Methodenartikel

Karakterisering van door adipocyten afgeleide extracellulaire vesikelsecretie met behulp van een CD63-GFP Reporter Mouse Model in vivo en in vitro

DOI:

10.3791/69670

⸱

5 december 2025

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Medicine, Albert Einstein College of Medicine, 2Fleischer Institute for Diabetes and Metabolism, Albert Einstein College of Medicine, 3Department of Molecular Pharmacology, Albert Einstein College of Medicine, 4Department of Microbiology and Immunology, Albert Einstein College of Medicine, 5Division of Infectious Diseases, Department of Medicine, Albert Einstein College of Medicine, 6Department of Developmental and Molecular Biology, Albert Einstein College of Medicine

In dit artikel

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Het protocol gebruikt een adipocyt-specifieke CD63-GFP reportermuislijn om de secretie van adipocyten-afgeleide extracellulaire blaasjes (EV's) te visualiseren en te kwantificeren en hun opname door voorlopercellen aan te tonen, waarmee een paracriene route in vetweefsel wordt onthuld.

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Adipocyten worden steeds vaker erkend als actieve endocriene cellen die aanzienlijke hoeveelheden EV's afscheiden, verrijkt aan eiwitten, lipiden en nucleïnezuren. De mechanismen die EV-secretie en de dynamiek van EV-afgifte in verschillende biologische contexten regelen, zijn echter niet volledig begrepen. Om deze kloof te dichten, hebben we een nieuwe adipocyten-specifieke CD63-GFP rapportage muislijn gegenereerd, waarin de expressie van GFP-gelabelde CD63 wordt aangestuurd door de Adiponectine-promotor, waardoor selectieve etikettering en tracking van AdEV's in vivo mogelijk is. Met dit reportermodel onderzochten we de secretie van AdEV's en hun aflevering aan APC's binnen vetweefsel. Confocale beeldvorming en flowcytometrie toonden aan dat AdEV's actief worden ingenomen door APC's, wat een eerder ondergewaardeerd mechanisme van paracriene communicatie binnen de vetmicro-omgeving benadrukt.

Als aanvulling op de in vivo studies werd een in vitro systeem opgezet, waarmee directe monitoring van EV-secretie van gedifferentieerde adipocyten mogelijk is. APC's werden geïsoleerd uit subcutane witte vetweefsels van de meldmuizen en geïnduceerd om te differentiëren tot rijpe adipocyten. In deze cellen werden CD63-GFP-signalen waargenomen als discrete puncta en werden ze verrijkt aan het plasmamembraan wanneer EV-secretie werd geremd, wat consistent is met de ophoping van blaasjes bij geblokkeerde afgifte. Onder normale groeiomstandigheden werden EV's die in het kweekmedium werden afgescheiden geconcentreerd en vervolgens gezuiverd met behulp van grootte-uitsluitingschromatografie, waardoor downstream functionele en biochemische analyses mogelijk werden.

Dit platform kan worden toegepast op APC's afkomstig van andere adiposdepots, zoals epididymale witte en bruine adiposeweefsel, of door ze te differentiëren in depot-specifieke adipocyten, waardoor EV-secretie tussen verschillende adipocyttypen vergelijking mogelijk wordt.

Samen introduceren deze benaderingen een robuust genetisch hulpmiddel en een complementair in vitro-systeem om de dynamiek van AdEV-secretie en -targeting te analyseren. Deze ontwikkelingen werpen licht op intra-adipos cellulaire communicatie en leggen de basis voor het begrijpen van de bredere metabole invloed van AdEV's op gezondheid en ziekte.

