Research Article

Geïntegreerde transcriptomische en secretome proteomanalyse van hyperglykemie-gestimuleerde endotheelcellen en screening van doelverbindingen

DOI:

10.3791/69578

⸱

December 30th, 2025

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Hebei Luoxue Innovation Medicine Research Institute, 2State Key Laboratory for Innovation and Transformation of Luobing Theory, 3Hebei University of Chinese Medicine, 4Hebei Medical University, 5Chengde Medical University

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dit protocol stelt een geïntegreerde multi-omics-pijplijn op (transcriptoom en proteoom) gecombineerd met netwerkfarmacologische screening om moleculaire drijfveren en therapeutische doelwitten voor endotheeldisfunctie bij diabetische complicaties te identificeren.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Endotheliale disfunctie is een belangrijke oorzaak van diabetische nierziekte (DKD), maar de systemische moleculaire mechanismen blijven onvolledig ontcijferd. We stelden de hypothese op dat geïntegreerde multi-omics-analyse hyperglykemie-geïnduceerde endotheelschade in kaart zou brengen en herbruikbare therapieën zou kunnen identificeren. Er werd een herbruikbare computationele pijplijn toegepast om transcriptomische/secretomprofielen van hyperglycemische endotheelcellen en diabetische nieren te integreren. Hiermee werden 534 vaak opgereguleerde genen/eiwitten geïdentificeerd. Functionele verrijking onthulde activatie van extracellulaire matrixremodellering, intercellulaire communicatie en ontstekingsroutes. Cross-database validatie verfijnde 278 hoog-vertrouwen mediatoren, en eiwit-eiwitinteractie netwerkanalyse identificeerde tien hubgenen. Met behulp van netwerkfarmacologie screenden we een goedgekeurde geneesmiddelenbibliotheek en identificeerden we verschillende kandidaatverbindingen (bijv. bruceantine, idelalisib) die mogelijk dit netwerk targeten. Bovendien leverden transcriptiefactorregulatie en voorbeeldige moleculaire koppelingssimulaties (bijv. idelalisib met CTCF/BRD4) mechanistische hypothesen voor experimentele validatie. Concluderend stelt deze studie een herbruikbaar multi-omics-kader vast dat endotheliale pathogene mechanismen in DKD afbakent en hergebruikte geneesmiddelkandidaten benoemt, waarmee een strategische benadering wordt geboden voor mechanistische en therapeutische ontdekking.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Diabetes mellitus, als wereldwijde gezondheidsuitdaging, trof wereldwijd 529 miljoen mensen in 2021, met prognoses die aangeven dat het tegen 2050 1,31 miljard mensen zaltreffen. Naast glykemische controle zijn langdurige complicaties de primaire bron van morbiditeit, sterfte en verminderde levenskwaliteit. Deze omvatten microvasculaire complicaties (bijv. diabetische nierziekte (DKD), retinopathie, neuropathie) en macrovasculaire complicaties (bijv. versnelde atherosclerose). Cruciaal is dat DKD 30%-40% van de diabetische patiënten treft, wat wereldwijd de belangrijkste oorzaak is van eindstadium nierziekte (ESRD). De diepgaande last van deze complicaties onderstreept een dringende, onvervulde behoefte aan nieuwe therapieën die zich richten op hun onderliggende mechanismen.

Endotheelcellen (EC's), die de binnenste bekleding van alle bloedvaten vormen, zijn cruciale poortwachters van de vasculaire gezondheid. Door hyperglykemie veroorzaakte endotheliale disfunctie fungeert als een centrale oorzaak van diabetische vasculopathie en orgaanschade 3,4. Hoge glucoseniveaus veroorzaken een cascade van maladaptieve reacties binnen EC's, waaronder gestoorde stikstofoxide (NO) biobeschikbaarheid, verhoogde endotheline-1 (ET-1) secretie, opgereguleerde expressie van adhesiemoleculen (bijv. VCAM-1, ICAM-1), verhoogde oxidatieve stress door overmatige productie van reactieve zuurstofsoorten (ROS) (bijvoorbeeld via NADPH oxidases), en aanhoudende laaggradige ontsteking 3,4. Gezamenlijk leiden deze veranderingen tot verminderde vasodilatatie, verhoogde vasculaire permeabiliteit, leukocytenadhesie en -infiltratie, pro-trombotische toestanden en uiteindelijk vasculaire remodellering5. Binnen de niermicrovasculatuur verstoort glomerulaire endotheelschade de filtratiebarrière, bevordert het albuminurie en draagt het direct bij aan extracellulaire matrix (ECM)-accumulatie, glomerulosclerose en tubulointerstitiele fibrose 5,6. De daaropvolgende activatie van residente niercellen, samen met de instroom van ontstekingscellen, veroorzaakt een vicieuze cirkel die nierschadeversterkt 5,7. Cruciaal is dat klinische studies aantonen dat markers van systemische endotheliale disfunctie sterk correeren met het begin en de progressie van albuminurie en dalende glomerulaire filtratiesnelheid (GFR) bij diabetische patiënten 6,7,8, wat de directe relevantie ervan voor de uitkomsten van menselijke ziekten onderstreept. Ondanks de erkende centrale rol blijft een uitgebreid, systeemniveau begrip van de precieze transcriptionele en secretoire herprogrammering veroorzaakt door chronische hyperglykemie bij EC's – vooral veranderingen die ECM-remodellering aansturen, essentieel voor nierfibrose – onvolledig gekarakteriseerd, wat de identificatie van nieuwe, mechanistische therapeutische doelen voor DKD en andere diabetische vasculaire complicaties beperkt 7,8.

