Onderzoeksartikel
Een door collagenase geïnduceerd muismodel van intracerebrale bloeding (ICH) werd behandeld met lansoprazol. Lansoprazol verlichtte niet alleen door ICH veroorzaakte darmbeschadiging en verlaagde de niveaus van lipopolysaccharide (LPS) en IL-1β, maar remde ook hersenontsteking. Lansoprazol verbeterde het leren en geheugen (de langetermijnneurologische functie) van ICH-muizen.
Intracerebrale bloeding (ICH) kan het maag-darmkanaal aantasten en darmbeschadiging veroorzaken, wat bijdraagt aan slechte klinische resultaten. Deze studie onderzocht de effecten van lansoprazol op darmbeschadiging en neurologische functie bij muizen met ICH. Muizen werden stereotactisch geïnjecteerd met collagenase om een ICH-model te vestigen. Neurologische functie, hersenwatergehalte, doorlatendheid van bloed-hersenbarrière, darmbeschadiging en darmpermeabiliteit werden geëvalueerd. Ook werden de niveaus van LPS en IL-1β in het bloed en de hersenen geanalyseerd. De behandeling met lansoprazol was geassocieerd met verminderde darmbeschadiging, verminderde niveaus van LPS en IL-1β in bloed en hersenen, een lager watergehalte in de hersenen en geremde hersenontsteking bij ICH-muizen. Hoewel toediening van lansoprazol niet leidde tot verbeterde prestaties in de Garcia-, voorpotpositie- en rotarod-tests (kortetermijnneurologische functie), verbeterde het het leren en geheugen (langetermijn neurologische functie) significant. Deze bevindingen gaven aan dat de behandeling met lansoprazol geassocieerd was met verbeterde langetermijn neurologische uitkomsten en minder darmbeschadiging bij ICH-muizen.
Hemorragische beroerte heeft hoge sterftecijfers en invaliditeiten. Onlangs is de prevalentie van beroertes in China toegenomen, waardoor het debelangrijkste doodsoorzaak is 1. Hoewel minder gebruikelijk, is intracerebrale bloeding (ICH) aanzienlijk dodelijker dan ischemische beroerte. Studies rapporteren een sterftecijfer van 40% binnen 1 maand na ICH; Bovendien kan ongeveer 75% van de overlevenden 1 jaar later niet zelfstandig wonen2.
De hersenen communiceren met het maag-darmkanaal via verschillende routes, waaronder de nervus vagus, het enterisch zenuwstelsel en het darmmicrobiële metabolisme. De hersen-darmas is een goed erkend en klinisch relevant regulerend systeem3. Het darmslijmvlies reguleert de opname van water, elektrolyten en voedingsstoffen, terwijl het voorkomt dat ziekteverwekkers en toxines in de bloedbaan terechtkomen. ICH kan deze darmbarrière aantasten en gastro-intestinale schade veroorzaken. Barrièredisfunctie draagt op zijn beurt bij aan ondervoeding, immunosuppressie en slechte klinische uitkomsten4. Door ICH veroorzaakte toename van de intestinale permeabiliteit laat schadelijke endogene stoffen in de bloedbaan terecht, wat systemische ontstekingsreacties en het multi-orgaandisfunctie syndroom veroorzaakt. Schade aan het darmslijmvlies na ICH kan er zelfs toe leiden dat darmbacteriën in de bloedbaan transloceren, wat mogelijk kan leiden tot systemische infecties5. Veel patiënten ontwikkelen darmdysmotiliteit, microbiële dysbiose, slijmvliesbloedingen en sepsis. Een eerdere studie toonde aan dat ICH de migratie van darmpathogenen en toxines naar de hersenen veroorzaakte6.