Inleiding

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Vetweefsel wordt steeds meer erkend als een dynamisch endocrien orgaan met sleutelrollen in de homeostase van de energievan het hele lichaam 1,2,3,4,5. Naast de klassieke functie als lipidenopslag reguleren adipocyten de systemische insulinegevoeligheid, en verstoringen in vetmassa – of het nu overschot of tekort is – worden in verband gebracht met insulineresistentie en metabole ziekten 6,7,8,9. Een mechanisme dat wordt voorgesteld om bij te dragen aan deze regulerende capaciteit is intercellulaire communicatie via gescheiden factoren. Hoewel adipokines goed zijn gevestigd als belangrijke endocriene signalen van vetweefsel 10,11,12,13,14,15,16,17,18, geven adipocyten ook een aanzienlijk aantal extracellulaire vesikels (EV's) af, membraangebonden deeltjes met lipiden, eiwitten, nucleïnezuren en metabolieten. Of adipocyten-uitgescheiden EV's (AdEV's) ook glycanen dragen, net als andere soorten EV's, is nog onduidelijk 19,20,21,22,23,24. Adipocyten zijn bewezen een belangrijke bron van EV's te zijn, aangezien ongeveer 80% circulerende exosomale microRNA's afkomstig zijn van adipocyten in muismodellen, zoals aangetoond met adipocyt-specifieke Dicer knockout-muizen onder basisvoorwaarden25. De rollen van AdEV's in metabolisme, ontsteking, insulinegevoeligheid en adipogenese zijn gerapporteerd, maar zijn nog steeds onvolledig begrepen 26,27,28,29. Andere mogelijke functies, met name bij het bemiddelen van overspraak met andere celtypen en organen, zijn nog grotendeels onbekend. Overvloedvan 26 EV's suggereert dat ze een belangrijke rol kunnen spelen in zowel lokale als systemische signalering, maar de biologische betekenis en werkingsmechanismen van AdEV's zijn grotendeels onontkend. Deze kenniskloof benadrukt de noodzaak van robuuste en gespecialiseerde methoden om AdEV-secretie en -functie te bestuderen.

Om deze kloof te dichten, hebben we adipocyt-specifieke CD63-GFP-muizen (AdipCD63-GFP) gegenereerd door Adiponectin-Cre-muizen te kruisen met Stopfl/fl/CD63-GFP-muizen (stam#:036865, JAX). Stopfl/fl/CD63-GFP nestgenoten, die CD63-GFP niet uitdrukten bij afwezigheid van Cre, werden als controles gebruikt. De CD63-GFP rapportagestamm is met succes gebruikt om celtype-specifieke EV's in vivo te traceren, waaronder endotheel- en neuron-afgeleide EV's30,31. Omdat Adiponectine alleen tot expressie komt in volwassen adipocyten en niet in adipocyten-voorlopercellen (APCs)32,33, en CD63 een marker is van EVs34, kunnen de GFP+ EVs die in circulatie en weefsels worden gedetecteerd specifiek worden geïdentificeerd als AdEVs. Daarom worden GFP+ EV's die in APC's worden gedetecteerd in deze studie geïnterpreteerd als AdEV's die door deze voorlopercellen zijn opgenomen. Dit rapportagesysteem maakt directe monitoring mogelijk van blaasafgifte en potentiële doelinteracties in vivo en in vitro, waardoor ADEV's in andere celtypen vetweefsel bestudeerd kunnen worden. Belangrijk is dat AdEV's bijzonder vetrijk zijn vergeleken met EV's van andere celtypen, waardoor ze drijvender, fragieler en moeilijker te herstellen zijn met traditionele ultracentrifugatiemethoden. Hoge centrifugale krachten kunnen deze blaasjes beschadigen of leiden tot aanzienlijk monsterverlies en verontreiniging, wat de analyse stroomafwaarts bemoeilijkt. Om deze beperkingen te overwinnen, hebben we een workflow geoptimaliseerd die meerdere centrifugatiestappen met lage snelheid combineert met grootte-uitsluitingschromatografie, die schuifspanning minimaliseert, de integriteit van de vesikels behoudt en zuiverheid en opbrengst verbetert, waardoor nauwkeurige kwantificatie en functionele studies mogelijk zijn. Samen bieden het CD63-GFP-systeem en deze geoptimaliseerde isolatiepijplijn een toegankelijke en reproduceerbare benadering voor het onderzoeken van AdEV-secretie en functie in vetweefsel-crosstalk en systemische metabole regulatie.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

In overeenstemming met de richtlijnen voor dierenverzorging en gebruik van het Albert Einstein College of Medicine werden mannelijke muizen gegroepeerd op 22 °C met 30-70% relatieve luchtvochtigheid tijdens een 12 uur licht/12 uur donkercyclus, werden ze ad libitum toegang tot voedsel en water geboden en werden ze onderhouden op een C57BL/6J-achtergrond.