De diepgaande moleculaire complexiteit die ten grondslag ligt aan endotheeldisfunctie bij diabetes vormt een formidabele uitdaging voor traditionele single-target therapeutische benaderingen. Hier komen computationele biologie en bio-informatica naar voren als onmisbare hulpmiddelen, die de integratie en het ontplooien van diverse, hoogdimensionale omics-datasets mogelijk maken om causale hubs binnen pathologische netwerken te prioriteren en multi-targeting therapeutische strategieën te identificeren9. Cruciaal is dat conventionele single-modality benaderingen (bijvoorbeeld transcriptoom/proteoom alleen of farmacologische screening) vaak een cruciale wisselwerking tussen moleculaire lagen missen (bijv. genexpressie, eiwitdynamiek, medicijnrespons), en daarin slagen erin synergetische drijfveren of off-target effecten niet te vangen10,11. De geïntegreerde multi-omics-pijplijn overwint deze beperkingen door tegelijkertijd transcriptomische, secretomische en farmacologische gegevens binnen hetzelfde systeem te profileren, wat een holistisch beeld van het ziektemechanisme oplevert. Netwerkfarmacologie, algoritmen voor liganden/doelvoorspelling en in silico moleculaire docking maken systematisch onderzoek mogelijk van goedgekeurde geneesmiddelenbibliotheken, waardoor de herpositionering of ontdekking van verbindingen die complexe ziektesignaturen kunnen tegengaanwordt versneld 3. Deze paradigmaverschuiving biedt bijzondere potentie voor het identificeren van therapieën die gericht zijn op endotheeldysregulatie en de verwoestende microvasculaire gevolgen daarvan, zoals DKD, en biedt potentieel voor verbeterde effectiviteit en verminderde bijwerkingenprofielen. Integratie van transcriptomische/secretomische analyses van hyperglykemie-blootgestelde endotheelcellen bracht 534 vaak opgereguleerde moleculen vast. Functionele verrijking bracht extracellulaire matrixremodellering, oxidatieve stress en ontsteking in verband met vroege DKD-pathogenese. Cross-databaseanalyse gaf prioriteit aan 278 high-confidence doelen, verfijnd via PPI-netwerken van hubgenen. Netwerkfarmacologische screening van goedgekeurde geneesmiddelen voorspelde 85 kandidaatverbindingen (waaronder brefeldine-A, bruceantine, paracetamol en idelalisib) die zich op deze hubs richtten. In silico onderzochten de voorspelling en koppeling van transcriptiefactoren mechanismen. Dit werk definieert endotheliale drijfveren van DKD, stelt een computationele ontdekkingspijplijn vast en biedt therapeutische kandidaten voor validatie. Uiteindelijk wordt verwacht dat deze pijplijn therapeutische ontdekkingsprogramma's voor diabetische complicaties zal bevorderen.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De dierproeven werden uitgevoerd met goedkeuring van het Comité voor Dieronderzoek en Ethiek van het Hebei Yiling Medisch Onderzoeksinstituut (goedkeuringsnummer: N2024082). Bekijk de Materiaaltabel voor de experimentele materialen en instrumenten die in deze studie zijn gebruikt. Personeel moet strikt passende persoonlijke beschermingsmiddelen (PBM) dragen bij het hanteren van gevaarlijke reagentia zoals TRIzol (huid-/oogirritant, bevat fenol) en proteaseremmers (potentiële ademhalings-/huidsensitisatoren). Scheid biologisch/vloeibaar afval in autoclavabele zakken, en gevaarlijk chemisch afval in aangewezen containers voor institutionele gevaarlijke verwijdering. Decontaminateer verbruiksartikelen vóór verwijdering.

Modellering van diabetische nefropathie muizen

De mannelijke db/db en db/m muizen (12 weken oud) werden onder specifieke ziekteverwekkervrije (SPF) omstandigheden gehouden bij 22 ± 2 °C en 56% ± 5% luchtvochtigheid, met 12 uur licht/donker cycli en ad libitum toegang tot voedsel/water. Na een acclimatisatieperiode van 1 week kregen de muizen willekeurig numerieke identificaties toegewezen en werden ze toegewezen aan experimentele groepen. De db/db-muizen kregen 6 weken lang een eiwitrijk dieet om DKD vast te stellen. Succesvol modelleren werd bevestigd door een significant verhoogde urinealbumine-creatinine verhouding (UACR) ten opzichte van db/m controles, waarbij UACR >30 mg/g de primaire functionele biomarker vormde voor vroege DKD12.

Modellering van high-glucose endotheelcellen

Menselijke nierglomerulaire endotheelcellen (HRGEC's) werden onder gestandaardiseerde omstandigheden bereid. HRGECs werden gekweekt in ofwel normale glucose (NG, 5,5 mM D-glucose) of een hoog glucosegehalte (HG, 30 mM D-glucose) medium en gehouden in een bevochtigde couveuse op 37 °C met 5%CO2. Cellen werden ofwel ononderbroken blootgesteld aan HG of gekweekt in controleomstandigheden gedurende 24 uur voorafgaand aan downstream-analyses. Osmotische controle (HM, met 5,5 mM D-glucose en 24,5 mM mannitol) moet worden opgenomen. Alle aandoeningen moeten voldoen aan strikte celfitnesscriteria: levensvatbaarheid bleef ≥85%, apoptoseniveaus bleven onder de 15%, ROS-stijgingen in HG ten opzichte van HM niet boven de 20%, en LDH-afgifte bleef onder de 10%, waarmee de cellulaire integriteit werd gevalideerd vóór downstream-analyses.

