Onderzoeksartikel

Lang niet-coderend RNA-IRAIN drijft immunometabole herprogrammering in glioma aan via de IGF1R-JAK-STAT-BIRC5-as

329 weergaven

⸱

DOI:

10.3791/69711

⸱

12 december 2025

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Neurosurgery, Zhangzhou Municipal Hospital of Fujian Province and Zhangzhou Affiliated Hospital of Fujian Medical University, 2The School of Clinical Medicine, Fujian Medical University, Zhangzhou Affiliated Hospital of Fujian Medical University

* These authors contributed equally

In dit artikel

Samenvatting

Met behulp van geïntegreerde machine learning over meerdere cohorten hebben we een robuuste IMRG-prognostische handtekening voor glioom gebouwd. IRAIN is duidelijk gedownreguleerd, omgekeerd gekoppeld aan graad en overleving, en onderdrukt de signalering van IGF1R-JAK2-STAT3-BIRC5, wat proliferatie, migratie en angiogenese belemmert. De bevindingen noemen IRAIN en IMRG's als biomarkers en therapeutische doelwitten.

Samenvatting

Glioom is een agressieve maligniteit met beperkte therapeutische opties en een slechte prognose. De progressie ervan is nauw verbonden met metabole herprogrammering en immuunontwijking, wat de noodzaak onderstreept om moleculaire regulatoren te identificeren die deze processen integreren. Hier hebben we een robuust immunometabolisch gerelateerd gen (IMRG) prognostisch signatuur vastgesteld en de rol van het lange niet-coderende RNA IRAIN bij het reguleren van het glioma-immunometabolisme via de IGF1R-JAK-STAT-BIRC5-as verduidelijkt. Transcriptomische en klinische gegevens van TCGA-, CGGA- (693/325) en GEO (GSE43378) cohorten werden geanalyseerd. Analyse van differentiële expressie en gewogen genco-expressienetwerkanalyse (β = 8) zorgde voor een schaalvrije topologie, en een leave-one-out crossvalidatiekader dat tien machine learning-algoritmen combineerde, leverde 101 prognostische modellen op. De optimale 17-gens IMRG-handtekening werd gevalideerd over alle cohorten en voorspelde onafhankelijk de algehele overleving. Functionele assays toonden aan dat IRAIN-overexpressie IGF1R remde, de fosforylering van JAK2/STAT3 onderdrukte en BIRC5 verlaagde, waardoor apoptose werd bevorderd en de angiogenese werd verminderd. Een lage IRAIN-expressie correleerde met immunosuppressieve Tregs- en M2-macrofagen en met verhoogde tumor-micro-omgeving scores, wat wijst op een immuun-evasief fenotype. Deze bevindingen vestigen IRAIN als een belangrijke regulator van glioma-immunometabole herprogrammering en valideren de IMRG-handtekening als een betrouwbaar prognostisch instrument, waarbij de IRAIN-IGF1R-JAK-STAT-BIRC5-route wordt benadrukt als een mechanistische brug die immuun- en metabole dysregulatie in glioma verbindt en potentiële doelen biedt voor precisietherapie.

Inleiding

Glioom is de meest voorkomende primaire maligniteit van het centrale zenuwstelsel en blijft een van de dodelijkste menselijke kankers ondanks vooruitgang in neurochirurgie, radiotherapie en chemotherapie. Hooggradige glioma, met name glioblastoma multiforme (GBM), worden gekenmerkt door snelle proliferatie, diffuse infiltratie en onvermijdelijke recidivisie 1,2. Onlangs zijn er een reeks effectieve therapeutische benaderingen ontstaan, zoals chirurgische ingrepen, immunotherapie en chemotherpie3. De mediane overleving blijft ongeveer 14-18 maanden, zelfs met maximale therapie, wat de noodzaak van nieuwe therapeutische strategieën en prognostische biomarkers benadrukt4.

De wisselwerking tussen de tumormicro-omgeving (TME) en kankercellen drijft de agressieve groei en moleculaire heterogeniteit van gliomen van cruciaal belang aan. Talrijke immuunbestanddelen, waaronder microglia, neuronale precursorcellen, vaatcellen en adaptieve immuuncellen, zijn nauw betrokken bij het vormen van TME 5,6,7. De afgelopen jaren zijn er opmerkelijke vooruitgang geboekt in immunotherapie, waarmee een transformerend tijdperk in de oncologie werd ingeluid. Desalniettemin hebben immuuncheckpointblokkade (ICB) en andere immunotherapeutische benaderingen slechts beperkt succes laten zien bij glioom8. Het falen van immunotherapie in deze context komt voort uit verschillende intrinsieke kenmerken van het glioma-micro-omgeving: namelijk een lage tumormutatielast, uitgesproken intratumorale heterogeniteit, een slechte doorlaatbaarheid van de bloed-hersenbarrière, downregulatie van belangrijke histocompatibiliteitscomplexmoleculen en schaars T-celinfiltratie 9,10,11,12.