Lansoprazol, een protonpompremmer (PPI), remt de protonpomp onomkeerbaar en vermindert daardoor de afscheiding van maagzuur. Het wordt gebruikt bij de behandeling van maag- en duodenale zweren, erosieve oesofagitis, gastro-oesofageale refluxziekte en niet-steroïde ontstekingsremmende medicatie-geassocieerde maagzweren7. Een eerdere studie gaf aan dat PPI-profylaxe de patiëntuitkomsten bij ischemische beroerte8 negatief beïnvloedde. Andere gepubliceerde studies suggereerden een verband tussen het gebruik van PPI en cognitieve achteruitgang. Een epidemiologisch onderzoek toonde aan dat patiënten die PPI's kregen toegediend een verhoogd risico hadden op het ontwikkelen van dementie en de ziekte van Alzheimer9. Een prospectieve cohortstudie die langdurige PPI-gebruikers vergeleek met niet-gebruikers vond dat PPI-gebruik geassocieerd was met een verhoogd risico op dementie, en de auteurs adviseerden het gebruik van PPI bij risicopatiënten als preventieve maatregel10. De huidige studie werd uitgevoerd om de effecten van lansoprazol op darmbeschadiging te onderzoeken, evenals op korte- en langetermijn neurologische functies (specifiek leren en geheugen) bij muizen met ICH. Wij veronderstellen dat lansoprazol de permeatie van LPS kan remmen door zijn beschermende effecten tegen de darmbarrière, waardoor systemische en neurologische ontstekingen worden verminderd en daarmee de neurologische functie bij ICH-muizen worden verbeterd.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
De experimenten werden uitgevoerd volgens de Gids voor de Zorg en het Gebruik van Laboratoriumdieren van de National Institutes of Health (NIH Publicatie Nr. 8023, herzien 1978). Het protocol werd goedgekeurd door de Ethische Commissie van de Yantai Universiteit (Goedkeuring nr. YTDX20240526). Gevaarlijke stoffen werden afgevoerd volgens institutionele protocollen voor chemisch afval. Figuur 1 illustreert een schematisch diagram van het experimentele ontwerp. De reagentia en de gebruikte apparatuur worden vermeld in de Materiaaltabel.
1. Dierlijke details
Mannelijke CD-1 muizen van 22-25 g werden gehuisvest in een kamer met een licht/donkercyclus van 12/12 uur. De dieren waren vrij om eten en water te krijgen.
2. Voorbereiding van het ICH-muismodel
Het muismodel van ICH werd vastgesteld volgens een eerder rapport11. Kort werden muizen verdoofd met xylazine (10 mg/kg) en ketamine (90 mg/kg), waarna ze in een stereotaxisch kader werden geplaatst. Er werd een klein maalgat geboord bij de rechter coronale hechting (2,2 mm lateraal van de middenlijn, 0,2 mm achter de bregma). Een microspuit werd in de rechterhersenhelft ingebracht op een diepte van 3,5 mm vanaf het schedeloppervlak. Met behulp van een micro-infusiepomp werd bacteriële collagenase (0,075 U in 0,5 μL fosfaatgebufferde zoutoplossing [PBS]) infuseerd met een snelheid van 0,15 μL/min. De naald werd na 5 minuten voorzichtig teruggetrokken. Muizen in de schijngroep ontvingen een gelijkwaardig volume PBS in plaats van collagenase. Het maalgat werd afgesloten met botwas en de hoofdhuidincisie werd gehecht. De lichaamstemperatuur van dieren bleef op 37°C tot het ontwaken gehandhaafd.
3. Experimenteel ontwerp
Mannelijke CD-1 muizen werden willekeurig toegewezen aan drie groepen: sham, model en lansoprazol. Het ICH-model werd vastgesteld zoals hierboven beschreven. Dertig minuten na de inductie van ICH kregen muizen in de lansoprazolgroep lansoprazol in een dosis van 30 mg/kg (de dosis lansoprazol was geselecteerd volgens een eerder rapport12), toegediend eenmaal daags gedurende drie opeenvolgende dagen. Muizen in de schijn- en modelgroepen kregen intraperitoneale injecties van PBS. Drie dagen na ICH werd de kortdurende neurologische functie beoordeeld met behulp van de Garcia-test, voorpootplaatstest en rotarod-test. Op dag 29 na de inductie van ICH werden de nieuwe objectherkennings- en waterdoolhoftests uitgevoerd om de langetermijnfunctie van de neurologische functie te evalueren.