Geconditioneerde mediacollectie

Geconditioneerde media (CM) werden verzameld met behulp van een gestandaardiseerd protocol voor secretoomanalyse13 met aanpassingen. Na 24 uur van hoge glucose (30 mM D-glucose), normale glucose (5,5 mM D-glucose) of osmotische controle (5,5 mM D-glucose + 24,5 mM mannitol) stimulatie, werden HRGECs gewassen met steriele fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS) om resterende serumeiwitten te verwijderen. Cellen werden aangevuld met serumvrij, fenol roodvrije endotheliale basale medium en 12 uur geïncubeerd bij 37 °C met 5% CO₂ om afgescheiden factoren op te nemen.

CM werd geoogst met voorgekoelde centrifugatiebuizen. Sequentieel werd de monsterverwerking uitgevoerd zoals hieronder beschreven.

Primaire verduidelijking: CM werd overgebracht naar RNase/DNase-vrije kegelvormige buizen en gecentrifugeerd op 3.000 x g gedurende 10 minuten bij 4 °C. Het gekorrelde puin werd weggegooid.

Protease-remming: Binnen 2 minuten na primaire klaring werd een EDTA-vrije proteaseremmercocktail toegevoegd aan een eindconcentratie van 1x (1:50) met 1x fosfataseremmers.

Concentratie: Supernatant werd onmiddellijk geladen in voorgespoelde PBS-centrifugaalfilters (3 kDa MWCO) en gecentrifugeerd op 4.000 x g gedurende 90 minuten bij 4 °C om een concentratie van 10x te bereiken.

Secundaire verduidelijking: Het concentraat werd overgebracht naar voorgekoelde microcentrifugebuizen en gecentrifugeerd op 12.000 x g gedurende 15 minuten bij 4 °C. Supernatant werd verzameld, waarbij gepelleteerde aggregaten werden vermeden.

Opslag: Aliquots van 50 μL volumes werden gemaakt in steriele, laag-eiwitbindende cryovialen. De flesjes werden binnen 30 minuten na de oogst snel ingevroren in vloeibare stikstof. Flesjes werden bewaard bij -80 °C (geen vries-dooicycli).

CM-batches ondergingen endotoxinetests (<0,25 EU/mL). Het serumvrije incubatieprotocol toonde geen stressinductie (gevalideerd door HSP70/CHOP immunoblots). CM-eiwitopbrengst genormaliseerd naar een levensvatbaar celaantal/DNA-gehalte bij oogst. Processtrengheid gehandhaafd: steriele techniek overal; ≤30 minuten oogst-naar-vriesvenster; Rotortemperatuurevenwicht bevestigd.

CCK-8 assay van geconditioneerde media-behandelde nierbuiscellen

Om de functionele impact van het endotheliale secretoom op de levensvatbaarheid van niertubulaire cellen te evalueren, werd een CCK-8-assay uitgevoerd op de humane renale proximale tubulaire epitheelcellijn HK-2, behandeld met CM afkomstig van menselijke renale glomerulaire endotheelcellen (HRGECs), volgens vastgestelde protocollen. HK-2-cellen werden gekweekt in DMEM-medium aangevuld met 10% foetaal rundserum (FBS). Voor de assay werden cellen in 96-wellplaten geplaatst met een dichtheid van 5 x 10³ cellen per put. Serum-uithongering van cellen werd 12 uur lang uitgevoerd in een medium met 0,5% FBS direct voorafgaand aan de CM-behandeling.

CM werd toegepast met gelijke totale genormaliseerde eiwitmassa. Bevroren CM-aliquots werden ontdooid bij 37 °C in een droog bad (<5 min) en gezuiverd door centrifugatie bij 10.000 x g gedurende 5 minuten bij 4 °C. HK-2-cellen (100 μL/put) werden behandeld met HG-CM, NG-CM of HM-CM, genormaliseerd naar een gematchte eiwit-/DNA-inhoud. In totaal werden 3 biologische replicaten per conditie (met elk 3 technische replicaten) voorbereid. Monsters werden geïncubeerd bij 37 °C met 5% CO₂ gedurende 24 uur. De cellevensvatbaarheid werd beoordeeld met behulp van de Cell Counting Kit-8. Om dit te doen werd 10 μL CCK-8-oplossing aan elke put toegevoegd en 1-4 uur geïncubeerd bij 37 °C. De absorptie werd gemeten op 450 nm met een microplaatlezer. De levensvatbaarheid werd als volgt berekend:

Levensvatbaarheid (%) = [(A_sample - A_blank) / (A_baseline_control - A_blank)] x 100

Detectie van oxidatieve stress

De cellulaire malondialdehyde (MDA)-niveaus werden gekwantificeerd, een van de belangrijkste eindproducten van membraanlipideveroksidatie, via de TBA-assay. Cellysaten (1 x 10 à7 cellen) werden geklarificeerd door te centrifugeren op 10.000 x g gedurende 15 minuten, waarna 0,02 mL supernatant werd in monsterbuizen gealiquoteerd naast 0,02 mL MDA-standaarden. Aan de aliquot werden 0,02 mL klarificant en 0,6 mL zuurreagens toegevoegd. De monsters/standaarden werden behandeld met 0,2 mL van het chromogene agent (controlebuisjes: 0,2 mL 50% azijnzuur werd toegevoegd). Na afdichten, mengen en incuberen bij 100 °C gedurende 40 minuten, werden de monsters afgekoeld en vervolgens 10 minuten gecentrifugeerd op 9569 x g . Het supernatant werd overgebracht naar microplaten bij 250 μL voor OD₅₃₂-metingen.

Transcriptomische profilering

Total RNA werd geïsoleerd met behulp van TRIzol-reagens volgens het protocol van de fabrikant. De hoeveelheid en zuiverheid van RNA werden respectievelijk beoordeeld met een spectrofotometer en fragmentanalysator. Alleen hoogwaardige RNA-monsters werden gebruikt met RNA Integrity Number (RIN) > 7.0 voor sequencing-bibliotheekconstructie.

