We presenteren een protocol om multiomics, Mendeliaanse randomisatie, single-cell transcriptomics en structuurgebaseerde in silico screening te integreren om systematisch de Drebrin-Like (DBNL)-macrofage-as bij hartfalen af te bakenen. Wij stellen DBNL voor als een immunometabolisch doelwit dat met medicijnen kan worden gebruikt.
Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.
Onderzoeksartikel
Moleculaire mechanismen van DBNL bij hartfalen: van het immunometabolisme van macrofagen tot therapeutische implicaties
In dit artikel
Samenvatting
Samenvatting
Hartfalen (HF) blijft een grote wereldwijde gezondheidsuitdaging, met beperkte effectieve behandelingen die gericht zijn op de kernpathofysiologische mechanismen. In deze studie werd een geïntegreerde multiomics-benadering gebruikt die Mendeliaanse randomisatie (MR) combineert met single-cell RNA-sequencing (scRNA-seq) om potentiële biomarkers en therapeutische doelwitten voor HF te identificeren. We maakten gebruik van gegevens uit genoombrede associatiestudies (GWAS's), expressie kwantitatieve eigenschapsloci (eQTLs), methylatie-kwantitatieve eigenschapsloci (mQTL's) en eiwitkwantitatieve eigenschapsloci (pQTL's) om de genetische mechanismen van HF te onderzoeken. Single-cell RNA-sequencing werd uitgevoerd om genexpressie in hartmacrofagen te analyseren, en pseudotijdanalyse werd gebruikt om de dynamische regulatie van DBNL tijdens macrofagendifferentiatie te bestuderen. Moleculaire docking- en dynamicasimulaties identificeerden pirinixinezuur (WY-14643; PubChem CID: 4594; synoniemen: 50892-23-4; WY-14643) als potentiële toezichthouder van DBNL. Multiomics-analyse toonde aan dat DBNL (Drebrin-achtig) een belangrijk gen is dat geassocieerd is met het risico op HF. Single-cell RNA-sequencing toonde aan dat DBNL voornamelijk tot expressie komt in hartmacrofagen en onder pathologische omstandigheden wordt opgereguleerd. De expressie van DBNL door macrofagen is geassocieerd met het immuunmetabolisme en profibrotische routes, met name de IL-6/JAK/STAT3, PI3K/AKT/MTOR en TGF-β signaalwegen. Pseudotime-analyse gaf aan dat DBNL een dynamisch regulerend effect heeft op macrofagendifferentiatie, vooral bij chronische ontsteking. Moleculaire koppeling en dynamische simulaties hebben aangetoond dat pyridinezuur een potentiële rol speelt bij het reguleren van DBNL. Deze studie verduidelijkt de rol van DBNL in de progressie van hartfalen en suggereert het potentieel als therapeutisch doelwit. Belangrijk is dat de therapeutische relevantie wordt afgeleid uit computationele voorspellingen. Deze bevindingen bieden nieuwe inzichten in immuunmetabolisme en macrofaagge-gemedieerde intercellulaire communicatie, waarmee ze een theoretische basis leggen voor toekomstige toepassingen bij de optimalisatie van DBNL-gerichte geneesmiddelen en functioneel onderzoek. Desalniettemin zijn aanvullende experimentele validatie en preklinische studies nodig om de klinische werkzaamheid van DBNL als therapeutisch doelwit te onderbouwen.
Inleiding
Hartfalen (HF) vormt een aanzienlijke en groeiende wereldwijde gezondheidsuitdaging die miljoenen mensen wereldwijd treft en aanzienlijke economische druk legt op zorgsystemen1. Daarom is er een dringende behoefte aan effectieve interventies bij het beheer van hartfalen (HF).
