Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.

Methodenartikel

Een geavanceerd co-kweekmodel van de menselijke bloed-cerebrospinale vloeistofbarrière voor aparte analyse van het choroïdale plexusepitheel en endotheel

430 weergaven

⸱

DOI:

10.3791/69275

⸱

28 november 2025

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Pediatric Infectious Diseases, Department of Pediatrics, Medical Faculty Mannheim, Heidelberg University, 2European Center for Angioscience, Medical Faculty Mannheim, Heidelberg University, 3Department of Medical Statistics, Biomathematics and Information Processing, Medical Faculty Mannheim, Heidelberg University, 4Laboratory of Clinical Regenerative Medicine, Department of Neurosurgery, Faculty of Medicine, University of Tsukuba

In dit artikel

Samenvatting

Er werd een co-kweek van menselijke epitheel- en endotheelcellen van de choroidplexus ontwikkeld om een geavanceerd in vitro model van de bloed-hersenvochtbarrière te genereren. We beschrijven de afzonderlijke isolatie van epitheel en endotheel voor latere RNA-voorbereiding en transcriptieanalyse onder geselecteerde omstandigheden.

Samenvatting

De sterk doorbloede choroïdale plexus (CP), gelegen in het ventrikelsysteem van de hersenen, bestaat uit verschillende structurele componenten, waaronder een kubusepitheel en een fenestreerd endotheel, en is de locatie van de bloed-cerebrospinale vloeistofbarrière (BCSFB). Om de CP in vitro te onderzoeken, zijn verschillende celkweekopstellingen mogelijk. Een inverted celkweekfiltermodel met sterke barrièrefunctie, gebaseerd op humane epitheliale CP-papilloma (HIBCPP)-cellen, is door ons laboratorium ontwikkeld en wordt uitgebreid gebruikt. Onlangs konden we een stabiele onsterfelijke menselijke CP-endotheelcellijn (iHCPEnC) genereren. Door beide cellijnen te combineren, hebben we een geavanceerd functioneel tweecelmodel samengesteld dat een verhoogde barrièrefunctie ontwikkelde ten opzichte van alleen HIBCPP-cellen. Omdat dit model zowel het CP-epitheel als het endotheel vertegenwoordigt, maakt het het mogelijk om de wisselwerking tussen de twee celtypen onder geselecteerde omstandigheden te onderzoeken, zoals infectie, ontsteking of andere. In dit protocol beschrijven we methoden om dit tweecel-type model op te zetten met daaropvolgende scheiding van de epitheel- en endotheelcellen voor transcriptieanalyses. We beschrijven PCR-primers specifiek voor epitheel en endotheel, die dienen om mogelijke kruisbesmetting tussen de twee celtypen te detecteren. Om een mogelijke impact van het CP-endotheel op het epitheel in dit model onder ontstekingsomstandigheden te onderzoeken, werden de expressieniveaus van geselecteerde genen in de context van lipopolysaccharide (LPS)-behandeling geanalyseerd in de HIBCPP-celfractie. Het geavanceerde CP in vitro model en de mogelijkheid om epitheliale en endotheliale responsen afzonderlijk te analyseren, zijn van groot belang voor onderzoek naar cellulaire processen met biologische en pathologische functies van de CP.

Inleiding

De choroïdale plexus (CP) is een sterk vasculariseerd conglomeraat van verschillende populaties cellen die zich in alle vier de hersenen bevinden. Onder andere functies fungeert het als een fysiologische barrière, de zogenaamde bloed-hersenvochtbarrière (BCSFB), tussen het centrale zenuwstelsel (CZS) en het bloed, waardoor de hersenen bijvoorbeeld voorkomen dat infectieuze stoffen in het bloed circuleren. De CP bestaat uit verschillende celtypen, waaronder de gepolariseerde epitheelcellen, die tight- en adherence-verbindingen bevatten, evenals desmosomen, die op een basalmembraan zitten. Het oppervlak van de epitheelcellen wordt vergroot door de aanwezigheid van microvilli op het luminale oppervlak. Fenestergeerde endotheelcapillairen, omgeven door bindweefsel zoals fibroblasten en immuuncellen, bevinden zich onder het basale membraan 1,2,3. Onlangs is gerapporteerd dat CP-endotheelcellen de integriteit van BCSFB kunnen versterken samen met de epitheelcellen en dus een rol kunnen spelen in hersenbescherming tijdens ontstekingsprocessen 4,5.

