Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.

Onderzoeksartikel

Ganzhirong-granula remt levergluconeogenese via de SIRT3-MPC1-PC/PDH-as bij type 2 diabetes

419 weergaven

⸱

DOI:

10.3791/69500

⸱

12 december 2025

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1College of Traditional Chinese Medicine, Changchun University of Chinese Medicine, 2Department of Gastroenterology, The Affiliated Hospital to Changchun University of Chinese Medicine, 3Research Center of Chinese Traditional Medicine, The Affiliated Hospital to Changchun University of Chinese Medicine, 4Preventive Treatment Center, The Affiliated Hospital to Changchun University of Chinese Medicine

In dit artikel

Samenvatting

Deze studie onderzocht of Ganzhirong Granule hyperglykemie bij type 2 diabetes verlicht door hepatische gluconeogenese via de SIRT3-MPC1-PC/PDH-as te remmen.

Samenvatting

Type 2 diabetes mellitus (T2DM) is een wereldwijde stofwisselingsstoornis die wordt gekenmerkt door leverinsulineresistentie en overmatige gluconeogenese. Ganzhirong Granule (GZRG), een traditionele Chinese medicijnformule, heeft potentieel getoond in de beheersing van T2DM, maar de onderliggende mechanismen, met name wat betreft levergluconeogenese, blijven onduidelijk. Deze studie onderzocht of GZRG hyperglykemie verlicht door het SIRT3-gemedieerde signaalpad te moduleren. De antidiabetische effecten van GZRG werden geëvalueerd bij door hoogvetdieet (HFD)-geïnduceerde T2DM-muizen en door vrije vetzuren (FFA)-geïnduceerde insulineresistente HepG2-cellen. Metabole parameters, glucose- en pyruvaattolerantie, insulinegevoeligheid en lipidenprofielen werden beoordeeld. Moleculaire mechanismen werden onderzocht door de overexpressie en knockdown van SIRT3, waarbij de expressie van belangrijke eiwitten (SIRT3, MPC1, PC, PDH-E2, PCK1 en G6Pase) in het gluconeogene pad werd onderzocht. De behandeling van GZRG verbeterde significant hyperglykemie, verhoogde insulinegevoeligheid en verbeterde het lipidmetabolisme in zowel T2DM-muizen als insulineresistente (IR) HepG2-cellen. Het verzwakte hepatische steatose en onderdrukte gluconeogenese. Mechanistisch verlaagde GZRG de expressie van SIRT3, wat leidde tot gelijktijdige dalingen van MPC1- en PC-niveaus en een toename van PDH-E2. Deze verschuiving in eiwitexpressie leidde het pyruvaatmetabolisme weg van gluconeogenese. SIRT3-overexpressie keerde de onderdrukkende effecten van GZRG op gluconeogenese om, terwijl SIRT3-knockdown synergeergeert met GZRG. GZRG verlicht T2DM door levergluconeogenese te remmen via de SIRT3-MPC1-PC/PDH-as. Deze bevindingen verduidelijken een nieuw moleculair mechanisme van GZRG en benadrukken SIRT3 als een potentieel therapeutisch doelwit voor T2DM-beheer.

Inleiding

Type 2 diabetes mellitus (T2DM) is uitgegroeid tot een van de meest voorkomende en slopende chronische stofwisselingsstoornissen wereldwijd en vormt een aanzienlijke volksgezondheids- en economische last 1,2. Gekenmerkt door insulineresistentie (IR) en progressieve pancreas-β-celdysfunctie, wordt T2DM voornamelijk veroorzaakt door een verstoorde glucose- en lipidehomeostase 3,4. Van de vele organen die betrokken zijn bij glucoseregulatie speelt de lever een centrale rol door endogene glucoseproductie te regelen via glycogenolyse en gluconeogenese5. Overmatige levergluconeogenese is een belangrijke factor in nuchtere hyperglykemie, een kenmerk van de T2DM-pathofysiologie, en vormt een cruciaal therapeutisch doel om het glucoseevenwichtte herstellen 6.

Huidige hypoglykemische middelen – waaronder metformine7, thiazolidinedionen8, GLP-1 receptoragonisten9 en SGLT2-remmers10 – bereiken glycemische controle via verschillende mechanismen, maar hun langdurige gebruik wordt vaak beperkt door bijwerkingen, afnemende effectiviteit of therapie-intolerantie. Daarom is er toenemende interesse in complementaire of alternatieve therapeutische benaderingen die veilig en effectief meerdere metabole routes kunnen targeten. Traditionele Chinese geneeskunde (TCM), gekenmerkt door haar farmacologische eigenschappen met meerdere componenten en meerdere doelgroepen, biedt veelbelovende vooruitzichten voor het beheersen van complexe metabole ziekten zoals T2DM 11,12,13,14,15. Verschillende klassieke TCM-formuleringen zijn gerapporteerd om insulineresistentie te verlichten, het lipidmetabolisme te verbeteren en hepatische gluconeogenese te onderdrukken via geïntegreerde regulerende mechanismen16,17.

