Methodenartikel

Verbetering van CRISPR-Cas9-schermen in CAR T-cellen: Een verfijnde methode voor bibliotheekvoorbereiding

DOI:

10.3791/69721

⸱

2 januari 2026

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Hemato-Oncology Program, Cima Universidad de Navarra, IdiSNA, 2Centro de Investigacion Biomedica en Red de Cancer (CIBERONC), 3Computational Biology and Translational Genomics Program, Cima Universidad de Navarra, IdiSNA, 4Cancer Center Clinica Universidad de Navarra (CCUN), 5Data Science and Artificial Intelligence Institute (DATAI), Universidad de Navarra, 6Hematology and Cell Therapy Department, Clinica Universidad de Navarra, IdiSNA

* These authors contributed equally

In dit artikel

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

We ontwikkelden een geoptimaliseerd CRISPR-Cas9 knockout-screeningsprotocol voor primaire CAR T-cellen. Door de gDNA-overdracht via enzymatische vertering en sgRNA-cassette pulldown te verminderen, minimaliseert deze aanpak PCR-artefacten, waardoor nauwkeurige sgRNA-detectie en robuuste identificatie van functionele gendoelen worden gegarandeerd.

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Chimerische antigeenreceptor (CAR) T-celtherapieën hebben opmerkelijke effectiviteit getoond bij verschillende hematologische maligniteiten, maar hun succes is niet volledig gerepliceerd in solide tumoren. Bovendien blijft terugval na CAR T-celinfusie zelfs bij hematologische kankers de langetermijnuitkomsten aantasten. Deze uitdagingen benadrukken de dringende noodzaak om strategieën te ontwikkelen die de effectiviteit, persistentie van CAR T-cellen verbeteren, en tumor- en micro-omgevingsresistentie overwinnen. Geclusterde regelmatig geinterspaced short palindromic repeats (CRISPR)-Cas9-gebaseerde screeningsplatforms bieden een krachtige methode om systematisch genen te identificeren die de functie van CAR T-cellen reguleren. Door genetische verstoringen te koppelen aan fenotypische uitkomsten, maken deze assays de ontdekking van routes mogelijk die activatie, proliferatie, geheugenvorming en cytotoxiciteit reguleren. Standaardworkflows omvatten transductie van aanzienlijke aantallen cellen met één enkele gids-RNA (sgRNA)-bibliotheek, Cas9-gemedieerde bewerking, selectie van bewerkte cellen en PCR-amplificatie van sgRNA-cassettes uit genomisch DNA (gDNA) voorafgaand aan sequencing. PCR-amplificatie met grote hoeveelheden gDNA brengt echter aanzienlijke uitdagingen met zich mee en slaagt er vaak niet in om sgRNA's selectief te amplificeren en terug te halen. Hier beschrijven we een geoptimaliseerd CRISPR-Cas9 knockout-screeningsprotocol, dat we hebben getest op primaire menselijke CAR T-cellen. De methode bevat hier een tussenstap tijdens de voorbereiding van de sgRNA-bibliotheek die de gDNA-overdracht vermindert via enzymatische vertering en selectieve pulldown van de sgRNA-cassette, waardoor de efficiëntie van de eerste PCR-amplificatie toeneemt. Deze aanpassing stelde ons in staat om sgRNA-informatie terug te halen via onze CAR T-celscreens, wat bij eerdere pogingen met traditionele 1- en 2-stap PCR-amplificatieprotocollen ongrijpbaar was gebleven. Samenvattend faciliteert deze geoptimaliseerde workflow de voorbereiding van CRISPR-screeningbibliotheek in uitdagende monsters en maakt het mogelijk om belangrijke genetische determinanten te identificeren die kunnen worden gericht om de therapeutische effectiviteit te verbeteren.

Inleiding

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Immunotherapie heeft de kankerbehandeling gerevolutioneerd en biedt nieuwe strategieën om het immuunsysteem te benutten en te moduleren. Onder deze is de therapie met chimere antigeenreceptor (CAR) naar voren gekomen als een van de meest transformerende benaderingen. Deze therapie omvat de genetische modificatie van de T-cellen van een patiënt ex vivo met een synthetische receptor die is ontworpen om een specifiek tumorantigeen te herkennen, waardoor de antitumoractiviteit1 wordt versterkt. CAR T-cellen hebben opmerkelijk succes getoond bij hematologische maligniteiten, met uitkomsten variërend van kortstondige remissies tot langdurige ziektevrije overleving met minimale toxiciteit bij patiënten die CD19- of BCMA-gerichte therapieën kregen2. Tot nu toe heeft de FDA zeven CAR T-celproducten goedgekeurd voor hematologische kankers3. Ondanks deze vooruitgang blijven er aanzienlijke beperkingen bestaan. Uitdagingen ontstaan door het CAR T-celproduct zelf, vaak beïnvloed door het productieproces of de fitheid van de T-cellen van de patiënt, die kunnen worden aangetast door ziekteprogressie, eerdere therapieën of leeftijd. Tumor-intrinsieke resistentiemechanismen, zoals antigeen-downregulatie, kunnen ook de effectiviteitaantasten 4. Bovendien vormt de immunosuppressieve tumormicro-omgeving een extra barrière die de persistentie en functie van CAR T-cellen ernstig beperkt, vooral bij patiënten met solide tumor5. Daarom is er een dringende behoefte om zowel de initiële als de langetermijneffectiviteit van CAR T-celtherapieën te verbeteren.

De komst van CRISPR-Cas9 genbewerking heeft krachtige hulpmiddelen geboden om genfunctie te ontleden via grootschalige screeningsmethoden. In deze assays worden cellen getransduceerd met een single-guide RNA (sgRNA) bibliotheek, meestal geleverd door lentivirale vectoren, wat zorgt voor één sgRNA per cel en stabiele genomische integratie. Na Cas9-gemedieerde bewerking en selectie van getransduceerde cellen wordt genomisch DNA (gDNA) geëxtraheerd en worden sgRNA-cassettes versterkt door PCR voor bibliotheekvoorbereiding. High-throughput sequencing maakt vervolgens de kwantificatie van sgRNA-verdelingen over verschillende fenotypes mogelijk, waardoor genen worden geïdentificeerd die het proces in studie6 positief of negatief reguleren.