Tot nu toe is de omgekeerde kweek van humane epitheliale CP-papilloma (HIBCPP)-cellen het meest gebruikte in vitro-model om een menselijke BCSFB met hoge transepitheliale elektrische weerstand (TEER) waarden en een sterke barrièrefunctie na te bootsen. Om een beter begrip te krijgen van cellulaire functies en tegelijkertijd dierproeven te vermijden, is het belangrijk om zoveel mogelijk informatie uit in vitro-experimenten te halen. De eerste stabiele geïmmortaliseerde humane CP-endotheelcellijn (iHCPEnC) werd onlangs in ons laboratorium vastgesteld 6,7. Met behulp van HIBCPP-cellen en iHCPEnC kunnen we een co-cultuur in vitro model samenstellen dat de BCSFB op een geavanceerdere manier imiteert8. Met dit tweeceltypemodel konden we aantonen dat de co-kweek van HIBCPP-cellen en iHCPEnC leidt tot hogere TEER-waarden in vergelijking met alleen HIBCPP-cellen. Het is belangrijk op te merken dat iHCPEnC alleen geen TEER 7,8 ontwikkelt. Aparte voorbereiding en daaropvolgende analyses van de twee celtypen die in dit model worden gebruikt, zouden ons in staat stellen hun wisselwerking onder gezonde en zieke omstandigheden te onderzoeken.

Hier beschrijven we twee verschillende benaderingen om dit doel te bereiken. De basis is dat in beide gevallen de benadering gebaseerd is op het omgekeerde celkweekmodel van de HIBCPP-cellen (Figuur 1). Methode 1, de "directe co-kweek" methode, omvat beide cellen op één filterinsert. HIBCPP-cellen worden omgekeerd gekweekt voordat iHCPEnC wordt gezaaid op standaard wijze 7,8. Methode 2, de "membraan-in-in-inzet"-cultuur, hier voegden we een apart membraan toe met dezelfde eigenschappen als het membraan dat in de filterinzetstukken werd gebruikt. Dit extra membraan wordt in een filterinsert geplaatst waar HIBCPP-cellen al in omgekeerde kweek groeien. iHCPEnC worden in standaard kweekstijl op het extra membraan gezaaid.

De daaropvolgende scheiding van de cellen voor RNA-analyse biedt inzicht in de transcriptiereactie van het CP-epitheel en endotheel onder geselecteerde omstandigheden. We beschrijven PCR-primers die specifiek zijn voor HIBCPP-cellen en iHCPEnC, die de bevestiging van de succesvolle en schone scheiding van beide celtypen mogelijk maken. Na behandeling met lipopolysaccharide (LPS) gebruiken we de beschreven modellen om de verschillende responsen van het CP-epitheel te onderzoeken in aanwezigheid van het endotheel onder inflammatoire omstandigheden.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

1. HIBCPP-cellen

OPMERKING: In het volgende beschrijven we de kweek en het onderhoud van HIBCPP-cellen, evenals de voorbereiding van inverted celkweekfilterinserts met HIBCPP-cellen. Dit protocol is ontworpen voor de groei van HIBCPP-cellen op 12-put celkweekfilterinserts. Een gedetailleerd protocol met bijbehorende video voor de kweek van HIBCPP-cellen op 24-well celkweekfilterinserts is eerder gepubliceerd9.