Steeds meer bewijs suggereert dat de tumormicro-omgeving (TME), die metabole disfunctie vertoont, wordt gekenmerkt door zure omstandigheden, nutriëntentekort en de ophoping van metabolieten die immuunresponsen onderdrukken. Deze aandoening leidt vervolgens tot een disfunctie van immuuncellen die tumoren binnendringen en vermindert de effectiviteit van immunotherapie13. Tegelijkertijd ondergaan immuuncellen binnen het TME contextafhankelijke metabole verschuivingen die hun differentiatie en effectorfuncties bepalen. Zo vertrouwen geactiveerde T-cellen op glycolyse voor snelle proliferatie, terwijl regulerende T-cellen (Tregs) en tumor-geassocieerde macrofagen (TAMs), met name het M2-subtype, afhankelijk zijn van oxidatieve fosforylering en vetzuurmetabolisme om hun immunosuppressieve activiteit14,15 te behouden.

Daarom biedt het integreren van immuun- en metabole signaturen een rationeel kader om gliomen beter te classificeren en de patiëntprognose te voorspellen. Lange niet-coderende RNA's (lncRNA's) zijn recentelijk naar voren gekomen als veelzijdige regulatoren van chromatinearchitectuur, gentranscriptie en post-transcriptionele modificatie. Verschillende lncRNA's zijn betrokken bij de pathogenese van glioma, wat proliferatie, invasie enimmuunmodulatie beïnvloedt. Onder hen heeft het geprinte antisense-transcript IRAIN (IGF1R antisense imprint, niet-eiwitcoderend RNA) aandacht gekregen vanwege zijn rol bij het reguleren van het insuline-achtige groeifactor 1-receptor (IGF1R)-gen via cis-werkende chromatine-interacties, waarvan is aangetoond dat het de competitiecontrole van cis-achtige is verlaagd, vooral in kankercellen zoals borstkanker en leukemiecellijnen. larynxkanker en acute myeloïde leukemie, wat direct leidt tot upregulatie van IGF1R 17,18,19. Omdat IGF1R-signalering downstream JAK-STAT en PI3K-AKT routes activeert – beide centraal voor tumorgroei en immuunregulatie20,21 – kunnen veranderingen in IRAIN-expressie het tumorimmunometabolisme kritisch beïnvloeden. De rol van IRAIN bij glioom en de mogelijke impact ervan op het immunometabole landschap zijn echter nog niet opgehelderd. Het aanpakken van deze kenniskloof zou mechanistisch inzicht kunnen bieden in hoe niet-coderende RNA's metabole adaptatie en immuunontwijking in glioom coördineren.

In deze studie combineerden we transcriptomische data uit meerdere cohorten met experimentele validatie om immunometabole regulatie in glioom te onderzoeken. Met behulp van geïntegreerde machine-learning-kaders binnen de TCGA-, CGGA- (693/325) en GEO (GSE43378) cohorten, identificeerden we een robuuste 17-gens immunometabolisch-gerelateerde gen (IMRG) prognostische signatuur die in staat is de patiëntoverleving over datasets te stratificeren. Vervolgens richtten we ons op IRAIN als potentiële upstream regulator van dit netwerk, gezien de voorspelde interactie met de IGF1R-JAK-STAT signaalas. Functionele assays toonden aan dat IRAIN-overexpressie gliomaproliferatie en angiogenese onderdrukt door de expressie van IGF1R en de downstream STAT3-fosforylering te remmen, wat resulteert in een verminderde expressie van het anti-apoptotische eiwit BIRC5 (ook bekend als Survivin). Gezamenlijk ondersteunen deze bevindingen een werkend model waarin IRAIN functioneert als een mechanistische brug die immuunregulatie en metabole herprogrammering in glioom verbindt. We veronderstellen dat de disreguliere IRAIN-expressie tumorprogressie bevordert door deze balans te verstoren, waardoor een immunosuppressieve microomgeving ontstaat en resistentie tegen therapie ontstaat.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

Alle procedures met betrekking tot menselijk weefsel voldeden aan de institutionele richtlijnen en de Verklaring van Helsinki en werden goedgekeurd door de Institutionele Beoordelingscommissie van de Fujian Medische Universiteit (Goedkeuringsnummer 2021KYB089). Schriftelijke geïnformeerde toestemming werd van alle deelnemers verkregen voorafgaand aan de inkoop van weefsel.

Genexpressie en overlevingsanalyse
RNA-sequencinggegevens en bijbehorende klinische informatie werden verkregen uit meerdere openbare databases. 1) TCGA-cohort: RNA-seq (FPKM) gegevens voor 175 glioblastoma multiforme (GBM) en 534 laaggradige gliommonsters (LGG) zijn gedownload van The Cancer Genome Atlas (https://portal.gdc.cancer.gov/); 2) Normale controles: Expressieprofielen van 211 normale hersenweefsels en 662 gliomaweefsels werden gedownload uit de UCSC Xena-database (https://xenabrowser.net/datapages/); 3) Externe validatie: Gegevens van CGGA693 en CGGA325 cohorten zijn verkregen uit de Chinese Glioma Genome Atlas (http://www.cgga.org.cn); 4) GEO-dataset: De GSE43378-dataset, met expressie- en klinische gegevens voor 50 gliomamonsters, werd gedownload van de Gene Expression Omnibus (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/). Alle ruwe telgegevens werden omgezet naar transcripts per miljoen (TPM) en log2 getransformeerd. Voor datasets die al genormaliseerd waren, werden expressiematrices onderzocht om vergelijkbare verdelingen te waarborgen. Genen met TPM-waarden < 1 op meer dan 80% van de steekproeven werden uitgesloten. Ontbrekende klinische informatie (leeftijd, IDH-status, 1p/19q-codeletie, MGMT-methylering) werd verwijderd met volledige casusfiltering. Batcheffecten tussen datasets werden aangepast met behulp van het ComBat-algoritme dat is geïmplementeerd in het R-pakket sva. Expressiewaarden werden gestandaardiseerd door z-score transformatie binnen elke dataset. Overlevingsanalyses werden uitgevoerd met behulp van de R-pakketten survival en survminer. Patiënten werden gedichotomiseerd in groepen met hoge en lage expressie op basis van het mediane expressieniveau van IRAIN. Kaplan-Meier overlevingscurves werden gegenereerd en de statistische significantie werd geëvalueerd met de log-rank test. Hazardratio's (HR's) en 95% betrouwbaarheidsintervallen (BI's) werden geschat met behulp van Cox-regressiemodellen met proportionele gevaren.