CRISPR-screening is op grote schaal toegepast om de T-celbiologie te onderzoeken en, meer recentelijk, om de prestaties van CAR T-cellen te verbeteren. Genoom-brede screens hebben regulatoren geïdentificeerd van fundamentele T-celprocessen, waaronder activatie, proliferatie en differentiatie. Zo werd FAM49B geïdentificeerd als een regulator van T-cel receptorsignaal 7, terwijl SOCS1, TCEB2, RASA2 en CBLB essentieel bleken voor proliferatie na stimulatie8. Naast deze kernpaden heeft CRISPR-screening ook genen die betrokken zijn bij T-celgeheugen en uitputting aan het licht gebracht. In vivo studies identificeerden Fli1 als kandidaat om effectorresponsen te versterken zonder geheugen- of uitputtingsprecursoren9 te verstoren, en de chromatine-remodeler Arid1a als een regulator waarvan het verlies de T-celuitputting10 vermindert. Regulatoren van T-helper type 2 (Th2) differentiatie zijn ook gekarakteriseerd met deze benadering11. Met behulp van een aangepaste sgRNA-bibliotheek gericht op 25 kinasen, werd vastgesteld dat p38 expansie, geheugenvorming en bescherming tegen oxidatieve en genomische stress12 bevordert. Evenzo leverde REGNASE-1 knockout in CD8+ T-cellen een langlevend effectorfenotype op dat de tumorcontrole verbeterde bij melanoom- en leukemiemodellen13. Aanvullende genoom-brede screenings identificeerden Dhx37 als een regulator van T-celactivatie en cytotoxiciteit14, terwijl LTBR en andere genen werden gevalideerd als versterkers van de T-celfunctie in CAR T- en γδ T-cellen15. Meer recentelijk is CRISPR-screening direct toegepast in CAR T-cellen, waarbij nieuwe doelwitten zijn onthuld zoals PRODH2, een enzym dat betrokken is bij prolinemetabolisme en de antitumoractiviteit van CAR Tverhoogt, en TLE4 en IKZF2, waarvan de inactivatie de effectiviteit van CAR T verbeterde in glioblastoommodellen17.

Een cruciale stap in CRISPR-screens is precies de selectieve amplificatie van sgRNA-cassettes uit extreem grote hoeveelheden gDNA, een uitdaging die moeilijk te omzeilen is gezien het enorme aantal cellen dat in CRISPR-screenings wordt gebruikt. PCR-amplificatie uit zulke grote hoeveelheden DNA-overdracht brengt verschillende technische uitdagingen met zich mee, waaronder moleculaire vernauwing die de fysieke diffusie van DNA- en polymerasemoleculen beperkt, tijdelijke niet-specifieke binding van de primers en de polymerase aan de DNA-achtergrond, off-target amplificatie die leidt tot primeruitputting, of Mg2+ vastlegging door de DNA-fosfaatruggengraat, naast andere uitdagingen18, 19, 20, 21. Deze leiden vaak tot PCR-falen en/of bias. Om deze problemen te beperken zijn verschillende strategieën voorgesteld, waaronder het scheiden van sgRNA-amplificatie van adaptortoevoeging in twee PCR-stappen22, het gebruik van doelverrijking met biotinyleerde oligo's en magnetische korrelvangst23,24, of het ontwerpen van plasmiden met restrictieplaatsen aan weerszijden van de sgRNA-cassette voor fragmentverrijking25.

In deze studie presenteren we een geoptimaliseerd CRISPR-Cas9 knockout-screeningsprotocol voor primaire menselijke CAR T-cellen. De gebruikte CRISPR-bibliotheek is Brunello Kinome 1, een bibliotheek die 3052 unieke sgRNA's van 20 nt lang bevat die gericht zijn op 763 menselijke kinasegenen (4 sgRNA's per doel). T-cellen werden geïsoleerd door CD4+ en CD8+ magnetische positieve selectie uit de perifere bloed mononucleaire cellen (PBMC)-verrijkte fractie van bloedmonsters van gezonde donoren. Bij activatie met anti-CD3 en anti-CD28 werden T-cellen geïnficeerd met de CRISPR-screeningsbibliotheek en vervolgens getransduceerd met het CAR-lentivirus. Cellen werden uitgebreid en vervolgens genucleofecteerd om het Cas9-eiwit in te voeren. CRISPR-bevattende cellen werden geselecteerd met puromycine, en CAR-positieve T-cellen werden gesorteerd. Na extractie werd genomisch DNA verteerd met restrictie-enzymen (RE), en werden de sgRNA-bevattende fragmenten naar beneden getrokken door biotineprobe-streptavidine-vangst. Vervolgens werden sgRNA's selectief geamplificeerd en geïndexeerd via twee opeenvolgende PCR's, en werden de resulterende bibliotheken gesequenced. Door een tussenstap te nemen om gDNA-overdracht te verminderen, konden we selectief ons sgRNA van interesse terughalen en amplificeren, waardoor we de rol van de kinasen in CAR T-cellen kunnen bestuderen.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dit protocol werd uitgevoerd volgens de richtlijnen van de Universidad de Navarra. Alle proefpersonen gaven schriftelijke, geïnformeerde toestemming. De reagentia en de gebruikte apparatuur in deze studie zijn vermeld in de Materiaalkunde.