1. In vivo detectie van afgescheiden AdEV's door opname door APC's

  1. Buffervoorbereiding
    1. Spijsverteringsbuffer: Bereid HEPES-gebufferde DMEM door 0,5 mL 1 M HEPES en 0,5 g vetzuurarme rundereserumalbumine (BSA) toe te voegen aan 50 mL DMEM. Meng tot het opgelost is.
    2. Wasbuffer: Bereid PBS voor met 2,5 mM ethyleendiaminetetraazijnzuur (EDTA) en 4% fotaal rundserum (FBS).
    3. Bereid Liberase en DNase 1 bouillon voor op 5 mg/mL en 5 KU/mL. Bewaar op -20 °C. Ontdooi direct voor gebruik.
  2. Inguinaal vetweefselverzameling en vertering
    OPMERKING: Vier maanden oude AdipCD63-GFP en CD63-GFP controlemuizen werden geëuthanaseerd via kooldioxide-inhalatie.
    1. Exceer vetweefsel met een steriele techniek en doe 1 g weefsel in 0,5 mL verteringsbuffer, en fijnhakken het weefsel fijn met steriele schaar in stukjes van maximaal 1 mm.
    2. Suspendeer het gemalen weefsel in 10 mL verteerde buffer met 0,5 mg/mL Liberase en 50 U/mL DNase 1.
    3. Incubeer bij 37 °C op een orbitale shaker (100 rpm) gedurende 30-60 minuten. Meng het weefsel voorzichtig door de buis een paar keer om te draaien tijdens de incubatie. Wanneer de oplossing troebel lijkt en er geen zichtbare weefselfragmenten meer achterblijven, wordt de vertering als voltooid beschouwd.
  3. Isolatie van APC's
    1. Verdun de suspensie met twee volumes van de verteringsbuffer en keer de buis voorzichtig 3-4 keer om.
    2. Laat het door een steriel 100 μm-filter om onverteerd weefsel te verwijderen.
    3. Centrifugeer het filtraat op 300 × g gedurende 5 minuten bij 4 °C.
    4. Verwijder het supernatante adipocytendeel en label de pellet als de stromale vasculaire fractie (SVF).
    5. Bereid verse 1× rode bloedcellen (RBC) lysisbuffer voor met steriel water. Lys de rode bloedcellen in de SVF door 5 minuten op ijs te incuberen, beschermd tegen licht.
    6. Voeg twee volumes wash buffer toe en centrifuge-filtratie op 400 × g gedurende 5 minuten bij 4 °C.
    7. Volg het protocol voor de adiposeweefselprogenitor-isolatiekit (muis), en plaats de SVF opnieuw in een buffer van 80 μL (PBS, pH 7,2, 0,5% BSA, 2 mM EDTA) per gram weefsel.
    8. Voeg 20 μL niet-adipocyt progenitor-depletionscocktail toe per gram weefsel.
    9. Meng en laat het 15 minuten incuberen op 2-8 °C in het donker.
    10. Laat het monster door de LS-kolom lopen en verzamel de doorstroom.