Polyadenyleerd (poly(A)+) mRNA werd verrijkt door twee rondes van oligo(dT) magnetische kraalselectie. Het gezuiverde mRNA werd gefragmenteerd tot 200-300 nucleotiden met behulp van een magnesium-gebaseerde fragmentatiekit bij 94 °C gedurende 5-7 minuten. Eerstestreng cDNA-synthese werd uitgevoerd met reverse transcriptase, gevolgd door tweede-streng cDNA-synthese met behulp van E. coli DNA-polymerase I en RNase H in aanwezigheid van dUTP (om strengspecificiteit mogelijk te maken). Vervolgstappen omvatten eindreparatie, A-tailing, adapterligatie en maatkeuze met magnetische kralen. Voor PCR-amplificatie werd de in dUTP geïncorporeerde tweede streng verteerd met het UDG-enzym.

Er werd een streng-specifieke bibliotheek opgebouwd met een gemiddelde insertgrootte van 400 ± 50 bp met behulp van PCR onder de volgende voorwaarden: initiële denaturatie bij 98 °C gedurende 1 minuut; 14 denaturatiecycli bij 98 °C gedurende 10 seconden, uitgloeien bij 60 °C gedurende 30 seconden, en verlenging bij 72 °C gedurende 30 seconden; en een laatste verlenging bij 72 °C voor 5 minuten. Paired-end 150 bp sequencing werd uitgevoerd op een Illumina-platform, met een sequencingdiepte van ≥40 miljoen reads per sample (Q30 > 85%).

Bio-informatische analyse van transcriptomische gegevens

Kwaliteitscontrole van de ruwe reads werd uitgevoerd met FastQC (v0.11.8), en de uitlijning met het GRCh38.p13 referentiegenoom met HISAT2 (v2.2.1) werd uitgevoerd. Transcriptkwantificatie en transcriptassemblage per sample werden uitgevoerd met StringTie (v2.1.6) met standaardparameters. Alle samengestelde transcriptomen werden samengevoegd uit individuele samples om een uitgebreid transcriptoom te reconstrueren met behulp van gffcompete-software (v0.12.6; gffcompare is een zelfstandig hulpmiddel, geen onderdeel van StringTie, en de versie is gecorrigeerd naar de common stable release). Differentiële expressie-analyse werd uitgevoerd met DESeq2 (v1.38.3) met behulp van drempels van |log2 keer verandering (FC)| > 1 en valse ontdekkingsrate (FDR) < 0,05. Batch-effecten werden gecorrigeerd via het variancePartition-pakket.

Secretome proteomische analyse

CM werd verzameld uit HRGEC's die onder NG-, HG- of HM-controleomstandigheden werden gekweekt met behulp van eerder beschreven methode13 met aanpassingen voor secretomanalyse. Cellen werden na stimulatie met PBS gewassen en 12 uur geïncubeerd in serumvrij medium. CM werd verzameld en gecentrifugeerd op 3.000 x g gedurende 10 minuten (4 °C).

Gelijke hoeveelheden peptide uit elk monster werden gemengd en vervolgens verdund met oplosmiddel A (5% ACN, pH 9,8) en in de kolom geïnjecteerd. De fractionering van het peptidemengsel werd uitgevoerd met een kolom van 3,5 μm 4,6 x 150 300Extend-C18 op het Binary Rapid Separation System. Gradiëntelusie werd uitgevoerd bij een debiet van 0,3 mL/min: 5% tot 21% oplosmiddel B (97% ACN, pH 9,8) in 38 minuten, 21,5% tot 40% oplosmiddel B in 20 minuten, 40% tot 90% oplosmiddel B in 2 minuten, 90% oplosmiddel B gedurende 3 minuten, en 5% oplosmiddel B in evenwicht gedurende 10 minuten. Elutiepieken werden gemonitord op 214 nm en fracties werden elke minuut verzameld. De fracties werden gecombineerd volgens chromatogrammen van de elutiepieken. In totaal werden 10 fracties verzameld, die vervolgens werden gevriesdroogd.

Mobiele fasen A (100% water, 0,1% mierenzuur) en B (80% acetonitril) werden bereid, en de gedroogde peptidemonsters werden gereconstitueerd met 0,1% mierenzuur en gecentrifugeerd op 20.000 x g gedurende 10 minuten. De scheiding vond plaats met een UHPLC-vloeistoffasesysteem. De monsters werden gevoed op een ES906 HPLC-kolom (150 mm) met een gradiënt van 8 minuten van 2,5 μL/min, en gescheiden met de volgende effectieve gradiënt: 0-4 min, 4% mobiele fase B lineair oplopend tot 25%; 4-6,9 min, mobiele fase B die lineair oploopt van 25% naar 35%; 6,9-7,3 min, mobiele fase B lineair opbouwend van 35% naar 99%; 7,3-8,0 min, mobiele fase B op 99% behouden. De vloeistoffase-gescheiden peptiden werden overgebracht naar een massaspectrometer voor DIA-modusverwerving. De belangrijkste parameters werden als volgt ingesteld: genormaliseerde botsingsenergie 25%, standaard laadtoestand 2, resolutie 240.000, scannen elke 0,6 seconde, scanbereik 380-980 m/z, massaspectrometrie AGC 500%. Fragmentatie-ionenscans werden opgenomen met een maximale scantijd van 3 ms en maakten gebruik van 300 2-E scanvensters, variërend van 380 tot 980 m/z.