1. T-cel isolatie en activatie

  1. PBMC-isolatie
    1. Verzamel bloedmonsters van donoren op ethyleendiaminetetraazijnzuur (EDTA) buizen, breng bloedmonsters over in 50 mL conische buizen en verdun bloed met PBS (verdunning 1:1).
    2. Voeg 15 mL dichtheidsgradiëntmedium toe aan de onderkant van een 50 mL conische buis (dichtheid voor PBMC's: 1,07). Voeg vervolgens zorgvuldig 25 mL verdund bloed toe over de dichtheidsgradiënt medium laag (de langzaamste snelheid van de pipetregelaar). Centrifugeer 30 minuten op 800 × g zonder rem.
    3. Verzamel PBMC's met een Pasteur-pipet in een 50 mL conische buis en voeg PBS toe aan een totaal volume van 50 mL om te wassen. Centrifugeer op 650 × g gedurende 8 minuten. Gooi het supernatant weg.
      OPMERKING: Controleer de troebelheid van het supernatant om zeker te zijn dat er geen cellen aanwezig zijn. Bij twijfel, deel de suspensie in twee keer zoveel kegelvormige buizen van 50 mL als oorspronkelijk, voeg PBS toe tot 50 mL en centrifugeer opnieuw.
    4. Opnieuw opschorten in 50 ml PBS. Tel met acridijn-sinaasappel-propidiumjodide (AOPI) in een celteller. Centrifugeer op 650 × g gedurende 8 minuten.
  2. CD4- en CD8-magnetische selectie
    1. Bereid fluorescentie-geactiveerde celsortering (FACS) buffer voor: PBS, EDTA 2,5 μM, BSA 0,5% en filter door 0,2 μm.
    2. Resuspendeer PBMC's in 80 μL FACS buffer steriel per 10 × 106 cellen en voeg 10 μL microkorrels CD4 en 10 μL microkorrels CD8 per 10 × 106cellen toe. Incubeer 20 minuten op 4 °C.
    3. Voeg 10 mL FACS-buffer toe en centrifugeer 8 minuten bij 650 × g. Gooi het supernatant volledig weg.
    4. Suspensie in 500 μL per 1 × 108 cellen FACS-buffer in een 15 mL conische buis.
      OPMERKING: Een run kan 200 x 10 cellen met6 patronen bevatten.
    5. Gebruik het Possel-programma voor AutoMacs (high-speed magnetic cell sorter) isolatie.
    6. Voeg tot 10 mL PBS op, tel met AOPI in een fluorescentiecelleteller en centrifugeer op 650 × g gedurende 8 minuten.
    7. Resuspendeer cellen 1 x 106/mL in een T-celgroeimedium met 3% menselijk serum (HS), 1% penicilline/streptomycine (P/S), 625 IU/mL interleukine (IL)-7, 85 IU/mL IL-15. Voeg 10 μL T-cel stimulatiereagens per 1 mL toe en meng goed. Plaats 2 mL per put in een 24-put plaat (p24w) en incubeer 24 uur bij 37 °C.

2. CAR T-celproductie en CRISPR-screening

  1. Bibliotheek-splinterie en CAR-transductie
    1. Voeg de overeenkomstige hoeveelheid lentivirus CRISPR-bibliotheek toe (bijv. Brunello Kinome 1-bibliotheek). Zie Aanvullende Tabel 1), bepaald in een titratietest, en 8 μg/mL polybrene.
    2. Spinfecteer door centrifugatie bij 700 x g gedurende 1 uur 30 minuten bij 32 °C.
    3. Vervang media door een vers T-cel groeimedium met 3% HS, 1% P/S, 625 IU/mL IL-7, 85 IU/mL IL-15 (eindcel = 106 cellen/mL).
    4. Voeg na 6 uur de overeenkomstige hoeveelheid CAR-lentivirale vector toe aan een multipliciteit van infectie (MOI) van 3 en incubeer gedurende 4 dagen.
  2. Cas 9-elektroporatie
    1. Verzamel CAR T-cellen, was één keer met PBS en tel cellen met AOPI in een fluorescerende celteller.
    2. Bereid 4 μM Cas9 voor in elektroporatiebuffer.
    3. Resuspendeer CAR T-cellen in 50 μL per 5 × 106 cellen. Meng en voeg zorgvuldig 50 μL celsuspensie toe in elke put van een multiwell cuvettestrip zonder dat er bellen ontstaan. Verwijder vervolgens met een pipettip eventuele belletjes en laat de punt langs de randen van de put lopen.
      OPMERKING: Als er een put in een cuvette zonder monster achterblijft, voeg dan hetzelfde volume elektroporatiebuffer toe. Dit is een cruciale stap: als de machine een verschil in bel of volume detecteert, geeft het een foutmelding.
    4. Gebruik het programma EXPAND T CELL 3 om CAR T-cellen te nucleofecten.
    5. Laat de cellen in de cuvettes 40 minuten in een broedmachine op 37 °C staan.
    6. Sussen de nucleofecten cellen opnieuw in een T-celgroeimedium met 3% HS, 1% P/S, 625 IU/mL IL-7, 85 IU/mL IL-15 (eindcel = 106 cellen/mL) en incubeer bij 37 °C gedurende 3 dagen.
  3. Puromycineselectie
    1. Tel met AOPI in een fluorescerende celteller.
    2. Pas aan op 1 x 106 cellen /mL met T-cel groeimedium dat IL7 en IL15 bevat.
    3. Voeg puromycine (2,5 μg/mL) toe aan het medium.
    4. Tel elke 2 dagen cellen gedurende 6 dagen en pas aan op 1 x 106 cellen /mL met een groeimedium dat 3% HS, 1% P/S, 625 IU/mL IL-7, 85 IE/mL IL-15 en 2,5 μg/mL puromycine bevat.
    5. Controleer % AUTO.
  4. Sorteer CAR T-celpopulaties en bewaar monsters (droge celpellet) bij -80 °C.

3. Isolatie van gDNA

OPMERKING: Vermijd cellen- of gDNA-verlies gedurende het proces, omdat dit de representativiteit van de sgRNA's kan aantasten. Streef naar een sgRNA-dekking van minstens 500x.