De complexe pathofysiologie van hartfalen ontstaat door een verminderde myocardcontractiliteit van de linkerventrikel, wat leidt tot een kettingreactie van systemische complicaties, zoals pulmonale en perifere congestie2. Het direct aanpakken van de fundamentele pathofysiologische mechanismen die ten grondslag liggen aan de progressie van hartfalen, met name adverse myocardremodellering, blijft echter een cruciale en onopgeloste uitdaging3. In de afgelopen decennia heeft het domein van biomedisch onderzoek een aanzienlijke paradigmaverschuiving ondergaan, voornamelijk mogelijk gemaakt door de integratie van multiomics-technologieën en geavanceerde bio-informaticamethodologieën. Deze instrumenten bieden uitzonderlijke mogelijkheden om nieuwe ziektebiomarkers en therapeutische doelwitten te identificeren. Mendeliaanse randomisatie (MR), een rigoureuze genetische epidemiologische benadering, gebruikt single-nucleotide polymorfismen (SNP's) als instrumentele variabelen om causale relaties tussen genetische blootstelling en klinische uitkomsten af te leiden4. Door het methodologische kader van gerandomiseerde gecontroleerde onderzoeken te hanteren, pakt Mendeliaanse randomisatie (MR) effectief de problemen van confounding en reverse causality aan om robuust bewijs te leveren voor de identificatie en herbestemming van geneesmiddeldoelen. Parallel daaraan onthult single-cell RNA-sequencing (scRNA-seq) weefselheterogeniteit met ongeëvenaarde resolutie, wat diepgaande inzichten biedt in celtype-specifieke genexpressie en intercellulaire communicatienetwerken binnen ingewikkelde organen zoalshet hart. De multiomics-benadering, die genetische, transcriptomische en proteomische gegevens synthetiseert, biedt aanzienlijk potentieel om ziektemechanismen te verduidelijken en therapeutische routes te identificeren.
Ondanks deze technologische vooruitgang blijven er aanzienlijke kennistekorten bestaan over de specifieke cellulaire en moleculaire mechanismen die hartontsteking en hervorming bij hartfalen aansturen. Steeds meer bewijs suggereert dat immuuncellen, met name macrofagen, cruciaal zijn voor het orkestreren van ontstekingsreacties en daaropvolgende weefselremodellering tijdens myocardletsel en chronisch hartfalen, die op hun beurt cruciaal zijn voor de ziekteprogressie6. Eerder onderzoek richtte zich voornamelijk op brede ontstekingsmediatoren of celoppervlaktemarkers, wat resulteerde in een aanzienlijke kloof in de verkenning van intracellulaire regulerende doelen binnen deze cruciale immuuncelpopulaties. Bovendien hebben traditionele genoombrede associatiestudies (GWAS's) talrijke genetische associaties gerelateerd aan hartfalen geïdentificeerd, maar ze ondervinden vaak uitdagingen bij het vaststellen van definitieve causale verbanden en beperken waardoor hun toepasbaarheid voor directe therapeutische translatiebeperkt wordt 7. Daarom is de implementatie van een uitgebreid multiomics Mendelian randomization (MR) framework, dat genetische varianten omvat die DNA-methylering (mQTLs), genexpressie (eQTLs) en eiwitabundantie (pQTLs) beïnvloeden, essentieel om robuustere causale inferenties te bereiken over meerdere biologische regulatielagen. Deze aanpak pakt de inherente beperkingen aan die gepaard gaan met enkellaagse QTL-studies. Opmerkelijk is dat het Drebrin-achtige (DBNL) eiwit onderwerp is geweest van uitgebreid onderzoek in de context van neuronale ontwikkeling en cytoskeletdynamiek8; Echter, de functionele betekenis en het therapeutische potentieel bij hart- en vaatziekten, met name hartfalen, blijven grotendeels onontgonnen. Deze aanzienlijke kloof in ons begrip belemmert de beschouwing van DBNL als een nieuw en potentieel levensvatbaar doelwit voor geneesmiddelontwikkeling in de behandeling van hartfalen.