Definitie van immuun- en metabole gensets
Immuungerelateerde genen (IRG's, n = 2.483) werden verkregen uit de ImmPort-database (https://www.immport.org/shared/), en metabolisch gerelateerde genen (MRG's, n = 948) werden verkregen uit de Molecular Signatures Database (MSigDB, https://www.gsea-msigdb.org/). De gecombineerde set van deze genen werd gedefinieerd als immunometabolisch-gerelateerde genen (IMRG's). Deze genlijsten dienden als referenties voor latere differentiële expressie- en netwerkanalyses.

Analyse van differentiële expressie en gewogen genco-expressienetwerkanalyse
Differentieel tot expressie gebrachte genen (DEGs) tussen normaal hersen- en gliomaweefsel werden geïdentificeerd met behulp van het R-pakket limma. De expressiegegevens werden voorzien van een lineair model gevolgd door empirische Bayes-moderatie. Genen met |log₂ vouwverandering| > 1,5 en een valse ontdekkingsrate (FDR) < 0,05 werden als significant verschillend geexpresseerd beschouwd. Gewogen genco-expressienetwerkanalyse (WGCNA) werd uitgevoerd met het R-pakket WGCNA. Uitschieters werden uitgesloten door hiërarchische clustering. De soft-thresholding power werd ingesteld op β = 8 om een schaalvrije topologie-fitindex (R2 ≥ 0,85) te bereiken, terwijl de gemiddelde connectiviteit behouden bleef. Topologische overlappingsmatrices (TOM) werden geconstrueerd en genen werden gegroepeerd in modules met een minimale grootte van 50 met behulp van het dynamische boom-cut-algoritme. Module-eigengenen waren gecorreleerd met klinische kenmerken, en de module die het sterkst geassocieerd is met glioom (Pearson's r > 0,7, P < 1×10-10) werd geselecteerd voor hubgenidentificatie.

Op basis van prognosetische modelconstructie gebaseerd op machine learning
Een uitgebreid leave-one-out cross-validation (LOOCV) kader dat tien machine-learning algoritmen integreert, werd toegepast om prognostische modellen te construeren en te evalueren. In totaal werden 101 combinatorische workflows geïmplementeerd met de TCGA-cohort als trainingsdataset. Prognose-geassocieerde immunometabolisch-gerelateerde genen (IMRG's) werden voor het eerst geïdentificeerd door univariate Cox-regressie (P < 0,05). Het optimale model werd bepaald door het gemiddelde Harrell's concordantie-index (C-index) te maximaliseren over drie validatiedatasets (CGGA693, CGGA325 en GSE43378). Het resulterende RSF-Enet model (α = 0,3) toonde de hoogste voorspellende prestaties en behield robuuste generaliseerbaarheid over onafhankelijke cohorten22.

TME en immuuninfiltratie
Om het immunogenomische landschap volledig te karakteriseren, hebben we een meerlaagse analytische aanpak toegepast. Ten eerste werden immuun- en stromale infiltratieniveaus gekwantificeerd met behulp van het ESTIMATE-algoritme23. Differentiële expressie van belangrijke immuuncontrolepuntmoleculen, waaronder PDCD1, CTLA4 en LAG3, werd vervolgens beoordeeld via limma-gebaseerde analyse, en de correlaties tussen checkpointgenen werden gevisualiseerd met behulp van correlatiematrices. Somatische mutatieprofielen uit 903 glioma-monsters in de TCGA-cohort werden gebruikt om tumor mutatiebelasting (TMB), microsatellietinstabiliteit (MSI) en tumor immuundisfunctie en -uitsluiting (TIDE) scores te berekenen om mogelijke responsen op immunotherapie te voorspellen. Patiënten werden vervolgens gestratificeerd in vier prognostische groepen op basis van gecombineerde TMB-status (hoog/laag) en risicoscores (hoog/laag), en de overlevingsuitkomsten werden vergeleken met behulp van de Kaplan-Meier-analyse.

Functionele verrijkingsanalyse
Gene Ontology (GO) en Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes (KEGG) routeverrijkingsanalyses werden uitgevoerd met behulp van het R-pakket clusterProfiler. Verrijkingsresultaten met aangepaste P-waarden < 0,05 werden als statistisch significant beschouwd. Oververtegenwoordigde biologische processen, cellulaire componenten en moleculaire functies werden gevisualiseerd met behulp van dotplots en staafdiagrammen. Eiwit-eiwitinteractie (PPI) netwerken werden geconstrueerd met behulp van de STRING-database (≥ 0.4) en gevisualiseerd in Cytoscape. Functionele modules binnen het PPI-netwerk werden geïdentificeerd met behulp van het MCODE-algoritme. Gen-gen-interactie en co-expressienetwerken werden verder geanalyseerd met behulp van GeneMANIA (https://string-db.org; betrouwbaarheidsscore ≥ 0,4) en gevisualiseerd in Cytoscape. Functionele modules binnen het PPI-netwerk werden geïdentificeerd met behulp van het MCODE-algoritme. Gen-gen-interactie en co-expressienetwerken werden verder geanalyseerd met behulp van GeneMANIA (https://genemania.org), dat informatie integreert over fysieke en genetische interacties, gedeelde routes en co-expressiepatronen om potentiële functionele associaties af te leiden.