4. Garcia-test
Twee onderzoekers, blind voor de groep, voerden de Garcia-test uit volgens een eerder gerapporteerd protocol13. De neurologische functie werd beoordeeld met een scoresysteem van 0 tot 21. De evaluatie bestaat uit zeven subtests, elk gescoord van 0 tot 3 (0 = slechtste, 3 = beste).
5. Plaatsingstest voor de voorpoot
Na de Garcia-test werd de test voor het plaatsen van de voorpooten uitgevoerd volgens een eerder beschreven methode14. De muizen werden in verticale positie gehouden, parallel aan het tafelblad, waardoor hun vibrissae over het oppervlak kon glijden. De plaatsing van de voorpoten werd waargenomen tijdens 10 opeenvolgende proeven. Het percentage van de plaatsing van de linker voorpoot werd berekend als: Plaatsing van de linker voorledemaat / (Plaatsing van linker voorledemaat + plaatsing van rechter voorledemaat) × 100%.
6. Rotarod-test
Na de plaatsingstest van de voorpoot werden de muizen 3 minuten op een roterende stok op 5 toeren per minuut geplaatst voor training. De stang werd versneld van 5 toeren naar 30 toeren in 4 minuten. De duur die elke muis op de staaf bleef werd gemeten over een periode van 5 minuten, en de ontsnappingslatentie werd15 minuten geregistreerd.
7. Darmpermeabiliteit en hersenoedeem-assay
Na de rotarod-test werden uit elke groep zes muizen willekeurig geselecteerd. Volgens de vorige methode16 werd FITC-dextran intragastrisch toegediend in een dosis van 300 mg/kg. Drie uur later werden de muizen verdoofd met isoflurane en werd bloed verzameld uit de retro-orbitale veneuze plexus, gecentrifugeerd bij 4 °C en 11.000 × g gedurende 5 minuten. Het FITC-dextran-gehalte werd getest met een fluorescentieplaatmeter bij 485 nm excitatie en 528 nm emissiegolflengten. De dieren werden vervolgens onthoofd en de rechterhersenhelft werd verzameld en gewogen om het natte gewicht te bepalen. Het weefsel werd 24 uur gedroogd bij 100 °C om het droge gewicht te bepalen. Het watergehalte in de hersenen (%) werd berekend als: [(Nat gewicht − Droog gewicht) / Nat gewicht] × 100%.
8. Bloed-hersenbarrière (BBB) permeabiliteitsevaluatie
Na de rotarod-test werden uit elke groep zes muizen willekeurig geselecteerd om de BBB-permeabiliteit te evalueren. Een 2% Evans blue-oplossing werd intraperitoneaal toegediend met 4 mL/kg. Drie uur later werden de muizen verdoofd met isoflurane en werd transcardiale perfusie uitgevoerd met PBS. De rechterhersenhelft werd gehomogeniseerd in 50% trichloorazijnzuur in een verhouding van 3:1 (hersenweefsel: trichloorazijnzuur). Het homogenaat werd 20 minuten gecentrifugeerd op 15.000 × g en 4 °C. Vervolgens werd 500 μL van het supernatant gemengd met 500 μL van 70% ethanol en 's nachts geïncubeerd bij 4 °C in het donker. De concentratie van Evans blue werd gemeten bij 610 nm en gekwantificeerd met behulp van een standaardcurve. De gegevens worden gepresenteerd als μg Evans blue per mg hersenweefsel.