  1. Het opbrengen van HIBCPP-cellen in cultuur
    1. Ontdooi een flesje HIBCPP-cellen op kamertemperatuur (RT).
    2. Suss de inhoud van het buisje opnieuw met 10 mL DMEM/HAMS-F12 medium met 10% foetaal kalfsserum (FCS) en 5 μg insuline/mL voorverwarmd medium (10% HIBCPP medium).
    3. Plaats de geresuspendeerde HIBCPP-cellen in een T75-celkweekkolf en incubeer 24 uur bij 37 °C met 5%CO2.
    4. Verander het medium van de kolf om de DMSO 24 uur na het zaaien van de cellen te verwijderen.
    5. Kweek de cellen tot 90% confluentie, deze stap duurt ongeveer 2 weken. Verander het medium twee keer per week.
  2. Continue kweek van HIBCPP-cellen
    OPMERKING: Voor continue kweek splitst je HIBCPP-cellen 1:3 in nieuwe T75-celkweekflessen.
    1. Verwijder het kweekmedium uit de T75-kolf.
    2. Was cellen één keer met 10 mL PBS.
    3. Verwijder de PBS.
    4. Koppel HIBCPP-cellen los met behulp van 3 mL 0,25% trypsine-EDTA. Deze stap duurt ongeveer 10-20 minuten bij 37 °C. Draai ondertussen de kolf om de cellaag volledig te bedekken met trypsine-EDTA.
    5. Voeg 7 ml HIBCPP-medium toe en centrifugeer op 50 x g gedurende 10 minuten bij RT.
    6. Sussie de celpellet opnieuw in 30 mL van 10% HIBCPP-medium en verspreid over 3 nieuwe T75-flessen.
    7. Kweek de cellen tot 90% confluentie; De cellen bereiken na ongeveer een week confluentie.
    8. Verander het medium twee keer per week.
      OPMERKING: HIBCPP-cellen worden niet geremd door groei; Daarom zal de kolf samenvloeien en zullen cellen blijven groeien en meerdere lagen vormen.
  3. Het zaaien van HIBCPP-cellen in omgekeerde kweek
    1. Verwijder het kweekmedium uit de T75-kolf.
    2. Was cellen één keer met 10 mL PBS.
    3. Verwijder de PBS.
    4. Koppel HIBCPP-cellen los met behulp van 3 mL 0,25% trypsine-EDTA. Deze stap duurt ongeveer 10-20 minuten bij 37 °C. Draai ondertussen de kolf om de cellaag volledig te bedekken met trypsine-EDTA.
    5. Bereid ondertussen de filterinserts voor. Draai 12-put filterinserts in een omgekeerde oriëntatie om in een 6-put celkweekplaat met behulp van een tang en vul ze met voorverwarmd 10% HIBCPP-medium. Maak het membraan vooraf nat met een druppel medium bovenop elke filterinsert.
    6. Resuspendeer trypsinisatiecellen met 17 mL van 10% HIBCPP-medium.
    7. Centrifugeer op 50 x g gedurende 10 minuten bij RT en stel HIBCPP-cellen aan op een concentratie van 1 × 106 cellen /mL.
      OPMERKING: HIBCPP-cellen vormen meestal kleine agglomeraten. Het is niet nodig om ze volledig op te lossen voordat je ze op filterinserts zaadt. Zorg ervoor dat 90% van de cellen één cel is.
    8. Zaad HIBCPP-cellen op omgekeerde wijze op 12-well-filterinserts met een dichtheid van 4 × 105 cellen per insert.
    9. Wacht tot de celsuspensie door het membraan is opgenomen. Sluit het deksel van de 6-put celkweekplaat.
    10. Plaats de platen met de omgekeerde inserts in de broedmachine.
    11. 24 uur na het zaaien draai je de inserts met behulp van een tang in de juiste oriëntatie tot een nieuwe celkweekplaat met 12 putten. Doe 2 ml 10% HIBCPP-medium in het onderste compartiment en 1 ml in het bovenste compartiment.
    12. Laat de cellen 5 tot 6 dagen staan zonder mediumverandering en begin met het bepalen van TEER en het opzetten van co-cultuur.

2. Bepaling van TEER

OPMERKING: Bepaling van TEER-waarden wordt uitgevoerd met behulp van een MilliCell ERS2 en een eetstokjeselektrode. Voor de berekening is een blankmeting van celcultuurfilterinserts in medium zonder cellen (Ohmblank) vereist.