Klinische monsters
Verse gliomaweefsels (n = 6) en gekoppelde aangrenzende niet-tumoreuze hersenweefsels (n = 6; ten minste 3 cm van de tumorrand en histologisch bevestigd als tumorvrij) werden verzameld van patiënten die een primaire glioma-resectie ondergingen in het Zhangzhou Affiliated Hospital van de Fujian Medical University. Geen van de patiënten had vóór de operatie chemotherapie of radiotherapie ondergaan. Alle pathologische diagnoses zijn onafhankelijk geverifieerd door twee neuropathologen volgens de classificatie van tumoren van het centrale zenuwstelsel door de Wereldgezondheidsorganisatie (WHO) uit 2021. Direct na de chirurgische excisie werden weefselmonsters afgespoeld met ijskoude fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS) om restbloed te verwijderen, ingevroren in vloeibare stikstof (-196 °C) en bewaard bij -80 °C tot RNA-extractie.

Cellijnen en celkweek
Menselijke glioblastomcellijnen SHG44, U251, A172 en T98G, evenals normale menselijke gliacellen (HEB), werden verkregen uit geauthenticeerde bewaarplaatsen en bevestigd vrij van mycoplasma-besmetting vóór gebruik. Cellen werden behouden in Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM, hoge glucose) aangevuld met 10% foetaal rundereserum (FBS), 2 mM L-glutamine en 1% penicilline-streptomycine, bij 37 °C in een bevochtigde incubator met 5% CO₂. Cellen werden elke 4-5 dagen doorgevoerd bij het bereiken van 80-90% confluenz. Om IRAIN-overexpressieve en controlecellijnen vast te stellen, werden cellen getransduceerd met lentivirale vectoren die het volledige IRAIN-transcript droegen of een lege vector als controle. Stabiele klonen werden geselecteerd met puromycine (2 μg/mL) gedurende 14 dagen. Overexpressie-efficiëntie werd bevestigd door kwantitatieve reverse transcription PCR (qRT-PCR) voorafgaand aan downstream assays.

3- (4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-difenyltetrazoliumbromide (MTT) celproliferatietest
Cellen werden gezaaid in 96-put platen met een dichtheid van 1 × 104 cellen per put in 100 μL volledig kweekmedium. Na 24, 48 en 72 uur na het zaaien werd 20 μL MTT-oplossing (5 mg/mL in fosfaatgebufferde zoutoplossing) aan elke put toegevoegd en 4 uur geïncubeerd bij 37 °C. Het supernatant werd vervolgens verwijderd en 150 μL dimethylsulfoxide (DMSO) toegevoegd om de formazankristallen op te lossen. Het bord werd voorzichtig 10 minuten geroerd om volledige oplosbaarheid te garanderen. De absorptie werd gemeten op 490 nm met een microplaatspectrofotometer. Achtergrondmetingen van lege putten werden afgetrokken. De cellevensvatbaarheid werd berekend ten opzichte van de 24-uurs- of controlegroep (ingesteld als 1,0). Alle experimenten werden uitgevoerd met zes technische replicaten en drie onafhankelijke biologische replicaten. De gegevens worden uitgedrukt als gemiddelde ± standaarddeviatie (SD), en de statistische significantie werd bepaald met behulp van een tweezijdige t-test.

Flowcytometrie voor apoptose (Annexine V - FITC/PI-kleuring)
Cellen werden gezaaid bij 60-70% samenvloeiing en 24 uur behandeld onder de aangegeven omstandigheden. Zwevende en hechtende cellen werden verzameld met EDTA-vrije trypsine, gecombineerd en twee keer gewassen met ijskoude PBS. Celpellets werden opnieuw opgehangen in Annexin V bindingsbuffer (10 mM HEPES pH 7,4, 140 mM NaCl, 2,5 mM CaCl2) bij 1 × 106 cellen /mL. Voor elk monster werd 100 μL suspensie geïncubeerd met 5 μL Annexin V-FITC en 5 μL propidiumjodide (PI; 50 μg/mL voorraad) in het donker gedurende 15 minuten bij kamertemperatuur. Na toevoeging van 400 μL bindingsbuffer werden monsters op ijs gelegd en binnen 1 uur geanalyseerd op een flowcytometer (488 nm excitatie; 530/30 nm voor FITC en >585 nm voor PI). Geschikte enkelkleurige en fluorescentie-minus-één controles werden opgenomen ter compensatie. Er werden per steekproef minstens 10.000 gebeurtenissen geregistreerd. De gegevens werden geanalyseerd per kwadrantgating: levende (Annexin V⁻/PI⁻), vroege apoptotische (Annexin V⁺/PI⁻), late apoptotische (Annexin V⁺/PI⁺) en necrotische (Annexin V⁻/PI⁺) populaties. Percentages vroege + late apoptotische cellen werden gerapporteerd (gemiddelde ± SD, n = 3).