Ganzhirong-granulet (GZRG) is een gestandaardiseerde TCM-formule met een geschiedenis van klinisch gebruik bij het beheersen van stofwisselingsstoornissen. GZRG is een kruidenformulering die bestaat uit acht medicinale kruiden. Op basis van onze eerdere fytochemische en farmacologische onderzoeken is een reeks bioactieve verbindingen geïdentificeerd in GZRG, waaronder maar niet beperkt tot Salvianolzuur B, D-stachyose, proanthocyanidinen, violet oxalzuur, Salvianolzuur A, Salvianolzuur C, Calycosin 7 glucoside, 3′-methoxypuerarin, 3′-hydroxy puerarin, Apigenin-7-o-beta-d-pyrano, Emodin-8-O-β-D-glucose, Chrysophanol-1-O-glucoside, Chrysophanol-8-O-glucoside, Puerarin, Rosmarininezuur, Cryptotanshinon, Catechine, Ft-nyflavin, Calycosin, Rhein, Guanosine, Oleïnezuur, Aloë emodin, Formononetine, Palmitinezuur, Chrysofanol, D-tryptofaan, Danshensu, ferulinezuur, Mannitol, Galuszuur en L-fenylalanine. Een fundamenteel voordeel van de traditionele Chinese geneeskunde (TCM) bij het beheersen van type 2 diabetes ligt in de synergistische werking van meerdere componenten en doelgroepen. De tientallen actieve bestanddelen in GZRG zullen waarschijnlijk interageren met meerdere biologische processen – zoals insuline-signaalroutes, glycogeenmetabolisme en ontstekingsreacties – en zo een geïntegreerd netwerkeffect veroorzaken dat niet adequaat kan worden gerepliceerd door één enkele gezuiverde verbinding18. Eerder onderzoek heeft aangetoond dat GZRG gunstige effecten heeft op glucose- en lipidmetabolisme in diabetische modellen19; de precieze moleculaire mechanismen die aan deze effecten ten grondslag liggen blijven echter onduidelijk. In het bijzonder is nog niet duidelijk of GZRG zijn antidiabetische werking uitoefent door hepatische gluconeogene signalering te moduleren.

Sirtuin 3 (SIRT3), een mitochondriale NAD⁺-afhankelijke deacetylase, is een cruciale regelaar van de cellulaire energiehomeostase20. Door het deacetyleren en activeren van belangrijke metabole enzymen beïnvloedt SIRT3 mitochondriale oxidatieve fosforylering, vetzuuroxidatie en gluconeogenese21. Abnormale SIRT3-expressie is in verband gebracht met de pathogenese van insulineresistentie, vetlever en T2DM22,23. Bewijs wijst erop dat lever-SIRT3-overexpressie de gluconeogene flux versterkt door enzymen te moduleren zoals mitochondriale pyruvaat drager 1 (MPC1)24, pyruvaatcarboxylase (PC)25, pyruvatdehydrogenase (PDH)26, fosfoenolpyruvatcarboxykinase (PCK1)27 en glucose-6-fosfatase (G6Pase)28. Zo vormt SIRT3-gemedieerde controle van het pyruvaatmetabolisme een cruciaal knooppunt tussen mitochondriale functie en leverglucose-output, waardoor SIRT3 een aantrekkelijk doelwit is voor therapeutische interventie bij T2DM.

Gezien de vastgestelde metabole effecten van bioactieve bestanddelen in GZRG, samen met de centrale rol van SIRT3 in de hepatische glucosehomeostase, werd verondersteld dat GZRG hyperglykemie in T2DM verlicht door modulatie van de door SIRT3 gemedieerde gluconeogene route. Om deze hypothese te evalueren, werden de effecten van GZRG op glucose- en lipidemetabolisme beoordeeld bij door een hoog vetdieet (HFD)-geïnduceerde T2DM-muizen en door vrije vetzuren (FFA)-geïnduceerde insulineresistente HepG2-cellen. Verder onderzoek onderzocht de betrokkenheid van de SIRT3-MPC1-PC/PDH-signaalas bij het bemiddelen van het onderdrukkende effect van GZRG op levergluconeogenese. Deze studie heeft als doel de moleculaire mechanismen achter de metabole voordelen van GZRG te verduidelijken en experimenteel bewijs te leveren dat het therapeutisch potentieel als multi-target modulator voor T2DM-beheer ondersteunt.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

Het dieronderzoeksprotocol werd goedgekeurd door de Commissie voor Institutionele Dierenzorg en Gebruik van de Changchun University of Chinese Medicine (goedkeuring nr. 2024396). Alle dierproeven werden uitgevoerd volgens de nationale richtlijnen en de relevante nationale wetten ter bescherming van dieren.

Experimentele geneesmiddelen
GZRG (batchnummer 26210483) werd geleverd door het Affiliated Hospital van de Changchun University of Chinese Medicine (Jilin, China). De belangrijkste bioactieve bestanddelen en kwaliteitscontroleparameters van GZRG werden in een eerdere studiegekarakteriseerd.