Om deze kritieke kennistekorten aan te pakken, streeft deze studie ernaar om belangrijke genen die oorzakelijk geassocieerd zijn met het risico op hartfalen robuust te identificeren via een geïntegreerd multiomics MR-kader dat eQTL-, mQTL- en pQTL-gegevens combineert. Deze studie presenteert een nieuwe benadering waarbij multiomics Mendeliaanse randomisatieanalyses worden geïntegreerd – inclusief expressie kwantitatieve eigenschapsloci (eQTLs), methylatie kwantitatieve trait loci (mQTLs) en eiwit kwantitatieve trait loci (pQTLs) – met hoogresolutie single-cell transcriptomic data (GSE161470) en bulk transcriptomic data (GSE161472) om het DBNL-gen systematisch te identificeren als een cruciale causale risicofactor voor hartfalen. Deze bevindingen tonen aan dat DBNL voornamelijk en specifiek tot expressie komt in hartmacrofagen en dat de expressie ervan dynamisch verandert gedurende hun differentiatieproces. Bovendien verduidelijken de resultaten van deze studie de cruciale rol van DBNL bij het moduleren van de micro-omgeving van het hart en het coördineren van door hartfalen geassocieerde immunometabole routes, zoals de IL-6/JAK/STAT3 signaalcascade, evenals profibrotische signaalroutes. Daarnaast voorspelt dit onderzoek, door gebruik te maken van computationele biologische technieken, dat pyridylzuur (WY-14643) een hoogaffiniteitsligand is voor DBNL, waarmee een uitgebreid, multidimensionaal theoretisch kader wordt geboden dat de aanwijzing van DBNL als een nieuw therapeutisch doelwit voor hartfalen ondersteunt en de ontwikkeling van gerichte farmacologische interventies faciliteert. Met behulp van single-cell RNA-sequencing karakteriseerden we de celspecifieke expressie en functionele routes van het sleutelgen DBNL dat in het cardiale micro-milieu is geïdentificeerd, en onderzochten we de rol van DBNL in immunometabole en profibrotische signaalroutes, evenals in cel-cel communicatie tussen hartceltypes. Potentiële kleinmolecuulliganden voor DBNL werden geïdentificeerd via computationele moleculaire koppeling en moleculaire dynamica-simulaties. Wij stellen de hypothese op dat DBNL, dat voornamelijk tot expressie komt in hartmacrofagen, een oorzakelijk effect heeft op de progressie van hartfalen door immunometabole routes en intercellulaire crosstalk te reguleren. Samenvattend hebben we, door geavanceerde multiomics Mendeliaanse randomisatie te integreren met hoogresolutie single-cell analyse, systematisch nieuwe therapeutische doelen voor hartfalen geïdentificeerd en gekarakteriseerd en potentiële kleinmolecuulmodulatordoelen onderzocht.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Protocol
Data Download
Genexpressiegegevens
De single-cell RNA-sequencing (scRNA-seq) gegevens die in deze studie zijn gebruikt, zijn afkomstig uit de Gene Expression Omnibus (GEO) repository die wordt beheerd door het National Center for Biotechnology Information (NCBI) (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/), specifiek uit de dataset met het toegangsnummer9 GSE161470 (menselijk hartweefsel bestaande uit vier controlemonsters en één pathologisch monster). Deze dataset werd oorspronkelijk gepubliceerd door Zhang et al. in 202210. Het primaire doel van het oorspronkelijke onderzoek was het onderzoeken van de cellulaire heterogeniteit en moleculaire regulatiemechanismen in menselijk hartweefsel onder omstandigheden van hartfalen. Voor de huidige analyse werden vijf monsters uit deze dataset geselecteerd, elk bestaande uit uitgebreide single-celexpressieprofielen afgeleid van menselijk hartweefsel. De andere dataset die in deze studie werd gebruikt, werd eveneens verkregen uit de openbare NCBI GEO-repository, specifiek het Series Matrix-bestand dat overeenkomt met accessienummer GSE161472, vergezeld van het annotatiebestand GPL11154. Het expressieprofiel bestaat uit in totaal 84 monsters, waaronder 37 controlemonsters en 47 ziektemonsters. Dit onderzoek omvat een integratieve multiomics-analyse, waarbij alle onderzoeken worden uitgevoerd met behulp van publiek toegankelijke data.