  1. Bewaar de eetstok-elektrode droog. Voordat je met de meting begint, steek je de elektrode 10 minuten in 80% ethanol voor desinfectie.
  2. Spoel daarna de elektrode af met PBS.
  3. Start de meting: Plaats het lange uiteinde van de elektrode in de put en het korte uiteinde van de elektrode in de filterinzet met de zaadcellen.
  4. Noteer de Ohm-waarde van de 12-put celcultuurfilterinsert (Ohmmonster).
  5. Bereken de TEER als volgt: Ohm·cm2 = (Ohmmonster- Ohm blanco) × 1,1 cm2.
  6. Na het afronden van de meting spoel je de elektrode met 80% ethanol en bewaar je hem droog.
    OPMERKING: Tussen metingen van verschillende experimentele omstandigheden of metingen van verschillende cellijnen moet de eetstokjeselektrode worden gedesinfecteerd en afgespoeld met PBS om kruisbesmetting te voorkomen.

3. iHCPEnC

  1. IHCPEnC in cultuur brengen
    1. Ontdooi een flesje iHCPEnC bij RT.
    2. Suss de inhoud van het flesje opnieuw met voorverwarmde 5 ml Complete Classic Endothelial Medium (iHCPEnC medium).
    3. Centrifugeer op 500 g voor 5 minuten bij RT.
    4. In de tussentijd bedek je een T25-celkweekfles met 2 mL Attachment Factor gedurende ongeveer 1 minuut. Aspireer de Attachment Factor en laat de kolf staan totdat je de iHCPEnC zaait.
    5. Suspendeer de celpellet opnieuw met 5 mL iHCPEnC-medium en doe het in de voorbereide T25-celkweekfles.
    6. Incubeer bij 37 °C met 5%CO2 gedurende 1 week zonder enige verandering van medium.
  2. Continue kweek van iHCPEnC
    OPMERKING: Voor continue kweek, splits iHCPEnC 1:4 in nieuwe T25-celkweekflessen.
    1. Verwijder het iHCPEnC-medium en was de cellen één keer met 3 ml PBS. Wees voorzichtig om cellen niet los te laten.
    2. Aspiraat de PBS.
    3. Koppel confluente iHCPEnC los met behulp van 1 ml trypsine-EDTA. Deze stap duurt ongeveer 3-5 minuten bij RT.
    4. Sussief de cellen opnieuw in 5 mL iHCPEnC-medium.
    5. Centrifugeer op 500 g voor 5 minuten bij RT.
    6. In de tussentijd, bedek 4 nieuwe T25-flesjes met 2 mL Attachment Factor per fles.
    7. Sussie de celpellet opnieuw met 20 mL iHCPEnC-medium.
    8. Verdeel 5 ml celsuspensie over elk van de vier voorbereide kolven.
    9. Kweek de cellen opnieuw 1 week lang zonder enige verandering van medium. Ze bereiken de confluency binnen 1 week.
      OPMERKING: iHCPEnC-cellen worden geremd door groei; daarom zal de kolf confluent worden en zullen de overgebleven cellen zweven.

4. Voorbereidingen voor co-kweekexperimenten

  1. Methode 1: Voor "directe co-kweek" (het cultiveren van de epitheel- en endotheelcellen aan beide zijden van één insert), bereid geen extra dingen voor.
  2. Methode 2: Voor de "membraan-in-in-insert" methode voert u de volgende stappen uit:
    1. Pons membranen ter grootte van 12-put celkweekfilter-inserts met behulp van een no. 11 perforateerijzer (overeenkomend met een diameter van 11 mm) uit een apart Din-A-4 membraan.
    2. Doe geponste membranen in een petrischaal.
    3. Steriliseer geponste membranen gedurende 60 minuten met ultraviolet (UV) licht (UV-C, 254 nm).
      OPMERKING: Geponste en gesteriliseerde membranen ter grootte van 12-put celkweekfilterinserts kunnen vooraf worden voorbereid en onder steriele omstandigheden worden opgeslagen.

5. Het opzetten van de co-cultuur

OPMERKING: In dit stadium zijn de HIBCPP-cellen al voorbereid op het tweeceltype in vitro kweekmodel. HIBCPP-cellen zijn 5 tot 6 dagen gekweekt (vergelijk stappen 1.3.8-1.3.12). HIBCPP-cellen zouden een TEER moeten beginnen te ontwikkelen (ongeveer 20 Ohm·cm2).