De DIA-NN (https://www.nature.com/articles/s41592-019-0638-x, versie 1.9.1) werd gebruikt om de DIA-gegevens te analyseren met een bibliotheekvrije methode. MS/MS-gegevens werden gezocht met eiwitsequenties, die werden gedownload uit de Uniprot-database met de volgende instellingen: enzym: Trypsine/P; Maximale gemiste decolletés: 2; vaste modificatie: carbamidomethyl (C); variabele modificaties: oxidatie (M) en acetyl (eiwit N-term); Tolerantie voor voorlopermassa: 20 ppm; fragmentmassatolerantie: 0,05 Da. De resultaten werden gefilterd met 1% FDR, en alleen die eiwitgroepen werden gebruikt die aan dit filtercriterium voldeden in downstream-analyse.

Omics functionele verrijkingsanalyse (GO, KEGG en GSEA)

Functionele verrijkingsanalyses werden uitgevoerd op gefilterde sets van differentieel tot expressie gedrukte genen (transcriptomics) en eiwitten (secretomproteomics), volgens gevestigde bio-informatica-pijplijnen. Identifiers werden in kaart gebracht met behulp van Org.Hs.eg.db. GO-verrijking (biologische processen, moleculaire functies, cellulaire componenten) werd uitgevoerd via clusterProfiler. Benjamini-Hochberg paste de p-waarde < 0,05, en semantische gelijkenisvermindering (cutoff=0,7) werd toegepast op condenstermen. KEGG-routeanalyse werd uitgevoerd met behulp van KEGG REST API (heeft, release 2023). Hypergeometrische toetsing werd toegepast met Yekutieli FDR-correctie. De visualisatie van pathwaytopologie is gedaan met Pathview. GSEA werd toegepast met een ranggebaseerde benadering met signaal-ruis-genrangschikking. Testverrijking met MSigDB-collecties (HALLMARK, C2, C5; v2023.2) en gecureerde diabetische endotheelsignaturen werd uitgevoerd. De significantie werd beoordeeld na 1000 fenotypepermutaties (FDR < 25%).

Analyse van eiwit-eiwitinteractienetwerken

Om kernregulatoren voor moleculaire factoren binnen de pathogene kandidatenpool te identificeren, werden PPI-netwerkconstructie en topologische analyse uitgevoerd met behulp van een geïntegreerde computationele workflow. De 278 kandidaatgenen werden ingediend bij de STRING-database (v12.0; Homo sapiens; Bewijsbronnen omvatten experimentele, co-expressieve en gecureerde databases; een interactiebetrouwbaarheid (gecombineerde score) drempel >0,7 voor voordelen met hoge betrouwbaarheid; en geen extra interactor-inflatie. De resultaten werden geïmporteerd in Cytoscape (v3.9.1), en netwerktopologie-analyse werd uitgevoerd met behulp van MCODE (v1.5.2) en CytoHubba (v0.4.1) plugins. Vervolgens werd het netwerk visueel geoptimaliseerd op basis van de mate van verbinding van de knooppunten, zodat knooppunten met hoge connectiviteit donkerder van kleur, groter van formaat en prominenter in label zijn.

Ontwikkeling van een diabetische nierziekte-doelgenset

De criteria voor co-upregulated mRNA's/eiwitten werden als volgt gedefinieerd: transcriptoom (FDR < 0,05 en |log2FC| > 1) en secretoom (FDR < 0,01 en |log2FC| > 1,5). Eiwit- en gennamen werden genormaliseerd met UniProt en omgezet naar een uniform formaat (Gensymbool). Een doelgenset werd geconstrueerd voor diabetische nierziekte door ziekte-geassocieerde genen te integreren uit meerdere openbare databases, waaronder GeneCards (Versie 5.25, zoekterm: Diabetische Nefropathieën, geraadpleegd juli 2025), de Comparative Toxicogenomics Database (CTD; https://ctdbase.org/, zoekterm: Diabetische Nefropathieën, geraadpleegd juli 2025) en Open Targets Platform (https://platform.opentargets.org/, versie 0.13.8, zoekterm: Diabetische Nefropathieën, geraadpleegd juli 2025) 13,14,15. Dit werd aangewezen als de uitgebreide referentieset voor diabetische nierziekten. De kruising tussen co-upregulated mRNA's/eiwitten en deze genenset werd geïdentificeerd voor downstream analyses.

CCL2-eiwitdetectie

Om CCL2 te kwantificeren werd een 96-wellplaat bedekt met vangstantilichaam (100 μL/put) en 's nachts geïncubeerd bij 4 °C. De volgende dag werd de plaat gewassen met 2x met buffer en geblokkeerd met ELISA-verdunningsmiddel (200 μL/put) gedurende 1 uur bij RT. Een 7-punts standaardcurve werd opgesteld door tweevoudige seriële verdunningen van de S1-standaard, waarna de monsters (100 μL/put) werden toegevoegd en 2 uur bij 400 rpm geïncubeerd. Na 5x wassen werd het detectieantilichaam (100 μL/put) toegevoegd en 1 uur geïncubeerd bij 400 rpm, gevolgd door enzymoplossing (100 μL/put) toevoeging en incubatie gedurende 30 minuten bij 400 rpm. De monsters werden ontwikkeld met TMB-substraat (15-30 min, RT). De reactie stopte met zuur (100 μL/put), en de absorptie werd gemeten op 450 nm (620 nm referentie optioneel). Belangrijke stappen zijn streng wassen, getimede incubaties en gestandaardiseerde verdunningen om reproduceerbaarheid te waarborgen.