Kwantitatieve real-time PCR (qRT-PCR)
Total RNA werd geïsoleerd met behulp van een zuur fenol-guanidiniumreagens volgens het protocol van de fabrikant. De zuiverheid van RNA werd geverifieerd door spectrofotometrie (A₂₆₀/A₂₈₀ = 1,8-2,1), en de integriteit werd bevestigd door gelelektroforese (RNA-integriteitsnummer ≥ 7). Eén microgram totaal RNA werd behandeld met DNase I en omgekeerd getranscribeerd in een 20 μL-reactie met behulp van willekeurige hexamers en oligo(dT)-primers. De reactie werd uitgevoerd bij 25 °C gedurende 10 minuten, 50 °C gedurende 30 minuten en 85 °C gedurende 5 minuten. Kwantitatieve PCR werd uitgevoerd in een 10 μL-systeem met 5 μL 2× SYBR Green Master Mix, elk 0,3 μM primer, en 1 μL cDNA (≈ 20 ng RNA-equivalent). De thermische cycluscondities waren 95 °C gedurende 5 minuten, gevolgd door 40 cycli van 95 °C gedurende 15 seconden en 60 °C gedurende 30 seconden, gevolgd door een smeltcurveanalyse van 65 °C tot 95 °C in stappen van 0,3 °C. Alle reacties werden driemaal uitgevoerd, samen met no-template en minus-RT controles. CT-waarden > 35 of technisch replicate SD > 0,5 werden uitgesloten. De relatieve expressie werd berekend met de 2⁻ΔΔCt-methode, met GAPDH als interne controle. Gemiddelde ± SD-waarden van drie onafhankelijke biologische replicaten werden gerapporteerd, en groepsverschillen werden geanalyseerd met een tweezijdige t-test.

Western blot-analyse
Cellen werden gelyseerd op ijs in een RIPA-buffer (50 mM Tris-HCl, pH 7,4, 150 mM NaCl, 1% NP-40, 0,5% natriumdeoxycholaat, 0,1% SDS) aangevuld met protease- en fosfataseremmers. Lysaten werden 30 minuten op ijs geïncubeerd met intermitterende vortexen en verwijderd door centrifugatie bij 12.000 × g gedurende 15 minuten bij 4 °C. De eiwitconcentraties werden gemeten met een BCA-assay, aangepast naar 1-2 μg/μL, en gemengd 1:3 met 4× Laemmli-buffer (de laatste 1× buffer met 100 mM DTT). De monsters werden 5 minuten gedenatureerd bij 95 °C. Gelijke hoeveelheden eiwit (50 μg) werden opgelost met 12% SDS-PAGE bij 100 V gedurende 90 minuten en elektro-overgebracht naar PVDF-membranen bij 250 mA gedurende 90 minuten. De membranen werden geblokkeerd met 5% magere melk in TBST (0,1% Tween-20) gedurende 1 uur bij kamertemperatuur (of 5% BSA voor fosfoproteïnen) en 's nachts geïncubeerd bij 4 °C met primaire antilichamen tegen IGF1, IGF1R, JAK2, p-JAK2 (Y1007/1008), STAT3, p-STAT3 (Y705), BIRC5 en β-actine (typische verdunning 1:1000, β-actine 1:5000). Na drie wasbeurten van 10 minuten in TBST werden membranen geïncubeerd met HRP-geconjugeerde secundaire antistoffen (1:5000) gedurende 1 uur bij kamertemperatuur, opnieuw gewassen en ontwikkeld met chemiluminescente substraat. Bandintensiteiten werden gekwantificeerd met ImageJ, genormaliseerd tot β-actine of totaal eiwit, en uitgedrukt als gemiddelde ± SD uit drie onafhankelijke experimenten.

Immunocytochemie
Cellen die op steriele glazen dekfolies werden gekweekt, werden twee keer afgespoeld met PBS en 15 minuten bij kamertemperatuur vastgezet in 4% paraformaldehyde. Na drie PBS-wasbeurten werden de cellen permeabiliseerd met 0,2% Triton X-100 gedurende 10 minuten, geblokkeerd met 5% rundereserumalbumine (BSA) gedurende 1 uur, en 's nachts geïncubeerd bij 4 °C met het primaire anti-CD31-antilichaam (1:200 verdunning in 1% BSA). Na drie PBS-washes werden cellen geïncubeerd met Alexa-fluor-geconjugeerde secundaire antilichamen (1:500 verdunning) gedurende 1 uur in het donker, tegengekleurd met DAPI (1 μg/mL, 5 min) en gemonteerd in antifade medium. Beelden werden vastgelegd met een fluorescentiemicroscoop onder identieke belichtings- en versterkingsinstellingen. Het percentage CD31-positieve gebied werd gekwantificeerd in vijf willekeurig geselecteerde niet-overlappende velden per steekproef met behulp van ImageJ-software. Deze assay werd uitgevoerd in celmodellen in plaats van in weefseldoorsneden.