  1. Voor beide, Methode 1 ("directe co-kweek") en Methode 2 ("membraan-in-insert"), vervang het 10% HIBCPP-medium door 1% HIBCPP-medium. Hiervoor plaats je 2 ml 1% HIBCPP-medium in een put van een celkweekplaat met 12 putjes.
  2. Leeg de filterinsert met omgekeerde cultuur met behulp van een pipet en een tang, en plaats de filterinsert in standaardgepositioneerde richting in de voorbereide 12-put put.
  3. Voor methode 2 ("membraan-in-in-inzet"), bereid filterinvoegsels als volgt voor:
    1. Plaats het uitgestanste en gesteriliseerde membraan in een voorbereid 12-put filterinsert met HIBCPP-cellen in omgekeerde kweek met behulp van een tang.
  4. Plaats de celkweekplaten terug in de broedmachine voor de trypsinisatie van de iHCPEnC (beschreven in stap 6).

6. Zaaien en teelt van iHCPEnC in co-teelt

OPMERKING: In de volgende sectie wordt de oprichting van een co-kweek van HIBCPP-cellen en iHCPEnC op 12-put celkweekfilterinserts beschreven. Een gedetailleerd protocol voor co-kweek van HIBCPP-cellen en iHCPEnC op 24-put celkweekfilterinserts is eerder beschreven8. Bereken voordat je iHCPEnC loskoppelt hoeveel cellen nodig zijn om de co-kweek uit te voeren. Een confluente T25-celkweekfles levert een ongeveer hoeveelheid van 5 × 105cellen .

  1. Verwijder het medium van een samenvloeiende T25-fles met iHCPEnC.
  2. Was iHCPEnC met 3 ml PBS. Vermijd het losmaken van de cellen.
  3. Verwijder de PBS.
  4. Koppel confluente iHCPEnC los met behulp van 1 ml trypsine-EDTA. Deze stap duurt ongeveer 3-5 minuten bij RT.
  5. Sussen de cellen opnieuw in een 5 mL/T25 kolf met iHCPEnC-medium.
  6. Tel de cellen in een Neubauer-kamer.
  7. Centrifugeer op 500 × g gedurende 5 minuten bij RT.
  8. Susseb de celpellet opnieuw tot een eindconcentratie van 1 × 105 cellen/mL in iHCPEnC-medium.
  9. Zowel Methode 1 ("directe co-cultuur") als Methode 2 ("membraan in inzet"): zaad 700 μL iHCPEnC (7x105 cellen) in een 12-put filterinzet.
  10. Monitor de TEER-waarden van de co-kweek en controles (d.w.z. HIBCPP-cel- en alleen iHCPEnC-culturen) voor het eerst 24 uur na het zaaien van iHCPEnC en daarna dagelijks.

7. LPS-behandeling

OPMERKING: Co-culturen zouden hogere TEER-waarden moeten vertonen vergeleken met alleen HIBCPP-celculturen (voorgestelde factor: 1,5 of hoger).

  1. Meet en registreer TEER-waarden van celkweekinserts die voor experimenten zijn opgezet.
  2. Bereid een mastermix voor met 5 μg/mL LPS in 1% HIBCPP-medium.
  3. Bereid nieuwe platen met 12 putjes voor met 2 ml 1% HIBCPP-medium per put.
  4. Maak de inzetstukken leeg met behulp van een tang en pipetten.
  5. Plaats inserts in de voorbereide wellen.
  6. Voeg respectievelijk 1 ml van de LPS mastermix of 1% HIBCPP-medium toe (negatieve controle).
  7. Broed 4 uur uit bij 37 °C.
  8. Meet en noteer TEER-waarden voordat je doorgaat naar sectie 8.

8. Afzonderlijke isolatie van RNA uit HIBCPP-cellen en iHCPEnC voor latere transcriptieanalyse

OPMERKING: Om twee afzonderlijke celfracties te bereiken en kruisbesmetting te voorkomen met cellen die in het co-cultuurmodel zijn gekweekt, worden de celfracties zorgvuldig afzonderlijk van het inzetstuk geschraapt. Voer alle stappen van RNA-isolatie voor elke filterinsert zonder onderbreking uit (de inserts mogen niet droog raken).