  1. Extraheer gDNA uit monsters met behulp van de cellen en de tissue DNA-extractiekit. Elote twee keer om het gDNA-herstel te maximaliseren.
    OPMERKING: Gebruik niet meer dan 4 x 10 cellen van6 cellen per kolom om het gDNA efficiënter te herstellen.
  2. Meet de gDNA-concentratie met de dsDNA-kwantificatiekit.
    OPMERKING: Als de concentratie te laag is voor de volgende stappen in het protocol, gebruik dan vaste-fase reversibele immobilisatie (SPRI) op basis van een parel-gebaseerde schoonmaakreagens om het DNA te concentreren.

4. Verrijking van sgRNA-cassette (en eliminatie van gDNA-overdracht)

  1. Beperkingsenzymdigestie
    1. Verteer maximaal 5 μg gDNA met 20 U van het enzym/s (bijv. voor lentiGuide-puro backbone voor Brunello Kinome 1 bibliotheek gebruik de combinatie NdeI en PspXI) in een totaal volume van 50 μL. Schaal het aantal reacties op om de gewenste sgRNA-representativiteit te bereiken.
      OPMERKING: Selecteer de restrictie-enzymen om de flankerende gebieden van de cassette te snijden, maar houd er rekening mee dat sommige sgRNA's mogelijk een restrictieplaats bevatten. Deze sgRNA's zullen in deze stap verloren gaan en niet zichtbaar zijn in de sequencing. Het ontbreken van deze gids dient als controle van de spijsvertering. Aanvullende Tabel 1 toont een lijst van Kinome 1 sgRNA's die worden gesplitst door PspXI en NdeI.
    2. Broeden 's nachts uit bij 37 °C in een thermocycler.
    3. Voer een 2x SPRI clean-up uit.
      1. Bereid 10 mL Elution Buffer (EB) (10 mM Tris-HCl, pH 8,0) en 50 mL verse 70% ethanol voor.
      2. Draai de kralen in vortex en voeg 100 μL toe aan het product van de vertering.
      3. Meng grondig door te pipetteren en bevrucht 5 minuten. Magnetiseer nog eens 5 minuten.
      4. Voeg tijdens het gebruik van de magneet 200 μL 70% ethanol toe zonder de pellet te verstoren. Wacht 30 seconden, gooi dan het supernatant weg.
      5. Herhaal stap 4.1.3.3 voor in totaal 2 wasbeurten. Laat de kralen 2 minuten drogen.
      6. Haal het van de magneet, voeg 40 μL elutiebuffer toe en suspendeer de kralen opnieuw door te pipetteren. Incubeer 2 minuten.
      7. Magnetiseer 2 minuten en breng het supernatant over naar een nieuwe buis.
        OPMERKING: Controleer bij het instellen van dit protocol voor het eerst de vertering via (capillaire) elektroforese. Zorg ervoor dat er een uitstrijkje wordt gezien.
  2. Pulldown van de sgRNA-cassette.
    1. Bereiding van streptavidine magnetische kralen.
      1. Bereid Wash/Binding Buffer 2x voor: 10 mM Tris-HCl pH 7,5, 2 M NaCl, 1 mM EDTA. Verdun de helft van het volume met H2O tot 1x.
      2. Vortex de kralen 1 minuut.
      3. Breng het gewenste volume kralen over in een buisje (meestal is 1 mg voldoende), voeg een gelijke hoeveelheid Wash/Binding Buffer 1x toe, of minstens 1 mL, en suspensie opnieuw.
      4. Plaats de buis 1 minuut op een magneet en gooi het supernatant weg.
      5. Haal de buis van de magneet en hang de gewassen kralen opnieuw in hetzelfde volume 1x Wash/Binding Buffer als het oorspronkelijke volume kralen uit het flesje.
      6. Herhaal dit voor in totaal 3 wasbeurten.
      7. Zet de kralen opnieuw in 2x was/binding buffer.
    2. Voeg 5 μL van 10 μM pulldownprimers zoals vermeld in Tabel 1 toe aan de gezuiverde vertering vanuit stap 4.1.3.6.
    3. Incubeer 5 minuten in een droog bad op 96 °C en breng het daarna direct 5 minuten op ijs.
    4. Voeg 1 mg voorgewassen streptavidine magnetische kralen toe.
      OPMERKING: Biotine-streptavidine binding werkt het beste bij 1 M NaCl. Zorg ervoor dat je gelijke hoeveelheden kralen en biotinýlerend DNA mengt.
    5. Incubeer 20 minuten terwijl je het mengsel elke 4 minuten opnieuw ophangt.
    6. Magnetiseer 5 minuten.
    7. Was de kralen 3 keer met 1× was-/binddemper.
    8. Suspendeer de kralen opnieuw in 50 μL EB 8.0.
      OPMERKING: De hier gebruikte sgRNA-cassettes zijn gebonden aan de streptavidine-kralen. Gooi ze niet weg.