Reagentia en antilichamen
Commerciële assaykits werden gebruikt om glucose, glycogeen, niet-esterificeerde vetzuren (NEFA's), triglyceriden (TG), totaalcholesterol (TC), HDL-cholesterol met hoge dichtheid en LDL-cholesterol met lage dichtheid te kwantificeren. Enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) kits voor geglycosyleerd hemoglobine en insuline werden ook commercieel verkregen. ELISA-kits voor pyruvaatdehydrogenase (PDH) en pyruvaatcarboxylase (PC) werden ook commercieel verkregen. Voor RNA- en cDNA-werk werden de RNA Tissue/Cell Kit, qPCR PreMix en gDNA RT SuperMix commercieel aangeschaft. Transfectie werd uitgevoerd met een transfectie-reagens. Primaire antilichamen tegen SIRT3 (RRID: AB_2837621), fosfoenolpyruvaat carboxykinase 1 (PCK1; RRID: AB_2838732), PDH-E2, glucose-6-fosfatase (G6Pase; RRID: AB_2845572), mitochondriale pyruvaat drager 1 (MPC1; RRID: AB_2836209), PC (RRID: AB_2836732) en glyceraldehyde-3-fosfaatdehydrogenase (GAPDH; RRID: AB_2833041) werden ingekocht bij een commerciële leverancier.

Muizen en behandelingen
Mannelijke C57BL/6J muizen (5-6 weken oud) werden verkregen bij Liaoning Changsheng Biotechnology Co., Ltd. en werden onderhouden onder standaardomstandigheden (22 ± 2 °C, 50%-60% luchtvochtigheid, 12 uur licht/donker cyclus) met vrije toegang tot voedsel en water. Na een acclimatisatieperiode van 1 week werden zes muizen willekeurig aangewezen als controlegroep (Con) en kregen ze een standaard chow-dieet. De overgebleven muizen kregen 12 weken lang een vetrijk dieet (HFD) om obesitas en insulineresistentie op te wekken.

In week 13 werden muizen met een nuchtere bloedglucose (FBG)-waarde ≥ 11,1 mmol/L geclassificeerd als succesvolle type 2 diabetes mellitus (T2DM)-modellen. Deze diabetische muizen werden willekeurig ingedeeld in vijf experimentele groepen (n = 6 per groep): de HFD-modelgroep, laag-dosis GZRG (L-GZRG, 3,2 g/kg/d), middel-dosis GZRG (M-GZRG, 6,4 g/kg/d), hoge dosis GZRG (H-GZRG, 12,8 g/kg/d) en metformine (Met, 0,2 g/kg/d). GZRG en Met werden dagelijks toegediend via orale gavage gedurende 8 weken. De Con- en HFD-modelgroepen ontvingen gelijke hoeveelheden gedestilleerd water. Na afloop van de behandelingsperiode werden bloed- en leverweefselmonsters van alle muizen verzameld voor verdere analyse.

Intraperitoneale glucosetolerantietest (IPGTT), pyruvaattolerantietest (PTT) en insulinetolerantietest (ITT)
Metabole tolerantietests werden uitgevoerd tussen 6 en 8 weken na de start van medicamenteuze behandelingen. Voor de IPGTT en PTT werden muizen 's nachts nuchter (ongeveer 16 uur). Voor de ITT werd een kortere vastenperiode van 4 uur ingevoerd. Na het vasten kregen muizen een intraperitoneale injectie van ofwel glucose (2 g/kg voor IPGTT), natriumpyruvaat (2 g/kg voor PTT) of gewone insuline voor mensen (1 u/kg voor ITT). De bloedglucosewaarden werden gemeten uit bloedmonsters van de staartader op 0 min, 30 min, 60 min, 90 minuten en 120 min na injectie met behulp van een gekalibreerde glucometer.

Biochemische analyse en enzymactiviteitsassays
De nuchtere bloedglucose (FBG), hemoglobine A1c (HbA1c) en insuline (INS) werden vastgesteld met behulp van commerciële assay-kits volgens de instructies van de fabrikant. Het Homeostatische Modelbeoordeling van Insulineresistentie (HOMA-IR) werd berekend met behulp van de formule:

HOMA-IR = [FBG (mmol/L) x INS (μU/mL)] / 22,5

De circulerende niveaus van NEFA's, TG, TC, LDL-C, HDL-C, en de enzymatische activiteiten van PDH en PC in leverweefsels werden gekwantificeerd met behulp van de respectievelijke commerciële kits.

Histopathologische analyse van leverweefsels
Verse leverweefsels werden 24 uur gefixeerd in 10% neutraal gepufferde formaline, gevolgd door standaardverwerking voor paraffine-inbedding. Doorsneden (5 μm dik) werden gesneden en gekleurd met Hematoxyline en Eosine (H&E) voor algemene morfologisch onderzoek. Voor lipidenvisualisatie werden geselecteerde levermonsters ingebed in Optimal Cutting Temperature (OCT)-verbinding, ingevroren, gecryosectioneerd en gekleurd met Oil Red O.

Celkweek en behandeling
De menselijke hepatomacellijn HepG2 is verkregen uit de Type Culture Collection van de Chinese Academie van Wetenschappen (China). De cellen werden gekweekt in Minimum Essential Medium (MEM) aangevuld met 25 mM glucose, 10% foetaal rundereserum (FBS) en 1% penicilline-streptomycine. De kweek werd gehandhaafd op 37 °C in een bevochtigde broedmachine met 5%CO-2.