  1. Was filterinzetstukken één keer met PBS. Bereid hiervoor 12-put celkweekplaten voor met 1,5 mL PBS/put.
  2. Maak de celkweekfilterinserts leeg met behulp van een pipet en pincet. Plaats de inserts in de met PBS gevulde 12-put celkweekplaat.
  3. Voeg 1 ml PBS toe aan de inserts.
  4. Om iHCPEnC- en HIBCPP-cellen voor te bereiden op Methode 1 ("directe co-kweek"), voer u de volgende stappen uit:
    1. Haal de PBS uit de insert en plaats deze in een lege en droge 12-well celkweekplaat.
    2. Met behulp van een pipettip en het op en neer pipetteren van 10-20 μL PBS worden de iHCPEnC door schrapen van de insert losgemaakt.
    3. Plaats deze celfractie in een buis van 1,5 mL met 350 μL RNA-lysebuffer. Pipetteer op en neer om de cellen goed te mengen met de RNA-lysebuffer.
    4. Nadat de oogst van de iHCPEnC-fractie is voltooid, draai je de insert ondersteboven in het deksel van een celkweekplaat.
    5. Neem HIBCPP-cellen van het membraan, net als de iHCPEnC-fractie, en plaats ze in een voorbereide 1,5 mL buis met 350 μL RLT-β-mercaptoethanol.
      OPMERKING: Als meerdere co-culturen voor één aandoening worden voorbereid, neem dan 350 μL RNA-lysebuffer per insert en celfractie. Enkelvoudige voorbereide celfracties van één specifieke conditie worden opeenvolgend gezuiverd op dezelfde kolom.
  5. Om iHCPEnC- en HIBCPP-cellen voor te bereiden op Methode 2 ("membraan-in-insert"), voer je de volgende stappen uit:
    1. Verwijder het extra membraan met behulp van een tang en plaats het in een droog deksel van een 12-wells celkweekplaat. Pipetteer 100 μL RNA-lysebuffer op het membraan voor de lysie van iHCPEnC.
    2. Plaats dit 100 μL lysaat in een 1,5 mL buisje met 250 μL RNA-lysebuffer en meng goed.
    3. Haal de PBS uit de filterinsert en plaats deze ondersteboven in het deksel van een celkweekplaat met 12 putjes. Voeg 100 μL RNA-lysebuffer toe aan het membraan van de insert en lys de HIBCPP-celfractie.
    4. Plaats dit 100 μL lysaat in een buisje van 1,5 ml met 250 μL RNA-lysebuffer.
  6. Voer RNA-isolatie uit volgens het protocol van de fabrikant.
  7. Meet de hoeveelheid RNA met behulp van een spectrofotometer.
  8. Voer reverse transcriptie en qPCR-analyse uit van RNA-monsters zoals beschreven door de fabrikant.
    OPMERKING: Omdat de co-culturen minder hoeveelheden iHCPEnC bevatten dan HIBCPP-cellen, zijn er verschillende 12-put filterinserts nodig om voldoende RNA uit iHCPEnC te isoleren, afhankelijk van de daaropvolgende analyse. De RNA-lysaten van de verschillende filterinserts moeten worden samengevoegd. Reverse transcriptie en qPCR kunnen worden uitgevoerd zoals eerder beschreven6.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

In dit protocol beschrijven we de stapsgewijze generatie van een tweeceltypemodel van het menselijke CP, bestaande uit epitheel (HIBCPP-cellen) en endotheel (iHCPEnC) op celkweekfilterinserts, zoals schematisch weergegeven in Figuur 1. In dit modelsysteem worden HIBCPP-cellen omgekeerd gekweekt aan de onderkant van het filter, terwijl iHCPEnC wordt gezaaid aan de bovenzijde van het filter van het inzetstuk of op een tweede filter dat bovenop het membraan van...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

De menselijke CP bestaat uit verschillende celtypen, waaronder een barrièrevormend epitheel en een endotheel van de uitgebreide bloedvaten3. Hoewel de endotheelcellen van de CP fenestrated zijn, heeft recent onderzoek hun bijdrage aan de barrièrefunctie bij BCSFB 4,7 aangetoond. Om de ingewikkelde interacties tussen het endotheel en het epitheel in organen als CP te bestuderen, zijn geavanceerde in vit...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