eQTL-gegevens
De eQTL-gegevens, verkregen van het eQTLGen-consortium, richten zich op het ophelderen van het genetische kader van genexpressie in bloed en de genetische factoren die complexe eigenschappen beïnvloeden3. Het consortium is momenteel bezig met de tweede fase van zijn uitgebreide project, waarbij meta-analyses worden uitgevoerd van genoombrede gegevens met betrekking tot bloedgenexpressie.
Blootstellingsgegevens - mQTL's
De mQTL-gegevens zijn verkregen uit een gepubliceerde meta-analyse van de Europese (EUR) cohort, die de methylering van volbloed DNA onderzoekt binnen het genetische kader van 3.701 monsters uit populaties met Europese afkomst11. De dataset bevatte informatie over 426.636 mQTL-eigenschappen.
Blootstellingsgegevens-pQTL
Plasma pQTL-gegevens werden verkregen uit de deCODE-database (https://www.decode.com/summarydata/)4. Deze studie maakte gebruik van de datavrijgave van de deCODE pQTL-dataset uit 2021, die een genoombrede associatiestudie (GWAS) omvatte van plasma-eiwitniveaus gemeten met 4.907 aptameren in een cohort van 35.559 individuen van Europese afkomst.
Uitkomstgegevens
Samenvattende statistieken voor hartfalen werden verkregen uit een grootschalige genoombrede associatiestudie (GWAS) die voornamelijk deelnemers van Europese afkomst betrof, toegankelijk via de database van het European Bioinformatics Institute (EBI) (GCST90162626). De dataset voor hartfalen bevatte 115.150 gevallen en 1.550.331 controles. De GWAS Catalogus, die publicaties, toonaangevende verenigingen en gedetailleerde samenvattende statistieken omvat, biedt momenteel data die zijn gekoppeld aan de Genome Assembly en dbSNP Build.
Mendeliaanse randomisatieanalyse van mQTLs, eQTLs en pQTLs
Om systematisch de mogelijke causale verbanden tussen genexpressie, eiwitabundantie, DNA-methylatieniveaus en het risico op hartfalen te onderzoeken, werden Mendeliaanse randomisatie (MR) analyses uitgevoerd met gebruik van expressie kwantitatieve eigenschapsloci (eQTLs), eiwitkwantitatieve eigenschapsloci (pQTLs) en methylatiekwantitatieve eigenschapsloci (mQTLs). Tijdens de preprocessingfase van de blootstellingsgegevens werden single-nucleotide polymorfismen (SNP's) die aan elke blootstellingsvariabele (gen, eiwit of methylatieplaats zijn gekoppeld) geëxtraheerd uit de respectievelijke databases met een genoombrede significantiedrempel van P < 1 × 10⁻⁵ om als initiële kandidaatinstrumentele variabelen (IV's) te dienen. Vervolgens werd koppelingsdisequilibrium (LD) klontering uitgevoerd voor de IV's van elke blootstellingsfactor met een venstergrootte van 10.000 kilobasen (kb) en een LD R²-drempel van 0,001 om onafhankelijkheid tussen instrumenten te waarborgen. Deze geselecteerde IV's werden vervolgens geharmoniseerd met samenvattende statistieken uit een hartfalen-genoombrede associatiestudie (GWAS; ID: GCST90162626) door gebruik te maken van de read_outcome_data functie, waarbij alleen die SNP's behouden die een associatie P-waarde onder 5×10⁻⁵ vertonen in de uitkomstdataset. Om zwakke instrumentbias te beperken, werd de F-statistiek voor elke IV berekend als F = (β_exposure/SE_exposure)², en werden alleen instrumenten met F > 10 meegenomen in latere analyses. Voor causale effectschatting werd alleluitlijning tussen de blootstellings- en uitkomstdatasets uitgevoerd