Statistische analyse
Statistische analyses werden uitgevoerd met behulp van R-versie 4.3.0 samen met de bijbehorende pakketten. Om categorische variabelen te vergelijken werd de chi-kwadraattest gebruikt, terwijl continue variabelen werden beoordeeld met behulp van ofwel de Wilcoxon-rangsomtest of de T-test. De evaluatie van continue variabelen werd uitgevoerd via Pearsons correlatiecoëfficiënt. Overlevingsanalyses werden uitgevoerd met behulp van het survivalpakket, dat Cox-proportionele gevarenmodellering en het genereren van Kaplan-Meier-curves omvatte, met optimale stratificatiedrempels vastgesteld door het survminer-pakket en de formule Riskscore = Vergelijking 1. Het CompareC-pakket werd gebruikt om de C-indices van verschillende variabelen te beoordelen. De ontvanger-operating characteristic curve (ROC), bedoeld om binaire categorische variabelen te voorspellen, werd gegenereerd met het pROC-pakket. Daarnaast werd het tijdsafhankelijke gebied onder de ROC-curve (AUC) voor survivalmetrieken geanalyseerd met behulp van het timeROC-pakket. Alle statistische tests werden uitgevoerd met een tweezijdige aanpak. Een significantieniveau van P < 0,05 werd als statistisch significant beschouwd.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

IRAIN is gedownreguleerd bij glioom en geassocieerd met nadelige klinisch-pathologische kenmerken
Het analyseproces wordt geïllustreerd in Figuur 1. IRAIN-expressie werd voor het eerst beoordeeld met qRT-PCR in primaire astrocyten, gliomaweefsels en gliomacellijnen. IRAIN-niveaus waren duidelijk verlaagd in zowel laaggradige als hooggradige gliomaweefsels en in alle vier gliomacellijnen (SHG44, A172, U251 en T98G) vergeleken met normale astrocyten (Fi...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

Glioom blijft een van de dodelijkste maligniteiten van het centrale zenuwstelsel, gekenmerkt door diepgaande intratumorale heterogeniteit en weerstand tegen conventionele therapie. Ondanks chirurgische resectie gecombineerd met chemoradiotherapie blijven recidief en sterfte hoog, en de mediane overleving van patiënten, met name die met glioblastoom, vertoont de afgelopen decennia beperkte verbetering 4,24. Toenemend bewijs wijst ...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

De auteurs hebben niets te onthullen.

Dankbetuigingen

Wij danken alle deelnemers en onderzoekers die betrokken zijn bij het Genotype-Tissue Expression (GTEx) project en de TCGA- en CGGA-databases voor het delen van beschikbare gegevens. Dit werk werd ondersteund door het Fujian Provinciale Gezondheidstechnologieproject (2024GG01010154) en het Doctoral Workstation Climbing Project van het Zhangzhou Ziekenhuis (PDA202306). De financier stelde geld beschikbaar voor ons onderzoek.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
Annexin V-PI Apoptosis Kit Southern Biotechnology, Birmingham, AL, USANAGebaat voor het evalueren van apoptose
AnnexinV-PI Apoptosis KitSouthern Biotechnology10010-02Gebaat voor apoptosebeoordeling door flow cytometry.
Anti-IGF1, Anti-IGF1R, Anti-JAK2, Anti-STAT3, Anti-Survivin, Anti-β-actinAbcamab182408, ab108596, ab109085, ab76424, ab8227Antilichamen gebruikt voor Western Blot-analyse van signaalroutes.
BiocManagerCRAN1.30.25Installeer en beheer Bioconductor-pakketten in R ≥ 3.6.
Bio-Rad Cfx96 SystemBioconductor1.5.1Programmatische toegang tot STRING-eiwit-eiwitinteracties.
CaretCRAN0.4Tijdsafhankelijke ROC/AUC voor overlevingsmodellen.
Chinese Glioma Genome Atlas ( CGGA)NACGGA693 en CGGA325 Gebaat voor modelconstructie en validatie