De auteurs verklaren dat zij geen belangenconflict hebben.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
0.25% Trypsin-EDTALife Technologies 25200056
12 well cell culture plate StarLabCC7682-7512
12 well filter inserts (3 µM pores)Greiner Bio One665631
24 well cell culture plate StarLabCC7672-7524
24 well filter insert  (0.4 µM pores)Greiner Bio One662641
24 well filter insert (3 µM pores)Greiner Bio One662631
6 well cell culture plate StarLabCC7682-7506
AffinityScript cDNA Synthesis Kit (cDNA synthesis )Agilent600559
Attachment FactorCell Systems4ZO-500Onderdeel van de Complete Classic Endotheel Medium kit.
Brilliant II SYBR Green qPCR Master Mix (real-time PCR )Agilent600828
Chopstick electrodeMilliporeMERSSTX01Dit product is niet langer verkrijgbaar.
Complete Classic Endotheel Medium (iHCPEnC medium)Cell Systems4ZO-500Kit, met medium, supplementen en Attachment Factor voor coating.
DMEM/F-12 (1:1) w/ phenolred (10% HIBCPP medium)Thermo Fisher31330-038
DMEM/F-12 (1:1) w/o phenolred (1% HIBCPP medium)Thermo Fisher11039-021
Fetal Calf Serum (FCS) (1% en 10% HIBCPP medium)Thermo Fisher10270-106
Insulin (1% en 10% HIBCPP medium)SigmaI9278
Lipopolysaccharide (LPS)SigmaL3024
MilliCell ERS2 MilliporeMERS00002Dit product is niet langer verkrijgbaar.
Nanodrop (Spectrofotometer)Thermo ScientificND1000Dit product is niet langer verkrijgbaar.
No. 11 perforating ironWürth880223211
PBSLife Technologies 14190169
Primer designing toolNCBIhttps://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast/
Primers SigmaVC00021
Qiagen RNeasy microQiagen74004
RLT+b-ME (onderdeel van Qiagen Rneasy micro kit)Qiagen74004
T25 cell culture flaskSarstedt AG &Co KG83,39,10,002
T75 cell culture flaskSarstedt AG &Co KG83,39,11,002
TRAKETCH PET 3.0 cc (separate membrane)SabeuSK4580
UV lightCarl RothH469.1