met behulp van de harmonize_data functie uit het TwoSampleMR-pakket. MR-analyses werden vervolgens uitgevoerd met vier complementaire statistische benaderingen: (1) de inverse variantiegewogen (IVW) methode, die meta-analyses biedt van Wald-ratio-schattingen over SNP's; (2) MR-Egger-regressie, die rekening houdt met directionele pleiotropie door een interceptterm op te nemen onder de Instrument Strength Independent of Direct Effect (InSIDE)-aanname; (3) de gewogen mediaanmethode, die consistente causale schattingen oplevert, zelfs als tot 50% van de instrumenten ongeldig is; en (4) de gewogen modus-methode, die het meest voorkomende causale effectschattingscluster identificeert, met een verbeterde statistische kracht en een verminderde type I-fout ten opzichte van MR-Egger. In gevallen waarin slechts één instrumentele variabele beschikbaar was, werd uitsluitend de Wald-ratiomethode toegepast. Om de robuustheid van de bevindingen te beoordelen, werden uitgebreide sensitiviteitsanalyses uitgevoerd, waaronder heterogeniteitstesten via de mr_heterogeneity-functie, pleiotropiebeoordeling met mr_pleiotropy_test en leave-one-out analyses uitgevoerd via de mr_leaveoneout-functie, waarbij elke SNP iteratief wordt uitgesloten om de invloed van individuele varianten op de totale resultaten te bepalen. Belangrijke associaties werden gevisualiseerd met grafische hulpmiddelen zoals mr_scatter_plot en mr_forest_plot. Deze analytische pijplijn werd uniform toegepast op de eQTL-, pQTL- en mQTL-datasets om methodologische consistentie gedurende het hele onderzoek te waarborgen.
Colocalisatieanalyse
Een colocalisatieanalyse werd uitgevoerd met behulp van de Coloc-methode, eQTL-samenvattingsgegevens en een GWAS van hartfalen5. De index single-nucleotide polymorfisme (SNP) werd gebruikt om de posterior kans binnen een klontervenster van 100 kb te berekenen. In de colocalisatie (coloc) analyse duidt Hypothese H3 de posterieure kans aan dat de twee eigenschappen, namelijk genexpressie en hartfalen, gecorreleerd zijn maar verschillende causale varianten bezitten. Omgekeerd geeft Hypothese H4 de posterior kans aan dat de associatie tussen de twee eigenschappen te wijten is aan een enkele, gedeelde causale variant. Een grens voor SNP. PP. H4 groter dan 0,90 werd gebruikt om colocalisatie te bepalen.
Immuuninfiltratie
De CIBERSORT-methode is een breed gebruikte techniek om immuunceltypen binnen de micro-omgevingte beoordelen. Door gebruik te maken van de principes van ondersteunende vectorregressie kan deconvolutieanalyse van de expressiematrix van immuuncelsubtypes worden uitgevoerd. Door 547 biomarkers te bevatten, kan CIBERSORT 22 fenotypen van menselijke immuuncellen onderscheiden, waaronder T-cellen, B-cellen, plasmacellen en diverse myeloïde celsubpopulaties. Met gebruik van de GSE161472-dataset werd een analyse uitgevoerd met het CIBERSORT-algoritme in combinatie met de geïntegreerde LM22-handtekeningmatrix, die de genexpressieprofielen van 22 verschillende menselijke immuunceltypen karakteriseert. De infiltratieniveaus van deze 22 immuuncelpopulaties werden gekwantificeerd voor elk individueel monster. Vervolgens werd de cor.test-functie toegepast om de correlaties te beoordelen tussen de expressie van sleutelgenen en de bijbehorende infiltratieniveaus van immuuncellen.