Geneesmiddelherpositionering

Therapeutische verbindingen werden voorspeld met het volgende platform: LINCS L1000 Characteristic Direction Signatures Search Engine (L1000CDS2; https://maayanlab.cloud/L1000CDS2). Dit platform maakt gebruik van de MODZ-methode en karakteristieke richtingsanalyse om kleine moleculen of verbindingscombinaties te identificeren die in staat zijn om inputgenexpressiesignaturen16 om te keren of na te bootsen. Kandidaatgeneesmiddelen werden geïdentificeerd als die welke de disregulatie van differentieel tot expressie gebrachte niergenen omkeren met dit platform. De verbindingen werden gerangschikt op basis van hun reversalscores in niercellijnen door geselecteerde nier in de weefselkolom, en de hoogst gerangschikte kandidaten werden onderworpen aan moleculaire docking om hun bindingsaffiniteiten met de belangrijkste eiwitdoelen te evalueren.

Co-regulatorische transcriptiefactorscreening

De hTFtarget-database werd doorzocht op co-regulatorische TFsbinding aan de genset. De hTFtarget-database werd geanalyseerd om relaties tussen menselijke transcriptiefactor (TF) en target genen te identificeren door rekenkundig grootschalige ChIP-Seq-datasets te analyseren over diverse cellen, weefsels en omstandigheden. De integratieve pijplijn combineerde ChIP-Seq pieksignalen met epigenetische context om TF-binding in promotoren/enhancers nauwkeurig te lokaliseren, waarbij expliciet rekening werd gehouden met ruimtelijke reguleringsdynamiek. Zoals aangetoond door Zhang et al., diende het als een multidimensionaal platform dat het mogelijk maakte om TF-doelen of genregulatoren te verkennen, ChIP-Seq-gegevens te visualiseren, TF-coöperativiteit te onderzoeken en bindingsplaatsen te voorspellen17.

Computationele pijplijn en analyse voor kleine molecuul-eiwitkoppeling

AutoDock Vina 1.2.018 werd gebruikt om moleculaire dockinganalyses uit te voeren van bindingsinteracties tussen actieve ingrediënten en de transcriptiefactoren BRD4, CTCF, EP300 en SPI1. De kristalstructuren van BRD4 (PDB ID: 7REK), CTCF (PDB ID: 5K5I), EP300 (PDB ID: 5NU5) en SPI1 (PDB ID: 8E3K) werden verkregen uit de Protein Data Bank (https://www.rcsb.org/)19,20. Kleine molecuulstructuren in SDF-formaat werden gedownload van de PubChem-database (https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/ 21), omgezet naar MOL2-formaat met Open Babel 2.4.1, en energie-geminimaliseerd met PyRx 0.8. Eiwitvoorbewerking werd uitgevoerd door watermoleculen te verwijderen, waterstofatomen toe te voegen, Gasteiger-ladingen te berekenen en deze om te zetten naar PDBQT-formaat (vereist voor AutoDock Vina). Er werd een semi-flexibele koppelingsstrategie toegepast, waarbij de positie en afmetingen van het koppelrooster werden gedefinieerd op basis van de bindingsplaatsen van co-gekristalliseerde liganden in elk eiwit. MA9-086 dient als positieve controle-ligand voor BRD4, en XDM-CBP voor EP300. Voor CTCF en SPI1 (zonder bekende positieve liganden) werden potentiële bindingspockets geïdentificeerd via structurele analyse met het online platform Proteins Plus (https://proteins.plus/). De parameters van het koppelrooster werden als volgt ingesteld (coördinaten en afmetingen in Å langs de x-, y- en z-assen): BRD4 centrum op (-11,907, -8,617, -3,973) met een boxgrootte van (18,387, 18,387, 18,387); CTCF-centrum op (15.165, 4.854, 6.388) en boxgrootte (17.25, 20.25, 9.75); EP300 midden op (39.781, 5.326, 9.998) en boxgrootte (16.516, 16.516, 16.516); SPI1 in het midden van (3,155, -3,853, 0,668) en boxgrootte (17,25, 25,5, 10,5). Tijdens het koppelen werd het energiebereik ingesteld op 3, de exhaustiviteitsparameter op 8 en de gridspacing op 0,375 Å. Bindingsstabiliteit werd beoordeeld aan de hand van bindingsenergie, waarbij lagere waarden wijzen op stabielere conformaties en een hogere interactiewaarschijnlijkheid, met een drempel van <-5 kcal/mol gedefinieerd als sterke bindingsactiviteit22,23. Ten slotte werden interactiemodi tussen verbindingen en receptoren geïdentificeerd met behulp van PyMOL.

Statistische analyse

De gegevens worden gepresenteerd als gemiddelde ± SEM. Statistische tests werden geselecteerd op basis van normaliteit (Shapiro-Wilk) en variantiehomogeniteit (Levene-test). Ongepaarde t-tests (twee groepen) of eenrichtings-ANOVA met LSD post hoc tests (≥3 groepen) werden gebruikt voor vergelijkingen tussen groepen. Een p < 0,05 werd gedefinieerd als een significantiedrempel. Grafieken werden gegenereerd met GraphPad Prism 9.0.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Demonstratie van de pathogene impact van het hyperglycemische endotheelsecretoom op niertubuli