Referenties

  1. Damkier, H. H., Brown, P. D., Praetorius, J. Cerebrospinal fluid secretion by the choroid plexus. Physiol Rev. 93 (4), 1847-1892 (2013).
  2. Schwerk, C., Schroten, H. In vitro models of the choroid plexus and the blood-cerebrospinal fluid barrier: advances, applications, and perspectives. Hum Cell. 37 (5), 1235-1242 (2024).
  3. Ghersi-Egea, J. F., et al. Molecular anatomy and functions of the choroidal blood-cerebrospinal fluid barrier in health and disease. Acta Neuropathol. 135 (3), 337-361 (2018).
  4. Carloni, S., et al. Identification of a choroid plexus vascular barrier closing during intestinal inflammation. Science. 374 (6566), 439-448 (2021).
  5. Carloni, S., Rescigno, M. Unveiling the gut-brain axis:structural and functional analogies between the gut and the choroid plexus vascular and immune barriers. Semin Immunopathol. 44 (6), 869-882 (2022).
  6. Denzer, L., et al. Transcriptome and functional comparison of primary and immortalized endothelial cells of the human choroid plexus at the blood-cerebrospinal fluid barrier. Int J Mol Sci. 26 (4), 1779(2025).
  7. Muranyi, W., et al. Immortalized human choroid plexus endothelial cells enable an advanced endothelial-epithelial two-cell type in vitro model of the choroid plexus. iScience. 25 (6), 104383(2022).
  8. Herold, R., et al. Protocol for the setup and use of a human choroid plexus endothelial-epithelial two-cell-type in vitro model. STAR Protoc. 3 (4), 101816(2022).
  9. Dinner, S., et al. A choroid plexus epithelial cell-based model of the human blood-cerebrospinal fluid barrier to study bacterial infection from the basolateral side. J Vis Exp. (111), e54061(2016).
  10. Herold, R., et al. Capsule-dependent impact of MAPK signalling on host cell invasion and immune response during infection of the choroid plexus epithelium by Neisseria meningitidis. Fluids Barriers CNS. 18 (1), 53(2021).
  11. Bernd, A., et al. Characterization of efflux transport proteins of the human choroid plexus papilloma cell line HIBCPP, a functional in vitro model of the blood-cerebrospinal fluid barrier. Pharm Res. 32 (9), 2973-2982 (2015).
  12. Dabbagh, F., Schroten, H., Schwerk, C. In vitro models of the blood-cerebrospinal fluid barrier and their applications in the development and research of (neuro)pharmaceuticals. Pharmaceutics. 14 (8), 1729(2022).
  13. Lun, M. P., Monuki, E. S., Lehtinen, M. K. Development and functions of the choroid plexus-cerebrospinal fluid system. Nat Rev Neurosci. 16 (8), 445-457 (2015).
  14. Zhang, W. Y., Liu, Y., Zhang, H. Extracellular matrix: an important regulator of cell functions and skeletal muscle development. Cell Biosci. 11 (1), 65(2021).
  15. Clark, A. J., et al. Functional imaging in microfluidic chambers reveals sensory neuron sensitivity is differentially regulated between neuronal regions. Pain. 159 (7), 1413-1425 (2018).
  16. Kim, J., Koo, B. K., Knoblich, J. A. Human organoids: model systems for human biology and medicine. Nat Rev Mol Cell Biol. 21 (10), 571-584 (2020).
  17. Augustin, H. G., Koh, G. Y. Organotypic vasculature: from descriptive heterogeneity to functional pathophysiology. Science. 357 (6353), eaal2379(2017).
  18. Furtado, A., et al. Circadian rhythmicity of amyloid-beta-related molecules is disrupted in the choroid plexus of a female Alzheimer's disease mouse model. J Neurosci Res. 101 (4), 524-540 (2023).
  19. Borkowski, J. Neisseria meningitidis elicits a pro-inflammatory response involving IκBζ in a human blood-cerebrospinal fluid barrier model. J Neuroinflammation. 11, 163(2014).
  20. Wiatr, M., et al. Distinct migratory pattern of naive and effector T cells through the blood-CSF barrier following Echovirus 30 infection. J Neuroinflammation. 16 (1), 232(2019).
  21. Speidel, A., et al. Transmigration of Trypanosoma brucei across an in vitro blood-cerebrospinal fluid barrier. iScience. 25 (4), 104014(2022).
  22. Haas, J., et al. The choroid plexus is permissive for a preactivated antigen-experienced memory B-cell subset in multiple sclerosis. Front Immunol. 11, 618544(2020).
  23. Nishihara, H., et al. Human CD4+ T cell subsets differ in their abilities to cross endothelial and epithelial brain barriers in vitro. Fluids Barriers CNS. 17 (1), 3(2020).
  24. Erb, U., Schwerk, C., Schroten, H., Karremann, M. Review of functional in vitro models of the blood-cerebrospinal fluid barrier in leukaemia research. J Neurosci Methods. 329, 108478(2020).
  25. Ho, K. H., et al. Activation of Wnt/β-catenin signaling is critical for the tumorigenesis of choroid plexus. Neuro Oncol. 27 (1), 106-122 (2025).
  26. Wagenaars, F., et al. Characterization of thyroid hormone transport in a human choroid plexus papilloma cell line (HIBCPP) as an in vitro blood-cerebrospinal fluid barrier model. Mol Cell Endocrinol. 597, 112449(2025).
  27. Di Tommaso, N., Santopaolo, F., Gasbarrini, A., Ponziani, F. R. The gut-vascular barrier as a new protagonist in intestinal and extraintestinal diseases. Int J Mol Sci. 24 (2), 1470(2023).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Meer artikelen verkennen

Endotheel van de plexus choroideusHIBCPP-cellengeïmmortaliseerde endotheelcellenbarrièrefunctiein vitro-modelgenexpressieanalysebehandeling met lipopolysachariden
Neem contact met ons op
Aanbevelen aan de bibliotheek

Privacy

Gebruiksvoorwaarden

Beleidsoverzicht

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Alle rechten voorbehouden.