Single-cell RNA sequencing dataverwerking en kwaliteitscontrole
De expressieprofielgegevens van één cel werden verwerkt met het Seurat (V4.3.0)-pakket in de R (V4.3.0) omgeving6. Deze studie maakte gebruik van een conventionele workflow voor de analyse van single-cell RNA-sequencinggegevens. Aanvankelijk werden de expressieprofielen geïmporteerd met behulp van het Seurat-pakket. Cellen werden gefilterd op basis van verschillende kwaliteitsmetingen, waaronder het totale UMI-aantal van elke cel, het aantal tot expressie gebrachte genen, het aandeel mitochondriale uitspraken en het aandeel ribosomale uitingen. Uitschieters werden geïdentificeerd als waarden die meer dan drie mediane absolute afwijkingen (MAD's) van de mediaan afwijken. De specifieke filterdrempels waren als volgt: nFeature_RNA ≥ 200, percent.mt ≤ 2,15718, nFeature_RNA ≤ 2840,941 en nCount_RNA ≤ 5194,27. Meestal werden cellen met extreem hoge totale UMI-tellingen en het aantal tot expressie gebrachte genen geclassificeerd als doublets, terwijl cellen met een verhoogd percentage mitochondriale of ribosomale waarden als van lage kwaliteit werden beschouwd, mogelijk apoptose of fragmentatie. Na deze filterstappen werd DoubletFinder (versie 2.0.4) gebruikt om dubbelen afzonderlijk uit elk monster te identificeren en te verwijderen, waarmee het celkwaliteitscontroleproces werd voltooid. Aanvankelijk werd datanormalisatie uitgevoerd met behulp van de normaliseerData-functie. De celcyclusstatus werd vervolgens geëvalueerd via de CellCycleScoring-functie, en zeer variabele genen werden geïdentificeerd met de FindVariableFeatures-methode. De dataset werd vervolgens opgeschaald met behulp van ScaleData om de data te standaardiseren en de invloed van mitochondriale genen, ribosomale genen en celcycluseffecten op downstream-analyses te beperken. Lineaire dimensionaliteitsreductie werd uitgevoerd met hoofdcomponentanalyse (PCA) via de RunPCA-functie, waarbij belangrijke hoofdcomponenten werden geselecteerd voor verdere analyse. Om batcheffecten over verschillende samples aan te pakken, werd het Harmony-algoritme (versie 1.1.0) gebruikt. Deze benadering clustert iteratief vergelijkbare cellen uit verschillende batches binnen PCA-ruimte, terwijl batchdiversiteit binnen clusters behouden blijft. Gezien de relatief milde batcheffecten die in de dataset werden waargenomen, werden standaardparameters (θ = 2) toegepast. Niet-lineaire dimensionaliteitsreductie werd vervolgens uitgevoerd met RunUMAP, gevolgd door het opbouwen van een celbuurtgraaf via FindNeighbors en celclustering via FindClusters. Voor celtype-annotatie werd een hiërarchisch annotatiekader geïmplementeerd: de primaire handmatige annotatie was gebaseerd op karakteristieke genexpressiepatronen die werden geïnformeerd door de CellMarker-database en relevante literatuur; dit werd aangevuld met geautomatiseerde annotatieresultaten verkregen uit de SingleR-software als referentie. Om de nauwkeurigheid en volledigheid van celtypeidentificatie verder te vergroten, werden meerdere gezaghebbende databases geraadpleegd, waaronder de Human Primary Cell Atlas (HPCA), BlueprintEncode, MonacoImmune, DatabaseImmuneCell en NovershternHaematopoietic. Cellannotatie werd uitgevoerd door het opvragen van de CellMarker (http://117.50.127.228/CellMarker/CellMarkerBrowse.jsp)-database en het beoordelen van de literatuur, geholpen door geautomatiseerde annotatieondersteuning van SingleR (V2.4.0) software13. Het heeft als doel de celtypen in het bijbehorende weefsel en hun bijbehorende markergenen14 te identificeren.