ClusterprofilerBioconductor2.18.0MAF-bestanden parsen; tumormutatielast (TMB) en mutatielandschap berekenen.
CorrplotCRAN3.5.0Algemene grafische weergave (boxplots, vioolplots, spreidingsplot, trendlijnen).
CoxboostCRAN7.3-60stepAIC voor stapsgewijze Cox-modelselectie.
Data.TableCRANreadr2.1.5Snel lezen van gescheiden bestanden; robuuste UTF-8-verwerking.
DoseBioconductor3.17.0Menselijke genannotatie (Entrez, Ensembl, SYMBOL-mappings).
DynamictreecutCRAN1.73Gewichte co-expressieanalyse van genen; pickSoftThreshold, TOM, moduledetectie.
EdgerBioconductor3.56.2Differentiële expressie (voom/lineaire modellen); Wilcoxon/empirische Bayes; vulkaan/heatmap-inputs.
EnrichplotBioconductor3.26.2Ziektenontologieverrijking en GSEA-hulpmiddelen (gebruikt met clusterProfiler).
FlashclustCRAN1.63-1Adaptieve taksnede voor WGCNA-moduledetectie.
GbmCRAN1.12Gesuperviseerde hoofdcomponenten voor overlevingsanalyse.
Gene Expression Omnibus (GEO)NAGSE43378Gebaat voor modelconstructie en validatie
GEOqueryBioconductorNADownload en parse GEO-datasets.
Ggplot2CRAN1.0.12Publicatieklare heatmaps van expressiesignaturen.
GlmnetCRAN3.3.1Willekeurig overlevingsbos voor rechts gecensureerde uitkomsten.
Horseradish Peroxidase-labeled anti-rabbit secundaire antilichamenAbcamab6721Secundaire antilichamen voor detectie in Western Blot.
Human glioblastoma cell lines (SHG44, U251, A172, T98G)American Tissue Culture CollectionNAMenselijke glioblastoma-cellijnen voor glioma-onderzoek. Cellen werden gekweekt in DMEM + 10% FBS, 2 mM L-glutamine.
IgraphCRAN10.0.1Toegang tot MSigDB-gensets (bijv. metabolische MRG's); handige nette frames.
Image J software Media Cybernetics, USA152Gebaat voor visualisatie
Lentivirale vector die lncRNA-IRAIN codeertGeneChem, Shanghai, China NALentivirale vectoren gebruikt voor transfectie van glioma- en HEB-cellen om stabiele klonen te vestigen.
LimmaBioconductor3.48.0Batchcorrectie (ComBat) en surrogate variabele-analyse.
MaftoolsBioconductor1.52.0Harrell’s concordantie-index (C-index) en overlevingsvergelijkingshulpmiddelen.
MassCRAN4.1-8Gesanctioneerde Cox-modellen: Lasso, Ridge en Elastic Net.
MsigdbrCRAN0.0.5Support vector machine-methoden voor overlevingsgegevens.
MTTSigma-AldrichM2128Gebaat voor celproliferatie-assays.
Normal glial cells (HEB)American Tissue Culture CollectionNANormale menselijke gliacellenlijn voor vergelijkingsstudies. Gekweekt in DMEM + 10% FBS.
Org.Hs.Eg.DbBioconductor4.8.3GO/KEGG-verrijking en GSEA; ondersteunt meerdere ID-typen.
PheatmapCRAN2.0.0Grammatica van data science; bevat dplyr, tidyr, purrr, ggplot2 voor het manipuleren en plotten van gegevens.
PlsrcoxCRAN1.5Waarschijnlijkheidsgebaseerde boosting voor Cox-modellen.
PVDF MembranesMilliporeIPVH00010Membrans gebruikt voor eiwitoverdracht na SDS-PAGE.
RandomforestsrcCRAN6.0-94Gegevensherbeoordeling (inclusief LOOCV), tuning-rasters en modelpipelines.
ReadrCRANNAMatrixsen/fenotypen ophalen uit UCSC Xena (bijv. TCGA/GTEx-hubs).
SDS-Page Gel (12%)Bio-Rad185-5096Systeem gebruikt voor kwantitatieve PCR.
StringdbBioconductor1.20.3Visualisatie voor verrijkingsresultaten (dotplot, cnetplot, ridgeplot).
SuperpcCRAN1.7.7Partiële kleinstekwadratenregressie aangepast aan Cox-modellen.
SurvcompBioconductor3.42.4Normalisatie van tellingen en spreidingsschatting indien nodig (optioneel, complementeert limma voom).
SurvivalCRAN1.01-2Snelle hiërarchische clustering gebruikt door WGCNA (optioneel).
SurvivalsvmCRAN2.2.2Algemene versterkte regressiemodellering (gradient boosting).
SurvminerCRAN3.8-3Cox-proportionele risicomodellen; Kaplan–Meier-curves.
TCGAbiolinksBioconductorT9039