9. Histopathologisch onderzoek van de darm en hersenen
Na de rotarod-test werden uit elke groep drie muizen willekeurig geselecteerd. De muizen werden verdoofd met isoflurane. Het jejunum, ileum en de hersenen werden verzameld en vastgesteld in 10% formaldehyde. Weefsels werden gesneden op 5 μm dikte en er werd hematoxyline-eosine (HE) kleuring uitgevoerd. Histopathologisch onderzoek van de darm en hersenen werd uitgevoerd met een microscoop door twee onderzoekers die blind waren voor de groepsopdrachten. Het aantal microglia rondom het hematoom werd in representatieve secties geteld. Celtellingen werden uitgevoerd in vijf willekeurige gezichtsvelden verspreid over drie secties per dier.
10. Meting van LPS en IL-1β
Na de rotarod-test werden uit elke groep zes muizen willekeurig geselecteerd. De muizen werden verdoofd met isofluraan en er werd bloed verzameld. Bloedmonsters werden 10 minuten gecentrifugeerd op 5.000 × g en 4 °C, en er werd serum verzameld. De rechterhersenhelft werd geoogst en hersenhomogenaten werden bereid in een verhouding van 1:3 (hersengewicht in gram tot PBS-volume in milliliter). De homogenaten werden gecentrifugeerd op 12.000 × g en 4 °C gedurende 10 minuten. De eiwitconcentraties in het supernatant werden bepaald met behulp van een BCA-kit. De niveaus van LPS en IL-1β in zowel serum als hersenhomogenaat werden gemeten met ELISA-kits, volgens de instructies van de fabrikant.
11. Transmissie-elektronenmicroscopie
Voor elektronenmicroscopisch onderzoek werden na de rotarodtest drie dieren uit elke groep willekeurig geselecteerd. De muizen werden verdoofd met isofluraan en ondergingen transcardiale perfusie met 2% glutaraldehyde en 2,5% paraformaldehyde in 0,1 M PBS (volgens institutioneel goedgekeurde protocollen). De hersenen, het jejunum en het ileum werden vervolgens geoogst en 's nachts in 2% glutaraldehyde geplaatst in een 0,1 M cacodylaatbuffer (pH 7,4) bij 4 °C. De monsters werden vervolgens overgebracht op 1% osmiumtetroxide gedurende 1 uur bij kamertemperatuur. Weefsels werden in ultradunne secties gesneden (50 nm). Na dehydratie werden de secties gekleurd met uranylacetaat en loodcitraat voor observatie onder een transmissie-elektronenmicroscoop. Alle secties werden op een blinde manier geëvalueerd en gefotografeerd met een transmissie-elektronenmicroscoop.
12. Nieuwe objectherkenning
29 dagen na ICH-modellering werd de nieuwe objectherkenningstest uitgevoerd om de leer- en geheugenfunctie van muizen te beoordelen. Op de eerste dag werden er geen objecten in het apparaat geplaatst (lengte: 40 cm, breedte: 40 cm, hoogte: 40 cm), waardoor de muizen 5 minuten vrij konden verkennen. Op de tweede dag werden twee identieke voorwerpen in het apparaat geplaatst, en mochten de muizen ze 5 minuten verkennen. Vierentwintig uur later werd een van de objecten vervangen door een nieuw object. De muizen verkenden de twee objecten opnieuw vijf minuten. De verkenningstijd werd geregistreerd wanneer de neus van de muis een object raakte of wanneer zijn kop op een afstand van 1 cm naar het object gericht was. De tijd die werd besteed aan het verkennen van het nieuwe object werd gemeten en berekend. Een langere verkenningstijd van het nieuwe object duidt op een beter leer- en geheugenvermogen.
13. Morris waterdoolhof
32 dagen na ICH-modellering werden leer- en geheugenfuncties beoordeeld met behulp van het Morris waterdoolhof. Het apparaat bestond uit een cirkelvormig bassin (diameter: 100 cm, hoogte: 40 cm) gevuld met water (diepte: 25 cm) en gehandhaafd op 22 °C ± 1 °C. Een ontsnappingsplatform (diameter: 9 cm) werd 1 cm onder het wateroppervlak ondergedompeld. In de navigatietest ondergingen muizen vier proeven per dag. De tijd die nodig was om het platform te vinden werd geregistreerd als de ontsnappingslatentie. Muizen die het platform binnen 60 seconden niet konden vinden, werden er voorzichtig naartoe geleid. Op de vijfde dag werd een 60-s probe-test uitgevoerd. De geheugenfunctie werd geëvalueerd door de ontsnappingslatentie, het aantal overgangen van het platform en de tijd die in het doelkwadrant werd doorgebracht, vast te leggen. De gegevens werden geanalyseerd met behulp van Video Tracking Software.