Om een in vitro model van insulineresistentie (IR) vast te stellen, werden cellen bij 70%-80% confluentie gedurende 24 uur behandeld met een mengsel van vrije vetzuren (FFA) bestaande uit oliezuur en palmitinezuur in een molaire verhouding van 2:1, gebaseerd op een eerder gerapporteerde methode met kleine aanpassingen29. Na de inductie van FFA werd het kweekmedium vervangen door verse MEM met hetzelfde FFA-mengsel samen met verschillende concentraties GZRG voor een extra incubatie van 24 uur.

Cellevensvatbaarheidstest (CCK-8)
HepG2-cellen in de logaritmische groeifase werden geoogst en ingezaaid in 96-wellplaten met een dichtheid van 1 x 104 cellen per put. De perifere putten werden gevuld met 100 μL steriele fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS) om verdamping te minimaliseren. Na een nachtelijke incubatie om hechting te waarborgen, werden de cellen behandeld volgens het experimentele ontwerp. Na behandeling werd 10 μL CCK-8-oplossing aan elke put toegevoegd, en werden de platen 2 uur geïncubeerd bij 37 °C. De absorptie bij 450 nm werd gemeten met een microplaatlezer. De cellevensvatbaarheid werd als volgt berekend:

[(As - Ab) / (Ac - Ab)] x 100%

waarbij As de absorptie van het monster is, Ac de absorptie is van de controle (onbehandelde cellen), en Ab de absorptie van de blank (putten zonder cellen).

Plasmidetransfectie in HepG2-cellen
Het SIRT3-overexpressieplasmide (OV-SIRT3) en drie verschillende SIRT3-gerichte kleine interfererende RNA-plasmiden (si-SIRT3-1#, si-SIRT3-2#, si-SIRT3-3#), samen met een negatieve controle siRNA (si-NC), zijn door een leverancier geconstrueerd. Transfectionen werden uitgevoerd met een transfectie-reagens wanneer de cellen 50%-60% confluentie bereikten. Het transfectiecomplex werd onder steriele omstandigheden als volgt bereid: Oplossing A werd gegenereerd door 1 μg plasmide-DNA te verdunnen in 250 μL gereduzeerd serummedium met zachte menging. Oplossing B werd bereid door 2-3 μL transfectiereagens te verdunnen in 250 μL gereduzeerd serummedium, gevolgd door incubatie bij kamertemperatuur gedurende 5 minuten zonder vortex. De twee oplossingen werden gecombineerd, voorzichtig gemengd door pipetten, en 30 minuten op kamertemperatuur geïncubeerd om DNA-lipidencomplexen te vormen. Voor transfectie werd 1 uur voor de procedure het celkweekmedium geaspireerd, de cellen gewassen met PBS en 1 ml gereduceerd serummedium (serumvrij en antibioticavrij) toegevoegd. Vervolgens werd 500 μL van het transfectiecomplex druppelgewijs aan elke put toegevoegd, en de kweekplaat werd voorzichtig gedraaid om homogeniteit te waarborgen. Cellen werden 4-6 uur geïncubeerd bij 37 °C, waarna het medium werd vervangen door een volledig medium om cytotoxiciteit te verminderen. Vervolgens werden de cellen nog eens 24-48 uur gekweekt voordat verdere analyse plaatsvond. De transfectie-efficiëntie werd beoordeeld met kwantitatieve PCR (qPCR). Totaal RNA werd geëxtraheerd, omgekeerd getranscribeerd naar cDNA en geamplificeerd met SIRT3-specifieke primers met 18S rRNA als interne controle. Relatieve expressieniveaus werden bepaald met de ΔΔCt-methode, en het meest effectieve siRNA-construct werd geselecteerd voor latere experimenten op basis van deze resultaten.

Olierode O-kleuring voor intracellulaire lipidenophoping
HepG2-cellen in de logaritmische groeifase werden gezaaid in 24-wellplaten met een dichtheid van 2 x 105 cellen per put en geïnduceerd met een hoog lipidenmedium met 250 μM oleïnezuur en 250 μM palmitinezuur gedurende 48 uur om het lipidenaccumulatiemodel te vestigen. Na de behandelingen werden de cellen gewassen met PBS en 10% formaldehyde vastgezet voor 10 minuten op kamertemperatuur. Na een spoeling met gedestilleerd water en een korte onderdompeling in 60% isopropanol, werden de cellen gekleurd met een vers bereide Oil Red O-werkoplossing (verkregen door het mengen van componenten A1 en A2 in een verhouding van 3:2) gedurende 10-15 minuten. Overtollige kleurstof werd verwijderd door te wassen met 60% isopropanol, gevolgd door gedestilleerd water. De kernen werden 1-2 minuten gekleurd met Mayer's hematoxyline (1,0 g/L). Na een laatste wasbeurt werden de cellen gemonteerd met glycerolgelatine en werden beelden gemaakt met een lichtmicroscoop met 200x vergroting voor kwalitatieve beoordeling van lipidedruppels.