5. voorbereiding van sgRNA-bibliotheek

  1. PCR1
    1. Bereid een PCR1-mengsel voor met 20 μL Herculase 5x buffer, 1 μL dNTP (100 mM), 1 μL DNA-polymerase, 2,5 μL 10 μM PCR1 voor- en achteruitprimers zoals vermeld in Tabel 1, en 23 μL PCR-kwaliteit water. Pipette mix en voeg PCR1 mix toe aan de kralen vanaf stap 4.2.8.
      OPMERKING: Tabel 1 geeft PCR1-primers die zijn ontworpen voor de Brunello Kinome Library 1.
    2. Plaats de buizen in een thermocycler en voer het programma voor PCR1 uit zoals beschreven in Tabel 2.
      OPMERKING: Zorg dat de thermocycler reacties van 100 μL kan verwerken. Anders aliquot in 50 μL reacties. Schaal op indien nodig.
    3. Verzamel alle PCR1 uit dezelfde monsters in één buis.
    4. SPRI clean-up PCR1 met 150 μL (1,5x) kralen (volg stappen 4.1.3.3-4.1.3.7). Suspenseer elke PCR-reactie opnieuw in 100 μL EB 8.0.
      OPMERKING: Bij het opzetten van dit protocol voor het eerst, verifieer dan de grootte en kwaliteit van het PCR-product door 2 μL van een 30-cyclus PCR-product te draaien in een capillaire elektroforesesysteem (bijvoorbeeld Agilent's TapeStation Systems).
  2. PCR2
    1. Bereid een PCR2-mengsel voor met 10 μL van het product van PCR1, 10 μL 5X buffer, 0,5 μL dNTP (100 mM), 1 μL DNA-polymerase, 1,25 μL 10 μM PCR2-primers voor- en achteruit zoals vermeld in Tabel 1 (gebruik voor elk monster een andere combinatie van rP7-i7-BC en P5-i5-BC), en 26 μL PCR-kwaliteit water voor een totaal volume van 50 μL.
      OPMERKING: Om de bibliotheekrepresentatie te behouden, voer je één PCR2-reactie uit per 10 à4 constructen in de bibliotheek.
    2. Plaats de buizen in een thermocycler en voer het programma voor PCR2 uit zoals beschreven in Tabel 2.
    3. SPRI clean-up PCR2 met 75 μL (1,5x) kralen (volg stappen 4.1.3.3-4.1.3.7). Sussie elke PCR-reactie opnieuw in 50 μL EB 8.0.
  3. Kwantificeer PCR2 (d.w.z. de sgRNA-bibliotheek) met behulp van de dsDNA-kwantificatiekit en verifieer de amplicongrootte met capillaire elektroforese (bijv. TapeStation Systems). Verzamel de monsters.
  4. Sequencen op een Illumina-instrument.
    OPMERKING: Voor de 3052 sgRNA Brunello Kinome 1-bibliotheek hier is een sequencingdiepte van 100-200 miljoen reads per monster doorgaans voldoende.

6. Analyse

  1. Demultiplex-samples met bcl2fastq.
  2. Controleer de kwaliteit van de fastq-bestanden die met FastQC zijn gegenereerd.
  3. Extraheer de sequentie van het sgRNA met als patroon de cassettesequenties die het sgRNA flankeren, evenals de lengte van de geleider (20 nt).
  4. Lijn de sequentie die is uitgerekt uit op de bibliotheekreferentie met Bowtie2 om te controleren hoeveel van de hypothetische gidsen authentiek sgRNA uit de bibliotheek zijn. Gebruik Samtools om het SAM-bestand met informatie over de uitlijning om te zetten naar BAM-formaat en genereer samenvattingsbestanden.
  5. Tel en normaliseer het aantal reads voor elk sgRNA in de bewerkte en controlemonsters met de telfunctie van MAGecK-software.
  6. Vergelijk de tellingen met de testfunctie van MAGecK om de RRA-scores en de lijst van kandidaatgenen te verkrijgen.

Resultaten

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Zoals beschreven in de Protocolsectie werden CAR T-cellen gegenereerd volgens ons vastgestelde protocol26. Voor CRISPR-screening hebben we de workflow aangepast die is ontwikkeld door Wang et al.17 (Figuur 1A). Kort gezegd werden T-cellen van twee onafhankelijke donoren geïsoleerd en geactiveerd gedurende 24 uur voordat ze opeenvolgende transductie met zowel de CRISPR sgRNA-bibliotheek als de CAR-lentivirale vector plaatsvonden, waarbij op dag 5 67 en 72% CAR-positieve cellen werden bereikt. Een fractie van de cellen werd genucleofecteerd met Cas9-eiwit om knock-outs te induceren, terwijl de overige cellen dienden als basis voor sgRNA-representatie. Getransduceerde cellen werden geselecteerd met antibiotica, en vervolgens werden verschillende populaties gesorteerd op basis van de onderzochte fenotypen. De proliferatie van CAR T-cellen werd gedurende het hele scherm gemonitord met behulp van AOPI-gebaseerde celtellingen en tot uiting gebracht als vouwverandering (Figuur 1B). Na puromycinesuppletie op dag 8, 10 en 12 bevestigden we succesvolle verrijking van CAR T-cellen die met de CRISPR-bibliotheek werden getransduceerd bij beide donoren, wat blijkt uit voortgezette overleving en proliferatie. Ongetransduceerde T-cellen (UTD) en CAR T-cellen zonder CRISPR-bibliotheektransductie werden gebruikt als controles voor antibioticaselectie.

Na genomische DNA-extractie werden sgRNA-bibliotheken voorbereid via PCR-amplificatie. Om problemen die ontstonden door overmatige gDNA-overdracht te overwinnen, hebben we een protocol geïmplementeerd waarin de digestie van restrictie-enzymen en de biotine-streptavidine pulldown van de sgRNA-cassette wordt verwerkt (Figuur 2A,B). gDNA werd verteerd met restrictie-enzymen NdeI en PspXI-doellocaties die de sgRNA-cassette flankeren (Figuur 2C). Biotinyleerde oligo's, ontworpen om stroomopwaarts van PCR1-primerannealingplaatsen te binden, werden gebruikt om sgRNA-cassettefragmenten te vangen en vervolgens met streptavidine-kralen naar beneden getrokken om het overgebleven gDNA te elimineren. Fragmenten met sgRNA werden vervolgens selectief geamplificeerd (Figuur 2D) en geïndexeerd via 2 opeenvolgende PCR's.