    11. Centrifugeer de doorstroming (negatief voor CD31, CD45, Ter119) op 300 × g gedurende 5 minuten bij 4 °C om de APC's voor het onderzoek te verkrijgen.
  4. Detectie van afgescheiden AdEV's door APC-opname met confocale microscopie
    1. Zaad: 250 μL geïsoleerde APC's (1 × 104 cellen/mL) van AdipCD63-GFP of CD63-GFP muizen op collageengecoate 8-put kamerglaasjes en laten cellen ongeveer 6 uur hechten.
    2. Fixeer de cellen met 4% paraformaldehyde gedurende 10 minuten om cellulaire en EV-structuren te behouden voor beeldvorming.
      OPMERKING: In deze assays markeren GFP-signalen AdEV's, en hun detectie binnen APC's door confocale microscopie duidt op opname van AdEV's door deze voorlopercellen.
    3. Was de dia's drie keer met PBS, monteer ze met antifade-medium en vang GFP-signalen met een confocale microscoop uitgerust met een 63× olie-onderdompelingsobjectief. Beelden verkrijgen als z-serie stapels met een stapgrootte van 0,5 μm, met een 488 nm laser voor GFP-excitatie en het detecteren van emissie bij 500-550 nm.
  5. Detectie van afgescheiden AdEV's door APC-opname door flowcytometrie
    1. Tel APC's en verdun levensvatbaarheidskleurstof (bijv. Zombie) 1:1000 in 1X PBS. Suspendeer cellen op 1 × 106 per 100 μL. Incubeer 20 minuten op ijs, beschermd tegen licht.
    2. Was cellen één keer met wasput. Centrifugeer op 300 × g gedurende 5 minuten op 4 °C.
    3. Suspendeer cellen in een briljante kleuringsbuffer bij 1 × 106 cellen per 100 μL.
    4. Blok niet-specifieke binding met een Fc-receptorblokkerend reagens (bijv. anti-CD16/CD32) 1:100 op ijs gedurende 10 minuten.
    5. Pre-spin Sca-1 antilichaam bij 6.000 × g gedurende 10 minuten bij 4 °C. Voeg vervolgens 1 μL van het Sca-1-antilichaam toe aan de APC-buis en incubeer 20 minuten op ijs, waarbij de buis bedekt blijft met folie.
    6. Was twee keer met 1 ml wasbuffer, centrifugeer op 300 × g gedurende 5 minuten bij 4 °C.
    7. Suspendeer cellen in een wasbuffer bij ongeveer 1 × 10à 6 cellen per 500 μL voor flowcytometrie-sortering. Verzamel gegevens voor Sca1+ en GFP+ cellen op een spectrale flowcytometer uitgerust met een 405 nm violette laser (450/50 nm filter voor Pacific Blue) en een 488 nm blauwe laser (530/30 nm filter voor GFP). Analyseer de monsters met behulp van de draaiende software van het instrument, met Sca1+- cellen gegated, en de GFP+- subset binnen deze populatie geanalyseerd, zoals weergegeven in Figuur 2.