Inductie van insulineresistentie en glucosekwantificatie in HepG2-cellen
HepG2-cellen werden gekweekt in 24-wellplaten met een zaaddichtheid van 2 x 10à 5 cellen per put om een in vitro model van insulineresistentie vast te stellen. Na 24 uur behandeling werd het kweeksupernatant verzameld voor verdere analyse. Voor intracellulaire glucosemeting werden celsuspensies gecentrifugeerd op 1000 x g gedurende 10 minuten bij 4 °C. Het supernatant werd weggegooid en de celpellet werd één of twee keer gewassen met een isotone buffer, gevolgd door centrifugatie onder dezelfde omstandigheden. De pellet werd vervolgens gehomogeniseerd in 0,2 tot 0,3 mL homogenisatiemedium en onderworpen aan ultrasone verstooring in een ijswaterbad met een 300 W probe, met pulsen van 3-5 s, gevolgd door 30 s intervallen, herhaald 3x-5x. Het resulterende homogenaat werd direct getest zonder verdere centrifugatie. De glucoseniveaus in zowel het kweeksupernatant als het celhomogenaat werden gemeten met een gestandaardiseerde glucosetestkit volgens de instructies van de fabrikant om een nauwkeurige en reproduceerbare beoordeling van metabole responsen te garanderen.

Meting van het cellulaire triglyceridengehalte
HepG2-cellen werden verzameld door centrifugatie bij 1000 x g gedurende 10 minuten, waarna het supernatant werd afgevoerd. De celpellet werd 1 of 2 keer gewassen met een isotonische fosfaatbuffer (0,1 M, pH 7,0-7,4), gevolgd door centrifugatie onder dezelfde omstandigheden. Na verwijdering van het supernatant werd de pellet opnieuw opgehangen en gehomogeniseerd met 0,2-0,3 mL absolute ethanol. Het homogenaat werd blootgesteld aan ultrasone verstoring op ijs (300 W, 3-5 s per burst, 30 s interval, herhaald 3-5 keer). Het resulterende homogenaat werd direct gebruikt voor latere analyse zonder verdere centrifugatie. Er werd een plaat met 96 putten opgesteld met blanke, standaard- en monsterputten. Na grondig mengen werd de plaat 10 minuten geïncubeerd bij 37 °C, en werd de absorptie gemeten op 500 nm met een microplaatlezer. Het triglyceridengehalte in de celmonsters werd berekend op basis van een standaardcurve die was afgeleid van seriële verdunningen van glycerolstandaarden.

Meting van het totale cholesterolgehalte
HepG2-cellen (5 x 106) werden gelyseerd in 1 mL extractiebuffer door ultrasone verstooring op ijs. Het homogenaat werd gecentrifugeerd op 10.000 x g gedurende 10 minuten bij 4 °C, en het supernatant werd verzameld voor onmiddellijke analyse. Een cholesterolstandaardoplossing (50 μmol/mL) werd bereid en seriëel verdund om een standaardcurve te genereren (0,3125 tot 10 μmol/mL). Een werkende chromogene oplossing werd bereid door het mengen van reagentia één, twee en drie die in de cholesteroltestkit werden geleverd en voorverwarmd tot 37 °C. Monsters of standaarden werden gemengd met de werkoplossing, 30 minuten geïncubeerd bij 37 °C en de absorptie werd gemeten bij 500 nm. Het cholesterolgehalte werd berekend op basis van de standaardcurve.

Immunofluorescentiekleuring
Cellen die op dekfolies werden gekweekt, werden afgespoeld met ijskoude PBS en 15 minuten bij kamertemperatuur vastgezet met 4% paraformaldehyde. Na PBS-washes werden cellen 10 minuten permeabiliseerd met 0,1% Triton X-100 en 's nachts geblokkeerd met 5% BSA bij 4 °C. Cellen werden vervolgens 's nachts geïncubeerd met een primair anti-SIRT3-antilichaam (1:500 verdunning) bij 4 °C. Na PBS-washes werden cellen geïncubeerd met een fluorescentiegeconjugeerd secundair antilichaam (1:2000 verdunning) gedurende 1 uur bij kamertemperatuur in het donker. De kernen werden 10 minuten gekleurd met DAPI (0,5 μg/mL). Dekfolies werden op glazen glaasjes gemonteerd met een antifade-montagemedium en zichtbaar onder een fluorescentiemicroscoop.

RNA-extractie en kwantitatieve real-time PCR (qRT-PCR)
Totaal RNA werd uit cellen geëxtraheerd met behulp van de RNA Tissue/Cell Kit. Genomisch DNA werd verwijderd en cDNA werd gesynthetiseerd met behulp van de gDNA RT-kit. Kwantitatieve PCR werd uitgevoerd met behulp van de qPCR-kit op een realtime PCR-detectiesysteem. Gen-specifieke primersequenties zijn weergegeven in Tabel 1.

