, J. J., et al. A paravascular pathway facilitates CSF flow through the brain parenchyma and the clearance of interstitial solutes, including amyloid β. Sci Transl Med. 4 (147), 147ra111(2012).
- Louveau, A., et al. Structural and functional features of central nervous system lymphatic vessels. Nature. 523 (7560), 337-341 (2015).
- Da Mesquita, S., et al. Functional aspects of meningeal lymphatics in ageing and Alzheimer's disease. Nature. 560 (7717), 185-191 (2018).
- Wang, M., et al. Non-invasive modulation of meningeal lymphatics ameliorates ageing and Alzheimer's disease-associated pathology and cognition in mice. Nat Commun. 15 (1), 1453(2024).
- Proulx, S. T. Cerebrospinal fluid outflow: a review of the historical and contemporary evidence for arachnoid villi, perineural routes, and dural lymphatics. Cell Mol Life Sci. 78 (6), 2429-2457 (2021).
- Yoon, J. H., et al. Nasopharyngeal lymphatic plexus is a hub for cerebrospinal fluid drainage. Nature. 625 (7996), 768-777 (2024).
- Zhou, Y., et al. Impaired peri-olfactory cerebrospinal fluid clearance is associated with ageing, cognitive decline and dyssomnia. EBioMedicine. 86, 104381(2022).
- Papadopoulos, Z., et al. Differential impact of lymphatic outflow pathways on cerebrospinal fluid homeostasis. J Exp Med. 222 (2), e20241752(2025).
- Mehta, N. H., et al. The brain-nose interface: a potential cerebrospinal fluid clearance site in humans. Front Physiol. 12, 769948(2021).
- Norwood, J. N., et al. Anatomical basis and physiological role of cerebrospinal fluid transport through the murine cribriform plate. Elife. 8, e44278(2019).
- Fan, F., Zhao, N., Guo, M. Lymphatic-venous anastomosis: cracking the code of Alzheimer's disease treatment. Neural Regen Res. , (2025).
- Hong, J. P., Chen, W. F., Nguyen, D. H., Xie, Q. A proposed role for lymphatic supermicrosurgery in the management of Alzheimer's disease: a primer for reconstructive microsurgeons. Arch Plast Surg. 52 (2), 96-103 (2025).
- Nguyen, L., et al. Role of sigma-1 receptors in neurodegenerative diseases. J Pharmacol Sci. 127 (1), 17-29 (2015).
- Pierre, K., et al. Chronic traumatic encephalopathy: diagnostic updates and advances. AIMS Neurosci. 9 (4), 519-535 (2022).
- Chen, J. Y., et al. Deep cervical lymphovenous anastomosis (LVA) for Alzheimer's disease: microsurgical procedure in a prospective cohort study. Int J Surg. 111 (7), 4211-4221 (2025).
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Herprints en machtigingen