Referenties

  1. Goodenberger, M. L., Jenkins, R. B. Genetics of adult glioma. Cancer Genet. 205 (12), 613-621 (2012).
  2. Cordier, D., Krolicki, L., Morgenstern, A., Merlo, A. Targeted radiolabeled compounds in glioma therapy. Semin Nucl Med. 46 (3), 243-249 (2016).
  3. Jiang, T., et al. Clinical practice guidelines for the management of adult diffuse gliomas. Cancer Lett. 499, 60-72 (2021).
  4. Huang, X., et al. Immune-Related Gene SERPINE1 Is a Novel Biomarker for Diffuse Lower-Grade Gliomas via Large-Scale Analysis. Front Oncol. 11, 646060(2021).
  5. Cole, A. P., et al. Microglia in the Brain Tumor Microenvironment. Adv Exp Med Biol. 1273, 197-208 (2020).
  6. Vitale, I., Manic, G., Coussens, L. M., Kroemer, G., Galluzzi, L. Macrophages and metabolism in the tumor microenvironment. Cell Metab. 30 (1), 36-50 (2019).
  7. Cheng, W., et al. Bioinformatic profiling identifies an immune-related risk signature for glioblastoma. Neurology. 86 (24), 2226-2234 (2016).
  8. Rodriguez, S. M. B., et al. Glioblastoma and immune checkpoint inhibitors: a glance at available treatment options and future directions. Int J Mol Sci. 25 (19), (2024).
  9. Arrieta, V. A., et al. Immune checkpoint blockade in glioblastoma: from tumor heterogeneity to personalized treatment. J Clin Invest. 133 (2), (2023).
  10. Kadry, H., Noorani, B., Cucullo, L. A blood-brain barrier overview on structure, function, impairment, and biomarkers of integrity. Fluids Barriers CNS. 17 (1), 69(2020).
  11. Wang, Q., et al. Tumor evolution of glioma-intrinsic gene expression subtypes associates with immunological changes in the microenvironment. Cancer Cell. 32 (1), 42-56.e6 (2017).
  12. Jansen, J. A., Omuro, A., Lucca, L. E. T-cell dysfunction in glioblastoma: a barrier and an opportunity for the development of successful immunotherapies. Curr Opin Neurol. 34 (6), 827-833 (2021).
  13. Vander Heiden, M. G., Cantley, L. C., Thompson, C. B. Understanding the Warburg effect: the metabolic requirements of cell proliferation. Science. 324 (5930), 1029-1033 (2009).
  14. Dong, X., et al. Tumor metabolism-rewriting nanomedicines for cancer immunotherapy. ACS Cent Sci. 9 (10), 1864-1893 (2023).
  15. Kesarwani, P., Prabhu, A., Kant, S., Chinnaiyan, P. Metabolic remodeling contributes towards an immune-suppressive phenotype in glioblastoma. Cancer Immunol Immunother. 68 (7), 1107-1120 (2019).
  16. Xu, X., et al. LncRNA as potential biomarker and therapeutic target in glioma. Mol Biol Rep. 50 (1), 841-851 (2023).
  17. Sun, J., et al. A novel antisense long noncoding RNA within the IGF1R gene locus is imprinted in hematopoietic malignancies. Nucleic Acids Res. 42 (15), 9588-9601 (2014).
  18. Wang, J. Y., Liu, D., Meng, Y. D., Guo, Y. Y., Zhao, M. Aberrant allelic switch of antisense lncRNA IRAIN may be an early diagnostic marker in laryngeal cancer. Oncol Lett. 20 (4), 65(2020).
  19. Pian, L., et al. Targeting the IGF1R pathway in breast cancer using antisense lncRNA-mediated promoter cis-competition. Mol Ther Nucleic Acids. 12, 105-117 (2018).
  20. Salminen, A., Kaarniranta, K., Kauppinen, A. Insulin/IGF-1 signaling promotes immunosuppression via the STAT3 pathway: impact on the aging process and age-related diseases. Inflamm Res. 70 (10-12), 1043-1061 (2021).
  21. Cortés-Ballinas, L., López-Pérez, T. V., Rocha-Zavaleta, L. STAT3 and the STAT3-regulated inhibitor of apoptosis protein survivin as potential therapeutic targets in colorectal cancer (Review). Biomed Rep. 21 (6), 175(2024).
  22. Liu, Z., et al. Machine learning-based integration develops an immune-derived lncRNA signature for improving outcomes in colorectal cancer. Nat Commun. 13 (1), 816(2022).
  23. Yoshihara, K., et al. Inferring tumour purity and stromal and immune cell admixture from expression data. Nat Commun. 4, 2612(2013).
  24. Ostrom, Q. T., et al. The epidemiology of glioma in adults: a "state of the science" review. Neuro Oncol. 16 (7), 896-913 (2014).
  25. Weidner, N., Semple, J. P., Welch, W. R., Folkman, J. Tumor angiogenesis and metastasis-correlation in invasive breast carcinoma. N Engl J Med. 324 (1), 1-8 (1991).
  26. Perrin, S. L., et al. Glioblastoma heterogeneity and the tumour microenvironment: implications for preclinical research and development of new treatments. Biochem Soc Trans. 47 (2), 625-638 (2019).
  27. Justus, C. R., Sanderlin, E. J., Yang, L. V. Molecular connections between cancer cell metabolism and the tumor microenvironment. Int J Mol Sci. 16 (5), 11055-11086 (2015).
  28. Boedtkjer, E., Pedersen, S. F. The acidic tumor microenvironment as a driver of cancer. Annu Rev Physiol. 82, 103-126 (2020).
  29. Bernhard, C., Reita, D., Martin, S., Entz-Werle, N., Dontenwill, M. Glioblastoma metabolism: insights and therapeutic strategies. Int J Mol Sci. 24 (11), 9137(2023).
  30. Kesarwani, P., Kant, S., Prabhu, A., Chinnaiyan, P. The interplay between metabolic remodeling and immune regulation in glioblastoma. Neuro Oncol. 19 (10), 1308-1315 (2017).
  31. Pellegrino, M., et al. Manipulating the tumor immune microenvironment to improve cancer immunotherapy: IGF1R, a promising target. Front Immunol. 15, 1356321(2024).
  32. Zhang, W., et al. Polarization of macrophages in the tumor microenvironment is influenced by EGFR signaling within colon cancer cells. Oncotarget. 7 (46), 75366-75378 (2016).
  33. DiToro, D., et al. Insulin-like growth factors are key regulators of T helper 17/regulatory T cell balance in autoimmunity. Immunity. 52 (4), 650-667.e10 (2020).
  34. Pennati, M., Folini, M., Zaffaroni, N. Targeting survivin in cancer therapy: fulfilled promises and open questions. Carcinogenesis. 28 (6), 1133-1139 (2007).
  35. Sah, N. K., Khan, Z., Khan, G. J., Bisen, P. S. Structural, functional and therapeutic biology of survivin. Cancer Lett. 244 (2), 164-171 (2006).
  36. Altieri, D. C. Survivin apoptosis: an interloper between cell death and cell proliferation in cancer. Lab Invest. 79, 1327-1333 (1999).
  37. Feng, J., et al. A novel long noncoding RNA IRAIN regulates cell proliferation in non-small cell lung cancer. Int J Clin Exp Pathol. 8 (10), 12268-12275 (2015).
  38. Zhang, H., Zhang, D., Luan, X., Xie, G., Pan, X. Inhibition of the signal transducers and activators of transcription (STAT) 3 signalling pathway by AG490 in laryngeal carcinoma cells. J Int Med Res. 38 (5), 1673-1681 (2010).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

Toestemming aanvragen

Trefwoorden

Immunometabolisme van gliomenprognostische signatuurgewogen gen co expressiemachine learning modellentumormicro omgevingimmuunontwijking

Gerelateerde artikelen