Western blot-analyse
Voor eiwitextractie uit leverweefsels werd ongeveer 50-200 mg weefsel gewogen, gehakt in een petrischaal en overgebracht naar een homogenisator. Een voorgekoelde lysisbuffer (RIPA-buffer) aangevuld met protease- en fosfataseremmers werd toegevoegd om eiwitafbraak te voorkomen. Homogenisatie werd grondig uitgevoerd op ijs om volledige weefselvervorming te garanderen, en het homogenaat werd overgebracht naar een centrifugebuis en 30 minuten op ijs geïncubeerd om de eiwitoplosbaarheid te vergemakkelijken. Vervolgens werd het homogenaat gecentrifugeerd bij 4 °C bij 12.000 x g gedurende 10-30 minuten, en werd het supernatant zorgvuldig verzameld als het totale eiwitextract, zodat besmetting door de pellet werd voorkomen. Voor cellulaire eiwitextractie werd een voorgekoelde lysisbuffer (RIPA-buffer met 1% Triton X-100 en proteaseremmers) aan de cellen toegevoegd, gevolgd door 15-30 minuten incubatie op ijs om volledige lysis te bereiken. Celverstoring werd gegarandeerd door herhaald schrapen met een celschraper of krachtig pipetteren. Het lysaat werd overgebracht naar een centrifugebuis en gecentrifugeerd bij 4 °C bij 14.000 x g gedurende 30 minuten, waarna het supernatant werd verzameld als het totale eiwitextract. De eiwitconcentratie werd gekwantificeerd met een BCA-eiwitassaykit, en aliquots werden opgeslagen bij -80 °C voor toekomstige Western blot-analyses of direct gebruikt voor monstervoorbereiding. Eiwitmonsters werden in de Laemmli-buffer bij 100 °C gedurende 10 minuten gedenatureerd, gescheiden door SDS-PAGE, en vervolgens overgebracht op PVDF-membranen. De membranen werden 2 uur lang geblokkeerd met 5% magere melk bij kamertemperatuur en vervolgens 's nachts geïncubeerd met specifieke primaire antilichamen bij 4 °C. Na het wassen werden membranen 1 uur bij kamertemperatuur geïncubeerd met HRP-geconjugeerde secundaire antilichamen. Eiwitbanden werden gevisualiseerd met behulp van een versterkt chemiluminescentie (ECL) substraat. De chemiluminescente signalen werden gevangen en bandintensiteiten werden gekwantificeerd door densitometrische analyse met behulp van de ImageJ-software. De ruwe Western vlekken zijn beschikbaar in Supplementair Dossier 1.

Statistische analyse
Alle gegevens worden uitgedrukt als het gemiddelde ± standaardfout van het gemiddelde (SEM). Statistische vergelijkingen tussen twee groepen werden uitgevoerd met behulp van een ongepaarde Student's t-test. Voor vergelijkingen tussen drie of meer groepen werd eenrichtingsvariantieanalyse (ANOVA) toegepast, gevolgd door Tukey's post hoc-test voor meervoudige vergelijkingen. Alle statistische analyses werden uitgevoerd met GraphPad Prism-software (versie 9.5.0). Een p-waarde van minder dan 0,05 werd als statistisch significant beschouwd.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

GZRG verbeterde insulineresistentie en gluconeogenese bij door HFD geïnduceerde T2DM-muizen
Het door HFD geïnduceerde type 2 diabetes mellitus (T2DM) muismodel, gekenmerkt door insulineresistentie, hyperglykemie en dyslipidemie, wordt veel gebruikt om ziektepathogenese te onderzoeken en therapeutische interventies te evalueren30. In de huidige studie werd een door HFD geïnduceerd T2DM-model ontwikkeld in C57BL/6J-muizen om de effectiviteit en onderliggende mechanismen van GZRG ...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

De huidige studie toont aan dat GZRG significante antihyperglycemische en insuline-sensibiliserende effecten uitoefent in zowel in vivo als in vitro modellen van T2DM, voornamelijk door onderdrukking van levergluconeogenese via modulatie van de SIRT3-MPC1-PC/PDH-as. Experimentele gegevens geven aan dat de toediening van GZRG de nuchtere hyperglykemie verminderde, de glucose- en insulinetolerantie verbeterde, de lipidenhomeostase herstelde en leversteatose bij door HFD v...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

Alle auteurs geven aan dat zij geen bekende concurrerende financiële belangen of persoonlijke relaties hebben die het werk in dit artikel zouden kunnen beïnvloeden.