Bibliotheken van elk monster werden gesequenced met behulp van Next Generation Sequencing (NGS). Na demultiplexing, kwaliteitscontrole en sgRNA-identificatie werden de gegevens geanalyseerd met de MAGeCK-pijplijn. Eerst kwantificeerde en genormaliseerde het telcommando sgRNA-leestellingen in controle- (basale) en Cas9-bewerkte monsters (Figuur 3A,B). Pearson- en Spearman-correlaties geven aan dat de representativiteit van sgRNA tijdens het experiment (donor-gDNA) werd behouden in vergelijking met de plasmidische bibliotheek (Figuur 3C). Vervolgens vergeleek het testcommando beide condities, waarbij robuuste rangaggregatie (RRA) scores aan elk gen werden toegekend (Figuur 3D). Significant verrijkte of uitgeplukte genen werden geïdentificeerd met behulp van drempels van p < 0,05 en log fold change (LFC) > 0,5 (Figuur 3E). Ten slotte werd de verrijkingsanalyse van de route-verrijking van kandidaatgenen uitgevoerd met Metascape, waarbij de belangrijkste genontologietermen werden onthuld die geassocieerd zijn met de geïdentificeerde regulatoren (Figuur 3F).

figure-results-1
Figuur 1: CRISPR-screening in CAR T-cellen. (A) Schema van de CRISPR-screening in CAR T-cellen. (B) Selectie van getransduceerde cellen met puromycine (P). Plasmidische bibliotheken bevatten een puromycineresistentiegen voor positieve selectie. Antibioticum werd op dag 8 aan het medium toegevoegd in niet-getransduceerde monsters van niet-transduceerde (UTD) en CAR T-cellen en transduceerde CAR T-cellen. Monsters zonder puromycine werden gebruikt als controle van proliferatie. Gegevens van twee onafhankelijke donoren worden getoond. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

figure-results-2
Figuur 2: Bibliotheekvoorbereiding voor sgRNA-verrijkingsanalyse. (A) Schema van het protocol voor bibliotheekvoorbereiding. (B) Schema van de relatieve lokalisatie van de snijgroottes van het restrictie-enzym (schaar) en de annealinggebieden van PCR1-primers (pijl) en biotinyleerde primers (pijl met groene stip). (C) Elektroforese van het gDNA vóór en na de RE-digestie. (D) Selectieve verrijking van sgRNA-cassettes na PCR1. Gegevens van twee onafhankelijke donoren uit basale en Cas9-monsters van de twee fenotypen worden getoond. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

figure-results-3
Figuur 3: Gidsverrijkingsanalyse met MAGeCK. (A) Samenvatting van de output van de MAGeCK-tellfunctie. (B) Verdeling van het aantal lees. (C) Pearson- en Spearman-coëfficiënten voor correlatie tussen donor-gDNA en plasmidebibliotheektellingen. (D) Potentieel verrijkte/uitgeputte genen gerangschikt door een gemodificeerde robuuste rangschikkingaggregatie (RRA-score). (E) Vulkaangrafiek toont significante genen (p-waarde < 0,05, LFC > 0,5) in rood. (F) Top-genontologie (GO)-termen na Metascape-routeanalyse van de verrijkte significante genen. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Tabel 1: Volgorde van primers. Klik hier om deze tabel te downloaden.

Tabel 2: PCR-condities. Klik hier om deze tabel te downloaden.

Aanvullende Tabel 1: Lijst van sgRNA in de Kinome 1-bibliotheek en sgRNA's verloren tijdens de vertering met NdeI en PspXI Klik hier om dit bestand te downloaden.

Discussie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

CRISPR-screening is gebaseerd op het principe van single-guide verstoring, wat betekent dat per cel slechts één sgRNA geïntegreerd mag worden. Om dit te bereiken worden sgRNA's doorgaans toegediend via lentivirale vectoren, en moet de multipliciteit van infectie (MOI) zorgvuldig worden gecontroleerd. Een MOI van ca. 0,3 wordt over het algemeen aanbevolen, wat resulteert in een transducatie van 25% tot 30% van de cellen met één viraal deeltje6. Nauwkeurige titratie is daarom essentieel om het benodigde volume virale deeltjes te bepalen. Een andere cruciale stap is het verlies van sgRNA-dekking tijdens het protocol. Celverlies tijdens het oogsten, inefficiënties tijdens gDNA-extractie (namelijk kolomoverbelasting en onvolledige eluatie van DNA), of een overmatige template tijdens PCR-amplificatie kunnen allemaal bijdragen aan dit verlies, waardoor onze sgRNA-analyse vertekend wordt. Wat betreft de biotinyleerde oligo's is het het beste als ze HPLC-gezuiverd zijn om te voorkomen dat vrij biotine dat bij de synthese wordt gebruikt, de streptavidine-kralen verzadigt. Bovendien wordt een 3'-aminomodificator sterk aanbevolen om amplificatie door de biotinyleerde primers bij latere PCR's te voorkomen. Vermijd bij het ontwerpen van deze oligo's ook overlap met PCR1-primers om concurrentie tijdens versterking te voorkomen. Daarnaast vereist bio-informatische analyse zorgvuldige aandacht: sgRNA-extractiepatronen zijn afhankelijk van de plasmidruggengraat (bijv. lentiGuide-puro of lentiCRISPR v2), en de uitlijningsstringentie kan variëren van exacte matching tot enige tolerantie voor mismatches. Bovendien kunnen sommige sgRNA's met restrictieplaatsen verloren gaan, omdat dit protocol een digestiestap bevat, waardoor aanpassing van de referentiebibliotheek vereist is.

In deze studie stellen we een geoptimaliseerd CRISPR-screeningbibliotheekvoorbereidingsprotocol voor dat fragmenten met sgRNA verrijkt via de vertering en, nog belangrijker, een pulldown-stap. Beperkingsenzymdigestie is eerder voorgesteld als een strategie om gDNA-invoer te verminderen en te verrijken voor sgRNA-cassettes27. Evenzo zijn biotinylerende probes op grote schaal toegepast in de moleculaire biologie om specifieke nucleïnezuren of eiwit-nucleïnezuurcomplexen te vangen 28,29,30,31.