2. Detectie en analyse van de afgescheiden AdEV's in vitro

  1. Differentiatie van APC's tot volwassen adipocyten
    OPMERKING: Alle culturen worden gehandhaafd op 37 °C, 8% CO2 tenzij anders vermeld.
    1. Dag 0: Bedek schalen met 0,2% gelatine gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur (RT), aspireer en zaad vers geïsoleerde APC's in DMEM/F12 + 15% FBS + 1% penicilline/streptomycine (P/S) + 0,1% primocin om 100% confluentie te bereiken vóór de differentiatie.
    2. Dag 1-8: Vervang met MesenCult adipogene differentiatiemedium (50 mL totaal: 45 mL base + 5 mL supplement + 0,5 mL GlutaMAX + 50 μL Primocin), wissel op dag 4 naar een nieuw differentiatiemedium.
    3. Dag 9: Adipocyten twee keer wassen met PBS, daarna vervangen door een rijp adipocytkweekmedium (DMEM +1% BSA + 0,2% Primocin) en 16 uur onderhouden.
  2. AdEV-isolatie en zuivering
    1. Laat 15 mL adipocytenkweek die hierboven is gegenereerd, eerst door een 40 μm-filter en daarna een 30 μm-filter.
    2. Centrifugeer het filtraat op 500 × g gedurende 5 minuten, daarna 2.000 × g gedurende 10 minuten om resterende cellen en afval te verwijderen.
    3. Laat het filtraat door een 0,8 μm filter lopen en concentreer het medium vervolgens van 15 mL tot 0,5 mL met een 100 kDa cutoff ultrafiltratie-eenheid (15 mL monstervolume) door te centrifugeren op 4.000 × g gedurende 15 minuten.
    4. Laad het monster op de grootte-uitsluitingschromatografie (SEC) kolommen met een automatische fractieverzamelaar en verzamel fracties F1-8.
    5. Concentreer de verzamelde EV-fracties met een 100 kDa cutoff ultrafiltratie-eenheid (4 mL monstervolume) en ga door tot verificatie van het EV-gehalte van elke fractie met western blot, een nanoparticle tracking analyse-instrument en transmissie-elektronenmicroscopie (TEM).
  3. AdEV-validatie, kwantificering en beoordeling van grootte/morfologie
    1. Western blot-analyse van EV-markers
      1. Concentreer elke fractie van 400 μL tot 25 μL, voeg vervolgens 50 μL radioimmunoprecipitatie-assay (RIPA) buffer toe, aangevuld met protease- en fosfataseremmers. Denatureer de monsters door 2× natriumdodecylsulfaat (SDS) laadbuffer toe te voegen en eiwitten op te lossen op een 4-12% tris-glycine gel.
    2. Analyse van EV-grootte, concentratie en kwaliteit met behulp van een nanodeeltjestracking-analyse-instrument.
      1. Verdun vóór de analyse de EV-monsters met steriele, 0,1 μm gefilterde PBS in een verhouding van 1:1000, zodat de deeltjesconcentratie binnen het optimale detectiebereik valt (ongeveer 107-10 deeltjes van 9 deeltjes/mL). Meng de verdunde monsters voorzichtig om bubbelvorming te voorkomen.
      2. Laad het monster in het instrument dat is uitgerust met een hooggevoelige wetenschappelijke complementaire metaaloxide-halfgeleider (sCMOS) camera, een 532 nm groene lasermodule en een detectiedrempel van 10 nm (tot 1.000 nm)/106 tot 109 deeltjes/mL.
      3. Voer beeldvorming en kwantificatie uit met behulp van de NS Xplorer-softwaresuite, die een dynamisch concentratiealgoritme op basis van observatievolumes toepast.
    3. Onderzoek van EV-morfologie met transmissie-elektronenmicroscopie (TEM)
      1. Stuur 50 μL EV's, verzameld vóór concentratie, in bij de kernfaciliteit voor negatieve kleuring van EV's. Breng EV's toe op koolstof-only koperen roosters van 400 mesh die met plasma zijn gereinigd met een plasmareiniger.
      2. Na een korte adsorptie spoel je de roosters af met gedestilleerd water, kleur je negatief met 1% (met v/v) uranylacetaat en verwijder je overtollige vlek met filterpapier voordat je aan de lucht laat drogen. Vervolgens beelden de roosters met een transmissie-elektronenmicroscoop die werkt op 120 kV.

3. Veiligheid en afvalinformatie

  1. Behandel paraformaldehyde en uranylacetaat in een dampkap met persoonlijke beschermingsmiddelen (PBM), omdat beide giftig zijn. Verzamel uranylacetaatafval in gelabelde gevaarlijke containers.
  2. Behandel alle biologische monsters als mogelijk besmettelijk en voer materialen af volgens institutionele bioveiligheidsbeleid en protocollen die zijn goedgekeurd door het Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Met dit protocol van AdEV-detectie via APC-opname met confocale microscopie isoleerden we APC's uit het inguinale vetweefsel van AdipCD63-GFP en Stopfl/fl/CD63-GFP-muizen en kleurden ze met DAPI voor visualisatie van de kernen. Bij onderzoek met confocale microscopie toonden APC's van Stopfl/fl/CD63-GFP-muizen geen detecteerbare GFP puncta (Figuur 1A). Daarentegen vertoonden APC's geïsoleerd van AdipCD63-GFP-muizen talrijke onderscheidende GFP-puncta door het hele cytop...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Het beschreven protocol vult een belangrijk methodologisch leemte door een robuust en reproduceerbaar systeem te bieden om AdEV's en hun opname door APC's te isoleren en te karakteriseren. In vergelijking met EV's van andere bronnen zijn AdEV's meer lipidenrijk en drijfver, waardoor de klassieke ultracentrifugatie-gebaseerde EV-isolatietechniekenminder efficiënt zijn. De meeste gepubliceerde protocollen voor AdEV-zuivering zijn echter nog steeds afhankelijk van ul...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De auteurs hebben geen financieel belang om te verklaren.

Dankbetuigingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wij danken de Einstein Flow Cytometry Core voor FACS, en de Analytical Imaging Facility voor alle beeldanalyse. Dit werk werd deels ondersteund door subsidies van de National Institutes of Health DK128839 en NCI cancer center support grant P30CA013330.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
0.5 M EDTA, pH 8.0FisherAM9260G500x verdunning
10x PBSFisher Scientific70-013-0321000x verdunning met water
1 M HEPESGibco156300801000x verdunning
Adipose Tissue Progenitor Isolation Kit, mouseMiltenyi biotec30-106-639Klaar voor gebruik
Amicon Ultra Centrifugal Filter, 100 kDa MWCOSigmaUFC910015 mL monstervolume
Amicon Ultra Centrifugal Filter, 100 kDa MWCOSigmaUFC91004 mL monstervolume
BSASigmaA6003Klaar voor gebruik
Calnexin antibodycalnexinab225951000x verdunning
CD63 antibodyabcamab217345500x verdunning
CD81cell signaling Technology10037s500x verdunning
Corning BioCoat Collagen I Culture SlideSigmaCLS354630Klaar voor gebruik
Corning cell strainerSigmaCLS43175040 μm poriegrootte
Corning cell strainerSigmaCLS431752100 μm poriegrootte
COX IV antibodyCell Signaling Technology48441000x verdunning
DMEMGibco11965092Klaar voor gebruik
DMEM/F-12, GlutaMAX supplementThermofisher10565018Klaar voor gebruik
Dnase 1SigmaD4513Stock 5 KU/mL bij -20 °C
GlutaMAX SupplementGibco35050061100x verdunning
Halt™ Protease and Phosphatase Inhibitor Cocktail (100X)Thermofisher78444Klaar voor gebruik
HSP70 antibodyabcamab1816061000x verdunning
Invitrogen eBioscience 10X RBC Lysis Buffer (Multi-species)Fisher Scientific50-112-974310x verdunning in water
Izon Science Usa Ltd QEVORIGINAL 70NMGEN2 5/PK SDPFisher ScientificNC2042225Klaar voor gebruik
LEICA STELLARIS 8 confocal microscopeLeica MicroscopesN/A
Liberase TM Research GradeSigmaLIBTM-ROStock 5 mg/mL bij -20 °C
Millex MCE syringe filterSigmaSLAA0250.8 μm poriegrootte
NanoSight ProMalvern PanalyticalN/A
Novex Tris-Glycine Mini Protein Gels, 4–12%,ThermofisherXP04120BOXKlaar voor gebruik
Novex Tris-Glycine SDS Sample Buffer (2x)ThermofisherLC2676Klaar voor gebruik
Pacific Blue anti-mouse Ly-6A/E (Sca-1) AntibodyBioLegend10811925x verdunning
Paraformaldehyde solution (16%)Fisher Scientific50-980-487Verdun tot 4% met PBS
pluriStrainer S / 30 µm (Cell Strainer)Fisher ScientificNC092245930 μm poriegrootte
Ponceau S solutionSigmaP7170-1LKlaar voor gebruik
PrimocinInvivogenNC9141851500x verdunning
ProLong Gold Antifade Reagent with DAPICell Signaling Technology8961SKlaar voor gebruik
Purified anti-mouse CD16/32 AntibodyBioLegend101301100x verdunning
RIPA buffer Fisher ScientificPI8990010x verdunning in water
Spectral flow cytometer (Aurora 3)Cytek BiosciencesN/A
Syntaxin 4 antibodySynaptic Systems1100425000x verdunning
Tecnai 20 (Transmission Electron Microscope)FEIN/A
Tergeo-EMPIE Scientific LLCN/A
Vinculin antibodyabcamab185085000x verdunning