Dankbetuigingen

Dit onderzoek werd gefinancierd door het Science and Technology Development Plan van de provincie Jilin, subsidienummer 20210101199JC, YDZJ202301ZYTS454.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
FastKing gDNA Dispelling RT SuperMix   Tiangen Biotech Co., Ltd. (China). KR118-02
glucose-6-fosfatase (G6Pase) AntilichaamWuhan Lingjiesi Biotechnology Co., Ltd. (China)LJS-D-12610
glyceraldehyde-3-fosfaat dehydrogenase (GAPDH) AntilichaamWuhan Lingjiesi Biotechnology Co., Ltd. (China)LJS-T-0004
Geglycosyleerd hemoglobine ELISA kits   Jiangsu Meimian Industrial Co., Ltd. (China).MM-0159M2
GZRGAfgelieerd Ziekenhuis van de Universiteit van Traditionele Chinese Geneeskunde van Changchun (Jilin, China)26210483
High-density lipoproteïne (HDL) cholesterol assay kitsNanjing Jiancheng Bioengineering Institute (China)A112-1-1
Insulin ELISA kitsJiangsu Meimian Industrial Co., Ltd. (China).MM-0579M2
Lipofectamine2000 Invitrogen, VS11668-019
Low-density lipoproteïne (LDL) cholesterol assay kitsNanjing Jiancheng Bioengineering Institute (China)A113-1-1
Glucose meetkitsNanjing Jiancheng Bioengineering Institute (China)F006-1-1
Mitochondrial pyruvaat carrier 1 (MPC1) AntilichaamWuhan Lingjiesi Biotechnology Co., Ltd. (China)LJS-D-3852
Niet-veresterde vetzuren (NEFA's) assay kitsNanjing Jiancheng Bioengineering Institute (China)A042-2-1
PC AntilichaamWuhan Lingjiesi Biotechnology Co., Ltd. (China)LJS-D-4364
PDH-E2 AntilichaamWuhan Lingjiesi Biotechnology Co., Ltd. (China)LJS-D-14046
Fosfoenolpyrovaat carboxykinase 1 (PCK1) AntilichaamWuhan Lingjiesi Biotechnology Co., Ltd. (China)LJS-D-6770
Pyrovaat carboxylase (PC) ELISA kits Wuhan Lingjiesi Biotechnology Co., Ltd. (China)LJS-160408H
Pyrovaat dehydrogenase (PDH) ELISA kits  Wuhan Lingjiesi Biotechnology Co., Ltd. (China)LJS-160300H
RNA Easy Fast Tissue/Cell Kit  Tiangen Biotech Co., Ltd. (China). DP451
SIRT3 AntilichaamWuhan Lingjiesi Biotechnology Co., Ltd. (China)LJS-A-5135
Talent SYBR Green qPCR PreMix Tiangen Biotech Co., Ltd. (China). FP209-02
Total cholesterol (TC) assay kitsNanjing Jiancheng Bioengineering Institute (China)A110-1-1
Triglyceriden (TG) assay kitsNanjing Jiancheng Bioengineering Institute (China)A111-1-1