Deze studie begon met de validatie van het pathogene effect van het hyperglykemische endotheelsecretoom. Geconditioneerd medium van hyperglycemische menselijke glomerulaire endotheelcellen (HG-CM) verstoorde de levensvatbaarheid van menselijke proximale tubulus epitheelcellen (HK-2) aanzienlijk vergeleken met de contro...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Deze studie stelt hyperglykemie-geïnduceerde endotheliale secretomdysfunctie vast als een cruciale oorzaak van diabetisch nierletsel via geïntegreerde multi-omics en computationele benaderingen. Aantoning dat door secretoom gemedieerde cytotoxiciteit ten opzichte van niertubuli samenvalt met systematische ontregeling van 534 endotheelafgeleide factoren die samenkomen op matrixremodeling, oxidatieve stress en ontstekingskernroutes in DKD-pathogenese. De identificatie van 278 hoog-vertrouw...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De auteurs hebben niets te onthullen.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dit werk werd ondersteund door de National Natural Science Foundation of China (32200644), het Science and Technology Program Project van Hebei (246W2501D, 252W7716D) en het Yanzhao Golden Platform (A20240022).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
CCL2 ELISA kitThermo Fisher Scientific#88-7399-88
CCR2 inhibitorMerck Millipore#227016
Cell Viability Assay KitSeven BiotechnologyCCK-8, SC119-01
DNA SequencerIlluminaNovaSeq 6000
High-Performance Liquid Chromatography SystemThermo Fisher ScientificUltiMate 3000 Binary RSLC
HRGECs Culture mediumShanghai Zhong Qiao Xin Zhou Biotechnology Co., Ltd.1001
Human Renal Glomerular Endothelial Cells (HRGECs)Shanghai Zhongqiao Xinzhou BiotechnologyPRI-H-00038
Human Renal Tubular Epithelial Cell Complete Medium ProcellCM-H193
Human Renal Tubular Epithelial Cells (HK2)ProcellCP-H193
Male db/db and db/m mice (4-week-old)Hangzhou Ziyuan Biotech Co., Ltd.SCXK 20190004
Mass SpectrometerThermo Fisher ScientificAstral
Microplate Absorbance ReaderMolecular DevicesSpectraMax iD5
Protease Inhibitor Cocktail (EDTA-free)RochecOmplete, #5056489001
RNA Extraction ReagentThermo Fisher ScientificTRIzol, #15596026
RNA Quality AnalyzerAgilent Technologies5300 Fragment Analyzer, M5311AA
RNA Quantification InstrumentThermo Fisher ScientificQubit 3.0, Q33216
ROS detection kitThermo Fisher Scientific#EEA019
Ultrafiltration Centrifugal Devices (3 kDa MWCO)Merck MilliporeAmicon Ultra-4