Referenties

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Kershaw, E. E., Flier, J. S. Adipose tissue as an endocrine organ. J Clin Endocrinol Metab. 89 (3), 2548-2556 (2004).
  2. Wu, J., et al. Beige adipocytes are a distinct type of thermogenic fat cell in mouse and human. Cell. 150 (2), 366-376 (2012).
  3. Luo, L., Liu, M. Adipose tissue in control of metabolism. J Endocrinol. 231 (3), R77-R99 (2016).
  4. Lynes, M. D., et al. The cold-induced lipokine 12,13-diHOME promotes fatty acid transport into brown adipose tissue. Nat Med. 23, 631-637 (2017).
  5. Sakers, A., De Siqueira, M. K., Seale, P., Villanueva, C. J. Adipose-tissue plasticity in health and disease. Cell. 185 (3), 419-446 (2022).
  6. Santoro, A., McGraw, T. E., Kahn, B. B. Insulin action in adipocytes, adipose remodeling, and systemic effects. Cell Metab. 33 (4), 748-757 (2021).
  7. Czech, M. P. Mechanisms of insulin resistance related to white, beige, and brown adipocytes. Mol Metab. 34, 27-42 (2020).
  8. Kahn, S. E., Hull, R. L., Utzschneider, K. M. Mechanisms linking obesity to insulin resistance and type 2 diabetes. Nature. 444, 840-846 (2006).
  9. Feng, D., et al. SNAP23 regulates BAX-dependent adipocyte programmed cell death independently of canonical macroautophagy. J Clin Invest. 128 (9), 3941-3956 (2018).
  10. Ouchi, N., Parker, J. L., Lugus, J. J., Walsh, K. Adipokines in inflammation and metabolic disease. Nat Rev Immunol. 11, 85-97 (2011).
  11. Zhang, Y., et al. Positional cloning of the mouse obese gene and its human homologue. Nature. 372, 425-432 (1994).
  12. Scherer, P. E., Williams, S., Fogliano, M., Baldini, G., Lodish, H. F. A novel serum protein similar to C1q, produced exclusively in adipocytes. J Biol Chem. 270 (45), 26746-26749 (1995).
  13. Considine, R. V., et al. Serum immunoreactive-leptin concentrations in normal-weight and obese humans. N Engl J Med. 334, 292-295 (1996).
  14. Hotamisligil, G. S., Shargill, N. S., Spiegelman, B. M. Adipose expression of tumor necrosis factor-alpha: Direct role in obesity-linked insulin resistance. Science. 259 (5091), 87-91 (1993).
  15. Steppan, C. M., et al. The hormone resistin links obesity to diabetes. Nature. 409, 307-312 (2001).
  16. Yang, Q., et al. Serum retinol binding protein 4 contributes to insulin resistance in obesity and type 2 diabetes. Nature. 436, 356-362 (2005).
  17. Tilg, H., et al. Adipokines: Masterminds of metabolic inflammation. Nat Rev Immunol. 25, 250-265 (2025).
  18. Clemente-Suarez, V. J., et al. The role of adipokines in health and disease. Biomedicines. 11 (5), 1290(2023).
  19. Hallal, S., et al. Understanding the extracellular vesicle surface for clinical molecular biology. J Extracell Vesicles. 11 (10), e12260(2022).
  20. Welsh, J. A., et al. Minimal information for studies of extracellular vesicles (MISEV2023): From basic to advanced approaches. J Extracell Vesicles. 13 (2), e12404(2024).
  21. Le Lay, S., Scherer, P. E. Exploring adipose tissue-derived extracellular vesicles in inter-organ crosstalk: Implications for metabolic regulation and adipose tissue function. Cell Rep. 44 (6), 115732(2025).
  22. Shimoda, A., et al. Exosome surface glycans reflect osteogenic differentiation of mesenchymal stem cells: Profiling by an evanescent field fluorescence-assisted lectin array system. Sci Rep. 9, 11497(2019).
  23. Albuquerque, P. C., et al. A Paracoccidioides brasiliensis glycan shares serologic and functional properties with cryptococcal glucuronoxylomannan. Fungal Genet Biol. 49 (11), 943-954 (2012).
  24. Li, Y., Tang, X., Gu, Y., Zhou, G. Adipocyte-derived extracellular vesicles: Small vesicles with big impact. Front Biosci (Landmark Ed). 28 (7), 149(2023).
  25. Thomou, T., et al. Adipose-derived circulating miRNAs regulate gene expression in other tissues. Nature. 542, 450-455 (2017).
  26. Crewe, C., et al. An endothelial-to-adipocyte extracellular vesicle axis governed by metabolic state. Cell. 175 (3), 695-708.e13 (2018).