14. Statistische analyse
De gegevens werden geanalyseerd met GraphPad Prism software versie 7.0. De resultaten worden gepresenteerd als gemiddelde ± standaarddeviatie. De Shapiro-Wilk-test werd gebruikt om te beoordelen of gegevens van elke groep een normale verdeling volgden. Verschillen tussen groepen werden geanalyseerd met eenrichtings-ANOVA, gevolgd door Tukey's post hoc-test. Voor niet-parametrische vergelijkingen werd de Kruskal-Wallis-test gevolgd door Dunn's test gebruikt. Een p-waarde van <0,05 werd als statistisch significant beschouwd.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Effecten van lansoprazol op kortdurende neurologische functie bij ICH-muizen
In vergelijking met de nepgroep lieten muizen in de ICH-groep significant lagere scores zien in de Garcia-test (p < 0,01). Muizen in de lansoprazolgroep vertoonden echter geen verbeterde Garcia-scores vergeleken met de ICH-groep (p > 0,05) (Figuur 2A). Evenzo was het percentage plaat...
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Darmbeschadiging is een veelvoorkomende complicatie bij patiënten met ICH. Door ICH veroorzaakte darmbeschadiging kan leiden tot ondervoeding, langdurige ziekenhuisopnames, slechte uitkomsten en zelfs sterfte17. Met behulp van een ICH-diermodel toonde deze studie voor het eerst aan dat lansoprazol darmbeschadiging bij ICH-muizen vermindert. Hoewel lansoprazol geen gunstige effecten op de kortetermijn neurologische functie toonde, verbeterde het de langetermijnresu...
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
De auteurs verklaren dat zij geen belangenconflicten hebben.
Wij danken Angela Morben van Liwen Bianji (Edanz) (www.liwenbianji.cn/) voor het redigeren van de Engelse tekst van een concept van dit manuscript. De huidige studie werd ondersteund door subsidies van het Taishan Scholar Funding Project van de provincie Shandong.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
| Naam | Bedrijf | Catalogusnummer | Opmerkingen |
|---|---|---|---|
| BCA kit | Beyotime Biotechnology | P0009 | |
| Collagenase | Sigma-Aldrich | 128M4107v | |
| Evans blue dye | Sigma-Aldrich | MKCG7507 | |
| FITC-dextran | Sigma-Aldrich | 46944 | |
| GraphPad Prism 7.0 | GraphPad statistical Software, Boston, MA, USA, www.graphpad.com | Prism 7.0 | |
| Lansoprazole | Shandong Yuxin pharmaceutical Co., Ltd. | 524093053 | |
| LPS ELISA kit | Cusabio biotech Co., Ltd. | M25036407 | |
| Mice | Jinan Pengyue Experimental Animal Breeding Co., Ltd. | SCXK20220006 | |
| Microinfusion pump | World Precision Instruments | Micro 3 | |
| Microsyringe | Hamilton Company | SYR 10 μL | |
| Olympus microscope | Olympus Co., Ltd. | IX-70 | |
| Rotarod | Panlab Co., Ltd. | LE8205 | |
| Stereotaxic frame | Kopf Instruments | Model 902-A | |
| TNF-α ELISA kit | Beyotime Biotechnology | PI301 | |
| Transmission electron microscope | JEOL Ltd. | JEM-100SX | |
| Video Tracking Software | Panlab Co., Ltd. | Smart 3.0 |
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken
Toestemming aanvragen