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Tuttle, K. R., et al. Diabetic kidney disease: a report from an ADA Consensus Conference. Diabetes Care. 37 (10), 2864-2883 (2014).
  2. Gu, H. F. Genetic and Epigenetic Studies in Diabetic Kidney Disease. Front Genet. 10, 507(2019).
  3. Młynarska, E., et al. Novel Insights into Diabetic Kidney Disease. Int J Mol Sci. 25 (18), (2024).
  4. Tanase, D. M., et al. Oxidative Stress and NRF2/KEAP1/ARE Pathway in Diabetic Kidney Disease (DKD): New Perspectives. Biomolecules. 12 (9), (2022).
  5. Li, S., et al. Research progress on extracellular vesicles in the renal tubular injury of diabetic kidney disease. Front Endocrinol (Lausanne). 14, 1257430(2023).
  6. Chen, Y., et al. ANGPT2/CAV1 regulates albumin transcytosis of glomerular endothelial cells under high glucose exposure and is impaired by losartan. Nefrologia (Engl Ed). 44 (1), 50-60 (2024).
  7. Chae, S. Y., Kim, Y., Park, C. W. Oxidative Stress Induced by Lipotoxicity and Renal Hypoxia in Diabetic Kidney Disease and Possible Therapeutic Interventions: Targeting the Lipid Metabolism and Hypoxia. Antioxidants. 12 (12), (2023).
  8. Wang, X., et al. CERS6-derived ceramides aggravate kidney fibrosis by inhibiting PINK1-mediated mitophagy in diabetic kidney disease. Am J Physiol Cell Physiol. 325 (2), C538-C549 (2023).
  9. Zou, Y., et al. Development and internal validation of machine learning algorithms for end-stage renal disease risk prediction model of people with type 2 diabetes mellitus and diabetic kidney disease. Ren Fail. 44 (1), 562-570 (2022).
  10. Ma, L., et al. Baicalin Alleviates Oxidative Stress and Inflammation in Diabetic Nephropathy via Nrf2 and MAPK Signaling Pathway. Drug Des Devel Ther. 15, 3207-3221 (2021).
  11. Du, L., et al. Inhibition of S100A8/A9 ameliorates renal interstitial fibrosis in diabetic nephropathy. Metabolism. 144, 155376(2023).
  12. Imafuku, T., et al. Cysteinylated Albumin as a Potential Biomarker for the Progression of Kidney Disease in Patients With Type 2 Diabetes. Diabetes Care. 44 (6), e115-e117 (2021).
  13. Ochoa, D., et al. The next-generation Open Targets Platform: reimagined, redesigned, rebuilt. Nuc Acids Res. 51 (D1), D1353-D1359 (2023).
  14. Safran, M., et al. GeneCards Version 3: the human gene integrator. Database (Oxford). 2010, baq020(2010).
  15. Davis, A. P., et al. Comparative Toxicogenomics Database (CTD): update 2023. Nucl Acids Res. 51 (D1), D1257-D2126 (2023).
  16. Duan, Q., et al. L1000CDS2: LINCS L1000 characteristic direction signatures search engine. NPJ Syst Biol Appl. 2 (1), (2016).
  17. Zhang, Q., et al. hTFtarget: A Comprehensive Database for Regulations of Human Transcription Factors and Their Targets. Genom Proteo Bioinfo. 18 (2), 120-128 (2020).
  18. Trott, O., Olson, A. J. AutoDock Vina: Improving the speed and accuracy of docking with a new scoring function, efficient optimization, and multithreading. J Comp Chem. 31 (2), 455-461 (2009).
  19. Karuppasamy, M. P., Venkateswaran, S., Subbiah, P. PDB-2-PBv3.0: An updated protein block database. J Bioinfo Comp Biol. 18 (02), (2020).
  20. O'Boyle, N. M., et al. Open Babel: An open chemical toolbox. J Cheminfo. 3 (1), (2011).
  21. Kim, S., et al. PubChem Substance and Compound databases. Nuc Acids Res. 44 (D1), D1202-D1213 (2016).
  22. Li, B., Rui, J., Ding, X., Yang, X. Exploring the multicomponent synergy mechanism of Banxia Xiexin Decoction on irritable bowel syndrome by a systems pharmacology strategy. J Ethnopharmacol. 233, 158-168 (2019).
  23. Xue, B., et al. A System-Level Investigation into the Mechanisms of Chinese Traditional Medicine: Compound Danshen Formula for Cardiovascular Disease Treatment. PLoS ONE. 7 (9), (2012).
  24. Kasiske, B. L., et al. Response to Bui et al, "Patient Functional Status at Transplant and Its Impact on Posttransplant Survival of Adult Deceased-donor Kidney Recipients". Transplantation. 104 (2), e59(2020).
  25. Kawecki, C., Lenting, P. J., Denis, C. V. von Willebrand factor and inflammation. J Thromb Haemost. 15 (7), 1285-1294 (2017).
  26. Wilkening, A., et al. C-C chemokine receptor type 2 mediates glomerular injury and interstitial fibrosis in focal segmental glomerulosclerosis. Nephrol Dial Transplant. 35 (2), 227-239 (2020).
  27. Karasek, D., et al. Association of pigment epithelium derived factor with von Willebrand factor and plasminogen activator inhibitor 1 in patients with type 2 diabetes. Physiol Res. 68 (3), 409-418 (2019).
  28. Liu, J., et al. Single-Cell Spatial Transcriptomics Unveils Platelet-Fueled Cycling Macrophages for Kidney Fibrosis. Adv Sci (Weinh). 11 (29), e2308505(2024).
  29. Passi, I., Salwan, S., Kumar, B. US-FDA Approved Drugs in 2020 and 2021: A Review. Mini Rev Med Chem. 23 (12), 1273-1297 (2023).
  30. Das, P., Delost, M. D., Qureshi, M. H., Smith, D. T., Njardarson, J. T. A Survey of the Structures of US FDA Approved Combination Drugs. J Med Chem. 62 (9), 4265-4311 (2019).
  31. Zhou, L., et al. Brefeldin A inhibits colorectal cancer growth by triggering Bip/Akt-regulated autophagy. Faseb J. 33 (4), 5520-5534 (2019).
  32. Issa, M. E., Berndt, S., Carpentier, G., Pezzuto, J. M., Cuendet, M. Bruceantin inhibits multiple myeloma cancer stem cell proliferation. Cancer Biol Ther. 17 (9), 966-975 (2016).
  33. Guzzi, F., Cirillo, L., Roperto, R. M., Romagnani, P., Lazzeri, E. Molecular Mechanisms of the Acute Kidney Injury to Chronic Kidney Disease Transition: An Updated View. Int J Mol Sci. 20 (19), (2019).
  34. Tesch, G. H. MCP-1/CCL2: a new diagnostic marker and therapeutic target for progressive renal injury in diabetic nephropathy. Am J Physiol Renal Physiol. 294 (4), F697-F701 (2008).
  35. Wu, F., Sun, C. The Role of Chemokine Receptors in Renal Fibrosis. Rev Physiol Biochem Pharmacol. 177, 1-24 (2020).
  36. Davids, M. S., et al. An Integrated Safety Analysis of the Next Generation PI3Kδ Inhibitor Umbralisib (TGR-1202) in Patients with Relapsed/Refractory Lymphoid Malignancies. blood. 130, 4037(2017).
  37. Marar, P. V., Kumar, A., Swami, R., Shrivastava, S., Jeengar, M. K. Unlocking the Potential of Brusatol as an Antitumoral Agent: Molecular Mechanisms and Therapeutic Benefits. Rev Brasileira Farmaco. 34, 250-260 (2024).
  38. Seifert, S. A., et al. Acute hepatotoxicity associated with therapeutic doses of intravenous acetaminophen. Clin Toxicol. 54 (3), 282-285 (2016).
  39. Bolesta, S., Haber, S. L. Hepatotoxicity Associated with Chronic Acetaminophen Administration in Patients without Risk Factors. Ann Pharmacother. 36 (2), 331-333 (2002).
  40. Zhao, L., Zou, Y., Liu, F. Transforming Growth Factor-Beta1 in Diabetic Kidney Disease. Front Cell Dev Biol. 8, 187(2020).
  41. Matoba, K., et al. Unraveling the Role of Inflammation in the Pathogenesis of Diabetic Kidney Disease. Int J Mol Sci. 20 (14), (2019).
  42. Ezzo, M., Hinz, B. Novel approaches to target fibroblast mechanotransduction in fibroproliferative diseases. Pharmacol Ther. 250, 108528(2023).
  43. Giarratana, A. O., Prendergast, C. M., Salvatore, M. M., Capaccione, K. M. TGF-β signaling: critical nexus of fibrogenesis and cancer. J Transl Med. 22 (1), 594(2024).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Endothelial DysfunctionDiabetic Kidney DiseaseMulti Omics AnalysisTranscriptomic ProfilingSecretome ProteomicsHyperglycemic Endothelial CellsProtein Interaction NetworkDrug RepurposingNetwork PharmacologyMolecular Docking

Related Articles