Ons protocol bouwt voort op deze principes en past ze aan voor CRISPR-screening in primaire CAR T-cellen, hoewel verschillende beperkingen erkend moeten worden. Ten eerste leggen primaire CAR T-cellen beperkingen op aan de screeningsschaal, omdat hun uitbreidingscapaciteit beperkt is. Om voldoende dekking en sgRNA-representatie te behouden, zijn grote aantallen startcellen nodig. Wanneer dit niet haalbaar is, kunnen kleinere aangepaste bibliothekenworden gebruikt, hoewel dit de breedte van genetisch onderzoek vermindert. Biologische variabiliteit is een andere uitdaging; verschillen tussen donoren worden verwacht, en de overlap van significante treffers is vaak bescheiden17. Ten tweede is de verrijkingsstrategie afhankelijk van de aanwezigheid en positie van snijplaatsen voor het restrictie-enzym. In zeldzame gevallen kunnen deze plaatsen voorkomen binnen sgRNA-sequenties, wat problematischer is voor kleine bibliotheken met beperkte redundantie. De meeste bibliotheken, met name genoom-brede ontwerpen, bevatten echter meerdere sgRNA's per doelwit, waardoor de totale impact van gidsverlies wordt geminimaliseerd. Ten slotte kunnen alternatieve fragmentatie-gebaseerde verrijkingsstrategieën, zoals sonicatie in combinatie met probe capture24, enige flexibiliteit bieden in gevallen waarin de vertering van restrictie-enzymen niet geschikt is.

Over het geheel genomen vertegenwoordigt de sgRNA-cassette slechts een klein deel van het totale genomische DNA in door CRISPR bewerkte cellen, waardoor efficiënte verrijking cruciaal is voor succesvolle bibliotheekvoorbereiding. In vergelijking met standaardprotocollen vermindert onze geoptimaliseerde workflow de overdracht van gDNA en bevordert het PCR-amplificatie van het geïnteresseerde sgRNA. Hoewel de combinatie van gDNA-fragmentatie en biotinylated probe pulldown met streptavidine-kralen conceptueel niet nieuw is, voorkomt de integratie in CRISPR-screening veelvoorkomende PCR-valkuilen en verhoogt het de reproduceerbaarheid van CRISPR-screens. Bovendien zou het opnemen van gestandaardiseerde QC-metrics bij elke belangrijke stap (zoals het na sorteren van T-celzuiverheid, het aandeel puromycineresistente cellen, gDNA-integriteit en CAR-transductie-efficiëntie) de robuustheid en reproduceerbaarheid van de workflow verder verbeteren. Samenvattend, hoewel ontwikkeld in de context van primaire CAR T-cellen en met slechts twee donoren (wat een beperking kan vormen, hoewel meerdere monsters van elke donor zijn gebruikt), kan dit geoptimaliseerde protocol breed toepasbaar zijn op andere CRISPR-screenings en NGS-workflows met grote gDNA-overdrachten.

Openbaarmakingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De auteurs hebben geen belangenconflicten.

Dankbetuigingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Deze studie werd ondersteund door het PID2022-137914OB-I00 project, gefinancierd door MICIU/AEI /10.13039/501100011033 en door FEDER, UE. Deze studie werd ondersteund door het Instituto de Salud Carlos III (ISCIII) via Red de Terapias Avanzadas TERAV en TERAV+ (RD21/0017/0009 en RD24/0014/0010) en via het Centro de Investigacion Biomedica en Red de Cancer CIBERONC (CB16/12/00489). Deze studie werd ondersteund door Gobierno de Navarra Salud (GN2023/08 en GN2024/04) en Proyectos Estratégicos (DIAMANTE 0011-1411-2023-000105 en 0011-1411-2023-000074). Figuur 1B en Figuur 2A zijn gemaakt met BioRender.com

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
4200 TapeStationAgilentG2991A
Acridine OrangeInvitrogenA1301
AMPure XP Beckman CoulterA63881
autoMACS NEO SeparatorMiltenyi130-120-327High-speed magnetic cell sorter
Biotinylated oligosIDT
BSASigmaA9647
Cellometer K2 Fluorescent Cell CounterRevvityCMT-K2-MX-150Fluorescent cell counter
CHT4 Counting ChambersRevvityCHT4-SD100-002
CytoSinct CD4 NanobeadsGenScriptL00863-1
CytoSinct CD8 NanobeadsGenScriptL00864-1
dNTPAgilent200418-51
Dynabeads M-280 StreptavidinInvitrogen11206D
DynaMag-2 magnetInvitrogen12321D
EDTA 0.5 M pH 8.0Invitrogen15575-038
EthanolMerck1,00,98,31,000
ExPERT Atx ElectroporatorMaxCyteExPERT ATx
Ficoll-PaqueCytiva17544203
Filtropur S 0.2 µmSarstedt83,18,26,001
GenCRISPR Ultra NLS-Cas9-ResearchGenScriptZ03621-1
Herculase Buffer 5XAgilent600675-525X buffer
Herculase II Fusion EnzymeAgilent600679-51DNA polymerase
IL-15Miltenyi130-095-765
IL-7Miltenyi130-095-362
Mastercycler X50aEppendorf6313HG006059
MaxCyte Electroporation BufferCytivaEPB1
NdeINew England BiolabsR0111L
Nucleospin TissueMacherey-Nagel74,09,52,250
PBSGibco14190-094
PolybreneMerckTR-1003-6
PrimersThermoFisher
Propidium IodineSigmaP4864
PspXINew England BiolabsR0656S
PuromycinGibcoA11138-03
Qubit 3.0 FluorometerInvitrogenQ33216
Qubit HS DNA assayInvitrogenQ32851
R-50x3 Sterile Well Processing AssemblyMaxCyteLM243882
T Cell TransAct humanMiltenyi130-111-160T cell stimulation reagent
Tape Station HSD1000Agilent5067-5585
TEXMACSMiltenyi130-097-196T cell growth medium
Tris Buffer, 1.0 M, pH 8.0, Molecular Biology GradeEMD Milipore648314
Water, for molecular biology, DNAse, RNAse and Protease freeThermoScientific327390010