  27. Flaherty, S. E. 3rd, et al. A lipase-independent pathway of lipid release and immune modulation by adipocytes. Science. 363 (6430), 989-993 (2019).
  28. Clement, E., et al. Adipocyte extracellular vesicles carry enzymes and fatty acids that stimulate mitochondrial metabolism and remodeling in tumor cells. EMBO J. 39, e102525(2020).
  29. Kulaj, K., et al. Adipocyte-derived extracellular vesicles increase insulin secretion through transport of insulinotropic protein cargo. Nat Commun. 14, 709(2023).
  30. McCann, J. V., et al. Reporter mice for isolating and auditing cell type-specific extracellular vesicles in vivo. Genesis. 58 (7), e23369(2020).
  31. Men, Y., et al. Exosome reporter mice reveal the involvement of exosomes in mediating neuron to astroglia communication in the CNS. Nat Commun. 10, 4136(2019).
  32. Jeffery, E., et al. Characterization of Cre recombinase models for the study of adipose tissue. Adipocyte. 3 (3), 206-211 (2014).
  33. Emont, M. P., et al. A single-cell atlas of human and mouse white adipose tissue. Nature. 603, 926-933 (2022).
  34. Krylova, S. V., Feng, D. The machinery of exosomes: Biogenesis, release, and uptake. Int J Mol Sci. 24 (2), (2023).
  35. Crewe, C. The challenges of interrogating adipose tissue extracellular vesicle functions in physiology. Commun Biol. 5, 581(2022).
  36. Blandin, A., et al. Lipidomic analysis of adipose-derived extracellular vesicles reveals specific EV lipid sorting informative of the obesity metabolic state. Cell Rep. 42 (3), 112169(2023).
  37. Matilainen, J., et al. Increased secretion of adipocyte-derived extracellular vesicles is associated with adipose tissue inflammation and the mobilization of excess lipid in human obesity. J Transl Med. 22, 623(2024).
  38. Thery, C., et al. Minimal information for studies of extracellular vesicles 2018 (MISEV2018): A position statement of the International Society for Extracellular Vesicles and update of the MISEV2014 guidelines. J Extracell Vesicles. 7 (1), 1535750(2018).
  39. Olson, A. L., Knight, J. B., Pessin, J. E. Syntaxin 4, VAMP2, and/or VAMP3/cellubrevin are functional target membrane and vesicle SNAP receptors for insulin-stimulated GLUT4 translocation in adipocytes. Mol Cell Biol. 17 (5), 2425-2435 (1997).
  40. Oh, E., Miller, R. A., Thurmond, D. C. Syntaxin 4 overexpression ameliorates effects of aging and high-fat diet on glucose control and extends lifespan. Cell Metab. 22 (3), 499-507 (2015).
  41. Merz, K. E., et al. Enrichment of the exocytosis protein STX4 in skeletal muscle remediates peripheral insulin resistance and alters mitochondrial dynamics via Drp1. Nat Commun. 13, 424(2022).
  42. Yu, X., et al. Involution of brown adipose tissue through a syntaxin 4 dependent pyroptosis pathway. Nat Commun. 15, 2856(2024).
  43. Verweij, F. J., et al. Quantifying exosome secretion from single cells reveals a modulatory role for GPCR signaling. J Cell Biol. 217 (3), 1129-1142 (2018).
  44. Arora, A., Sharma, V., Gupta, R., Aggarwal, A. Isolation and characterization of extracellular vesicles derived from ex vivo culture of visceral adipose tissue. Bio Protoc. 14 (11), e5011(2024).
  45. Benedikter, B. J., et al. Ultrafiltration combined with size exclusion chromatography efficiently isolates extracellular vesicles from cell culture media for compositional and functional studies. Sci Rep. 7, 15297(2017).
  46. Nordin, J. Z., et al. Ultrafiltration with size-exclusion liquid chromatography for high yield isolation of extracellular vesicles preserving intact biophysical and functional properties. Nanomedicine. 11 (4), 879-883 (2015).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

Toestemming aanvragen

Trefwoorden

Adipocyte EVsExtracellular VesiclesEV SecretionStromal Vascular FractionAdipocyte Progenitor CellsSize Exclusion ChromatographyFlow CytometryConfocal MicroscopyNanoparticle Tracking

Gerelateerde artikelen