1. Experimentele materialen
C. oleifera 'Dabieshan 1'-bladeren werden verzameld in drie belangrijke ontwikkelingsstadia: de juveniele fase, rond de leeftijd van 2 jaar; Het onderwerp gaat over naar een vroege vruchtfase op ongeveer 6-jarige leeftijd en bereikt uiteindelijk zijn piek als het ongeveer 10 jaar oud is. Alle C. oleifera-planten in bovenstaande drie ontwikkelingsstadia zijn geplant met in potten geteelde zaailingen van dezelfde specificatie als C. oleifera 'Dabieshan 1'. De fysische en chemische eigenschappen van de bodem in het bosgebied van C. oleifera werden weergegeven in Tabel 1.
2. Overzicht van de verzamelingslocatie
Experimentele materialen werden verzameld in Heping Town, gelegen in het hart van de provincie Anhui. Shucheng County ligt binnen het centrale deel van de provincie en behoort tot het perifere gebied van de Dabie-bergen. De coördinaten zijn 31°11 ′N, 116°47 ′E, met een gemiddelde hoogte van 90 m. De bodem wordt geclassificeerd als geelbruine grond. De regio heeft een vochtig subtropisch moessonklimaat, met een gemiddelde jaartemperatuur van 15,6 °C en doorgaans ongeveer 1.100 mm neerslag per jaar, geniet van ongeveer 1.969 uur zon per jaar en kent een vorstvrije periode van 224 dagen.
3. Monsterverzameling en voorbehandeling
Monsters werden geselecteerd tijdens de pre-bloeiperiode (eind september). Voor elke ontwikkelingsfase werden de planten van C. oleifera geselecteerd met vergelijkbare, consistente en sterke groei. Van elke plant werd het derde blad van boven naar beneden verwijderd, waarbij matig lentescheuten groeiden vanuit het oosten, westen, zuiden en noorden van het buitenste deel van de C. oleifera-kroon . De monsters werden gemarkeerd met serieletters en cijfers: YAT1, YAS2 en YAT3 voor bladeren van C. oleifera in het juveniele stadium, het subject vordert respectievelijk naar een vroege vruchtfase en de piekvruchtperiode. Deze werden verzameld en opgeslagen in vloeibare stikstof. Vijf willekeurige steekproefbomen werden uit elke fase geselecteerd als één biologische replicat, en in alle stadia werden drie biologische replicaten opgezet. De geselecteerde exemplaren werden dezelfde dag teruggebracht naar het laboratorium en bewaard bij -80 °C.
4. Bepaling van de fysiologische index
Het oplosbare suikergehalte werd bepaald met de anthrone colorimetrische methode21. Het organische koolstofgehalte werd bepaald door de kaliumdichromaatoxidatie - ferrozuursulfaattitratiemethode22. Het oplosbare eiwitgehalte werd verkregen met de Coomassie brilliant blue methode23. De totale stikstofconcentratie werd gekwantificeerd met de Kjeldahl-methode22.
5. Isolatie van volledig RNA werd uitgevoerd, gevolgd door de bouw van een complementaire DNA (cDNA) bibliotheek en daaropvolgende sequencing
Totaal RNA werd op verschillende stadia uit C. oleifera-bladeren geëxtraheerd met behulp van de plant-RNA-extractiekit. De totale RNA-concentratie werd bepaald met een full-spectrum ultraviolet-zichtbare spectrofotometer. De integriteit en helderheid van RNA werden bepaald door een biologische analyzer. Na het construeren en valideren van de cDNA-bibliotheek werd transcriptomische sequencing uitgevoerd met behulp van een sequence-by-sequencing high-throughput sequencingplatform. De sequencingprocedure leverde individuele reads op, elk met 100 baseparenvan 24, 25 en 26. De resultaten van de uitlijning van sequentieprocessen werden statistisch geanalyseerd met behulp van de RSEM-software27. Differentiële expressiegenen (DEGs) in verschillende ontwikkelingsstadia van C. oleifera werden geïdentificeerd met behulp van de DESeq differentiële analysesoftware28,29.
6. De novo assembly en UniGene-annotatie
SeqPrep http://github.com/jstjohn/SeqPrep) en Sickle (http://github.com/najoshi/sickle) werden gebruikt om de ruwe data te filteren, waaronder het verwijderen van laagwaardige sequenties en besmette adapters. Vervolgens werden de schone reads verkregen van elk monster samengesteld met Trinity software30,31. Alle verzamelde transcripties werden onderworpen aan BLASTX-uitlijning tegen de Swiss-Prot, clusters van orthologe groepen voor eukaryote volledige genomen, en KEGG-databases in opeenvolgende volgorde. Een typische Cut-off E-waarde (E-waarde <10−5) werd ingesteld om hun functie-annotaties op te halen. De KEGG werd toegepast om gerelateerde metabole routes te analyseren32.
7. Functionele annotatie van genen en differentieel expressieve genenanalyse
Gen- en isoformabundanties werden statistisch geanalyseerd met behulp van de RSEM-software27. Er werd een cut-off (P < 0,05, FDR < 0,01, |log2FC|>1) ingesteld om differentieel expressieve genen (DEGs) te identificeren. Het verwachte aantal fragmenten per kb transcript per miljoen in kaart gebrachte fragmenten (FPKM) is momenteel de meest gebruikte methode om genexpressieniveaus te schatten:28. De FPKM-waarden van alle genen uit de drie verschillende groei- en ontwikkelingsstadia (YAT1, YAS2 en YAT3) werden berekend. Hiërarchische clusteringanalyse werd uitgevoerd om de differentiële genexpressieniveaus te onderzoeken. Ondertussen werd de KEGG-route voorbereid om DEG's te identificeren die significant verrijkt zijn in metabole routes bij Bonferroni-gecorrigeerd P ≤ 0,05 vergeleken met het gehele transcriptoom met behulp van KOBAS29.
8. Analytische methoden
De gegevens werden gepresenteerd met Excel om gemiddelde waarden en standaarddeviaties te berekenen. Variantieanalyse (ANOVA) werd gebruikt voor statistische analyse door SPSS-software, en Duncans multiple range test werd gebruikt om significante verschillen in nutriëntengehalte tussen de drie fasen te beoordelen. Vervolgens werden significante verschillen tussen groepen bepaald met behulp van post-hoc meervoudige vergelijkingen met de Least Significant Difference (LSD)-methode. Grafieken en grafieken werden gegenereerd met Origin-software om experimentele en analytische bevindingen te visualiseren. Er werd geen statistische significantie aangeduid met 'ns' (P > 0,05). Statistisch significante verschillen werden respectievelijk aangeduid met '*' (P < 0,05), '**' (P < 0,01), '***' (P < 0,001) en '****' (P < 0,0001).