Referenties

  1. Ahmad, E., Lim, S., Lamptey, R., Webb, D. R., Davies, M. J. Type 2 diabetes. Lancet (London, England). 400, 1803-1820 (2022).
  2. Singh, A., Shadangi, S., Gupta, P. K., Rana, S. Type 2 Diabetes Mellitus: A Comprehensive Review of Pathophysiology, Comorbidities, and Emerging Therapies. Comp Physiol. 15, e70003(2025).
  3. Lu, X., et al. Type 2 diabetes mellitus in adults: pathogenesis, prevention and therapy. Signal Transduct Target Ther. 9, 262(2024).
  4. Yang, W., Jiang, W., Guo, S. Regulation of Macronutrients in Insulin Resistance and Glucose Homeostasis during Type 2 Diabetes Mellitus. Nutrients. 15 (21), 4671(2023).
  5. Petersen, M. C., Vatner, D. F., Shulman, G. I. Regulation of hepatic glucose metabolism in health and disease. Nat Rev Endocrinol. 13 (10), 572-587 (2017).
  6. Barroso, E., Jurado-Aguilar, J., Wahli, W., Palomer, X., Vázquez-Carrera, M. Increased hepatic gluconeogenesis and type 2 diabetes mellitus. Trends Endocrinol Metab. 35 (12), 1062-1077 (2024).
  7. Dutta, S., et al. Metformin: A Review of Potential Mechanism and Therapeutic Utility Beyond Diabetes. Drug Des Devel Ther. 17, 1907-1932 (2023).
  8. Lebovitz, H. E. Thiazolidinediones: the Forgotten Diabetes Medications. Curr Diab Rep. 19 (12), 151(2019).
  9. Yao, H., et al. Comparative effectiveness of GLP-1 receptor agonists on glycaemic control, body weight, and lipid profile for type 2 diabetes: systematic review and network meta-analysis. BMJ. 384, e076410(2024).
  10. Vallon, V., Verma, S. Effects of SGLT2 Inhibitors on Kidney and Cardiovascular Function. Annu Rev Physiol. 83, 503-528 (2021).
  11. Dou, Z., et al. Syndrome Differentiation and Treatment Regularity in Traditional Chinese Medicine for Type 2 Diabetes: A Text Mining Analysis. Front Endocrinol (Lausanne). 12, 728032(2021).
  12. Ni, Y., et al. Evidence of traditional Chinese medicine for treating type 2 diabetes mellitus: from molecular mechanisms to clinical efficacy. Pharm Biol. 62 (1), 592-606 (2024).
  13. Wang, J., et al. Effects of three Huanglian-derived polysaccharides on the gut microbiome and fecal metabolome of high-fat diet/streptozocin-induced type 2 diabetes mice. Int J Biol Macromol. 273 (Pt 1), 133060(2024).
  14. Qi, L., et al. Structural characterization of red yeast rice-derived polysaccharide and its promotion of lipid metabolism and gut function in high-fat diet-induced mice. Int J Biol Macromol. 282 (Pt 1), 136744(2024).
  15. Liu, Y., et al. Flavonoid-Rich mulberry leaf extract modulate lipid metabolism, antioxidant capacity, and gut microbiota in high-fat diet-induced obesity: potential roles of FGF21 and SOCS2. Food Med Homol. 1, 9420016(2024).
  16. Wu, H., et al. Efficacy and safety assessment of traditional Chinese medicine for metabolic syndrome. BMJ Open Diabetes Res Care. 8 (1), e001181(2020).
  17. Jin, Z., Wang, X. Traditional Chinese medicine and plant-derived natural products in regulating triglyceride metabolism: Mechanisms and therapeutic potential. Pharmacol Res. 208, 107387(2024).
  18. Chen, S., et al. Screening and identification of active compounds of GanZhiRong granule based on liquid chromatography-mass spectrometry and biomolecular networks. Chinese J Anal Chem. 51, 100294(2023).
  19. Yu, Y., Liu, T., Yang, Y., Wang, H., Liu, Y. Effects of Liver Fat Soluble Granule Comnined and Metformin on Blood Glucose in Diabetic Rats. Jilin J Trad Chinese Med. 39, 654-656 (2019).
  20. Ji, Z., Liu, G. H., Qu, J. Mitochondrial sirtuins, metabolism, and aging. J Genet Genomics. 49 (4), 287-298 (2022).
  21. Zhang, J., et al. Mitochondrial Sirtuin 3: New emerging biological function and therapeutic target. Theranostics. 10 (18), 8315-8342 (2020).
  22. Chen, J., et al. The role of sirtuins in the regulatin of oxidative stress during the progress and therapy of type 2 diabetes mellitus. Life Sci. 333, 122187(2023).
  23. Weng, S., et al. Chaperonin counteracts diet-induced non-alcoholic fatty liver disease by aiding sirtuin 3 in the control of fatty acid oxidation. Diabetologia. 66 (5), 913-930 (2023).
  24. Liang, L., Li, Q., Huang, L., Li, D., Li, X. Sirt3 binds to and deacetylates mitochondrial pyruvate carrier 1 to enhance its activity. Biochem Biophys Res Commun. 468 (4), 807-812 (2015).
  25. Guo, X., et al. The Role of Palmitoleic Acid in Regulating Hepatic Gluconeogenesis through SIRT3 in Obese Mice. Nutrients. 14 (7), 1482(2022).
  26. Han, Y., et al. Bawei Chenxiang Wan ameliorates right ventricular hypertrophy in rats with high altitude heart disease by SIRT3-HIF1α-PDK/PDH signaling pathway improving fatty acid and glucose metabolism. BMC Complement Med Ther. 24 (1), 190(2024).
  27. Wei, X., et al. Both prolonged high-fat diet consumption and calorie restriction boost hepatic NAD+ metabolism in mice. J Nutr Biochem. 115, 109296(2023).
  28. Kavanaugh, J. W. Skeletal Muscle Acetylation in Response to an Acute and Chronic High-Fat Diet [Doctoral Dissertations]. , Virginia Tech. (2017).
  29. Lee, M. R., Yang, H. J., Park, K. I., Ma, J. Y. Lycopus lucidus Turcz. ex Benth. Attenuates free fatty acid-induced steatosis in HepG2 cells and non-alcoholic fatty liver disease in high-fat diet-induced obese mice. Phytomedicine. 55, 14-22 (2019).
  30. Qu, X., et al. Riligustilide alleviates hepatic insulin resistance and gluconeogenesis in T2DM mice through multitarget actions. Phytother Res. 36 (1), 462-474 (2022).
  31. Rui, L. Energy Metabolism in the Liver. Compr Physiol. 4, 177-197 (2014).
  32. Li, A., et al. Berberine Reduces Pyruvate-driven Hepatic Glucose Production by Limiting Mitochondrial Import of Pyruvate through Mitochondrial Pyruvate Carrier 1. EBioMedicine. 34, 243-255 (2018).
  33. Tavoulari, S., Sichrovsky, M., Kunji, E. R. S. Fifty years of the mitochondrial pyruvate carrier: New insights into its structure, function, and inhibition. Acta Physiol (Oxford, England). 238 (4), e14016(2023).
  34. Dutta, S., et al. Metformin: A Review of Potential Mechanism and Therapeutic Utility Beyond Diabetes. Drug Des Devel Ther. 17, 1907-1932 (2023).
  35. Xu, G., et al. Mitochondrial ACSS1-K635 acetylation knock-in mice exhibit altered metabolism, cell senescence, and nonalcoholic fatty liver disease. Sci Adv. 10 (20), eadj5942(2024).
  36. Jin, L., et al. FGF21-Sirtuin 3 Axis Confers the Protective Effects of Exercise Against Diabetic Cardiomyopathy by Governing Mitochondrial Integrity. Circulation. 146 (20), 1537-1557 (2022).
  37. Ning, Y., et al. SIRT3: A potential therapeutic target for liver fibrosis. Pharmacol Ther. 257, 108639(2024).
  38. Xian, Y., et al. Enhanced SIRT3 expression restores mitochondrial quality control mechanism to reverse osteogenic impairment in type 2 diabetes mellitus. Bone Res. 13 (1), 30(2025).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Meer artikelen verkennen

SIRT3-padinsulineresistentiepyruvaatmetabolismeHepG2-celleneiwitexpressielipidemetabolismeglucosetolerantie
Neem contact met ons op
Aanbevelen aan de bibliotheek

Privacy

Gebruiksvoorwaarden

Beleidsoverzicht

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Alle rechten voorbehouden.