Referenties

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Brudno, J. N., Maus, M. V., Hinrichs, C. S. CAR T cells and T-cell therapies for cancer: A translational science review. JAMA. 332 (22), 1924-1935 (2024).
  2. Cappell, K. M., Kochenderfer, J. N. Long-term outcomes following CAR T cell therapy: What we know so far. Nat Rev Clin Oncol. 20 (6), 359-371 (2023).
  3. Cui, K., et al. The challenges and progress of CAR-T cell therapy in the treatment of solid tumors. Mol Cell Biochem. 480 (10), 5345-5367 (2025).
  4. Shah, N. N., Fry, T. J. Mechanisms of resistance to CAR T cell therapy. Nat Rev Clin Oncol. 16 (6), 372-385 (2019).
  5. Redondo-Frutos, R. A., et al. Genetic engineering in CAR T cells for solid tumors: Current state, barriers and future developments. Hum Gene Ther. 36 (17-18), 1138-1153 (2025).
  6. Bock, C., et al. High-content CRISPR screening. Nat Rev Methods Primers. 2 (1), 1-23 (2022).
  7. Shang, W., et al. Genome-wide CRISPR screen identifies FAM49B as a key regulator of actin dynamics and T cell activation. Proc Natl Acad Sci U S A. 115 (17), E4051-E4060 (2018).
  8. Shifrut, E., et al. Genome-wide CRISPR screens in primary human T cells reveal key regulators of immune function. Cell. 175 (7), 1958-1971 (2018).
  9. Chen, Z., et al. In vivo CD8+ T cell CRISPR screening reveals control by Fli1 in infection and cancer. Cell. 184 (5), 1262-1280.e22 (2021).
  10. Belk, J. A., et al. Genome-wide CRISPR screens of T cell exhaustion identify chromatin remodeling factors that limit T cell persistence. Cancer Cell. 40 (7), 768-786.e7 (2022).
  11. Henriksson, J., et al. Genome-wide CRISPR screens in T helper cells reveal pervasive crosstalk between activation and differentiation. Cell. 176 (4), 882-896.e18 (2019).
  12. Gurusamy, D., et al. Multi-phenotype CRISPR-Cas9 screen identifies p38 kinase as a target for adoptive immunotherapies. Cancer Cell. 37 (6), 818-833.e9 (2020).
  13. Wei, J., et al. Targeting REGNASE-1 programs long-lived effector T cells for cancer therapy. Nature. 576 (7787), 471-476 (2019).
  14. Dong, M. B., et al. Systematic immunotherapy target discovery using genome-scale in vivo CRISPR screens in CD8 T cells. Cell. 178 (5), 1189-1204.e23 (2019).
  15. Legut, M., et al. A genome-scale screen for synthetic drivers of T cell proliferation. Nature. 603 (7902), 728-735 (2022).
  16. Ye, L., et al. A genome-scale gain-of-function CRISPR screen in CD8 T cells identifies proline metabolism as a means to enhance CAR-T therapy. Cell Metab. 34 (4), 595-614.e14 (2022).
  17. Wang, D., et al. CRISPR screening of CAR T cells and cancer stem cells reveals critical dependencies for cell-based therapies. Cancer Discov. 11 (5), 1192-1211 (2021).
  18. Yukl, S. A., Kaiser, P., Kim, P., Li, P., Wong, J. K. Advantages of using the QIAshredder instead of restriction digestion to prepare DNA for droplet digital PCR. BioTechniques. 56 (4), 194(2014).
  19. Latham, S., Hughes, E., Budgen, B., Morley, A. Inhibition of the PCR by genomic DNA. PLoS One. 18 (4), e0284538(2023).
  20. Owczarzy, R., Moreira, B. G., You, Y., Behlke, M. A., Wälder, J. A. Predicting stability of DNA duplexes in solutions containing magnesium and monovalent cations. Biochemistry. 47 (19), 5336-5353 (2008).
  21. Sasaki, Y., Miyoshi, D., Sugimoto, N. Effect of molecular crowding on DNA polymerase activity. Biotechnol J. 1 (4), 440-446 (2006).
  22. Seitz, V., Schaper, S., Dröge, A., Lenze, D., Hummel, M., Hennig, S. A new method to prevent carryover contaminations in two-step PCR NGS library preparations. Nucleic Acids Res. 43 (20), e135(2015).
  23. Giuffre, A., et al. Overview of the Agilent Technologies SureSelectTM target enrichment system. J Biomol Tech. 22 (Suppl), S30(2011).
  24. Chen, R., Im, H., Snyder, M. Whole-exome enrichment with the Roche NimbleGen SeqCap EZ Exome Library SR platform. Cold Spring Harb Protoc. 2015 (7), 634-641 (2015).
  25. Horlbeck, M. A., et al. Compact and highly active next-generation libraries for CRISPR-mediated gene repression and activation. eLife. 5, e19760(2016).
  26. Rodriguez-Marquez, P., et al. density influences antitumoral efficacy of BCMA CAR T cells and correlates with clinical outcome. Sci Adv. 8 (39), 514(2022).
  27. Gilbert, L. A., et al. Genome-scale CRISPR-mediated control of gene repression and activation. Cell. 159 (3), 647-661 (2014).
  28. Dash, S., Balasubramaniam, M., Dash, C., Pandhare, J. Biotin-based pulldown assay to validate mRNA targets of cellular miRNAs. J Vis Exp. (136), e57786(2018).
  29. Tsuji, Y. Optimization of biotinylated RNA or DNA pulldown assays for detection of binding proteins: Examples of IRP1, IRP2, HuR, AUF1, and Nrf2. Int J Mol Sci. 24 (4), 3604(2023).
  30. Sui, H., Chen, Q., Imamichi, T. A pulldown assay using DNA/RNA-conjugated beads with a customized competition strategy: An effective approach to identify DNA/RNA binding proteins. MethodsX. 7, 100890(2020).
  31. Chaparian, R. R., van Kessel, J. C. Promoter pulldown assay: A biochemical screen for DNA-binding proteins. Methods Mol Biol. 2346, 165-172 (2021).

Herprints en machtigingen

Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

Toestemming aanvragen

Trefwoorden

CRISPR screeningCas9 editingsgRNA bibliotheekflowcytometrieextractie van genomisch DNArestrictie enzymdigestiepathway enrichmentGene Ontology

Gerelateerde artikelen