Analyse van ligand-receptorinteracties
In deze studie werd CellCall (versie 1.0.7) gebruikt om een uitgebreide analyse uit te voeren van intercellulaire communicatienetwerken15. Door gebruik te maken van celtype-annotaties afgeleid van Seurat naast de ruwe telmatrix, werd een genormaliseerd analyseobject geconstrueerd met parameters die waren geconfigureerd voor het menselijk genoom. De TransCommuProfile-functie werd toegepast om de sterkte van cel-celinteracties te kwantificeren via een gewogen algoritme, waarbij een significantiedrempel van een p-waarde < 0,05 werd toegepast om betrouwbare liganden-receptorparen te identificeren. De significante interactieparen werden vervolgens onderworpen aan KEGG-routeverrijkingsanalyse via de getHyperPathway-functie, en de relaties tussen celtypen en routes werden geïllustreerd met behulp van bubbelgrafieken. Het totale communicatienetwerk werd uiteindelijk weergegeven via een cirkelvormige grafiek, waarin acht verschillende kleuren verschillende celtypen aanduidden. Interactiesterkte en -richting werden weergegeven door pijlvormige kenmerken, die een gedetailleerde karakterisering van intercellulaire signaleringsdynamiek gaven.
Pseudotijdanalyse
Om de dynamische transcriptieregulatie van macrofagen gedurende het verloop van hartfalen te onderzoeken, gebruikte deze studie het Monocle-algoritme om pseudotijdanalyse uit te voeren op macrofagensubpopulaties. De genexpressiematrix die overeenkomt met de doelcelsubpopulaties werd geëxtraheerd om single-cell trajectory analyseobjecten te construeren, waarbij zeer variabele genen als ordeningskenmerken werden geselecteerd. Door gebruik te maken van de DDRTree-dimensionaliteitsreductietechniek werden cellen op een tweedimensionale ruimte gemapt om het differentiatietraject te reconstrueren. Visualisatieanalyses werden uitgevoerd om de verdeling van cellen langs de pseudotijdas te bepalen en om genen te identificeren waarvan de expressie significant veranderde gedurende pseudotijd. Vervolganalyses concentreerden zich op het sleutelgen DBNL en karakteriseerden de expressiedynamiek ervan langs het celtraject, waarbij de transcriptionele herprogrammeringsmechanismen van macrofagen tijdens de progressie van hartfalen werden verduidelijkt16.
Analyse van genensetverrijking (GSEA)
In deze studie werd een GSEA-benadering gebruikt om de regulerende mechanismen te verduidelijken die geassocieerd zijn met belangrijke genen die betrokken zijn bij hartfalen. Met gebruik van eerder geïdentificeerde sleutelgenen werden de monsters gestratificeerd in cohorten met hoge en lage expressie op basis van de mediane expressiewaarde. Differentiële expressieanalyse werd uitgevoerd met behulp van het limma-pakket, waarbij een gerangschikte genenlijst werd gegenereerd op basis van log-fold change (logFC). De daaropvolgende KEGG-routeverrijkingsanalyse werd uitgevoerd met behulp van de clusterProfiler-tool, waarbij gensets afkomstig uit de MsigDB-database als referentieachtergrond dienden. Het GSEA-algoritme werd vervolgens toegepast om signaleringsroutes te identificeren die significant verrijkt waren tussen de twee expressiegroepen, en een aangepaste p-waarde drempel van minder dan 0,05 werd gebruikt om de statistische significantie te bepalen. Om de regulerende functies van de kerngenen binnen kritieke routes te illustreren, werden verschillende visualisatietechnieken gebruikt, waaronder multipathway GSEA-plots en cirkelvormige netwerkdiagrammen.
Genensetvariatie-analyse (GSVA)
GSVA is een niet-parametrische, ongecontroleerde benadering die wordt gebruikt om gensetverrijking binnen transcriptomische data te beoordelen. Deze methode zet variaties op genniveau om in variaties op routeniveau door samengestelde scores voor specifieke gensets te berekenen, wat de evaluatie van biologische functionele veranderingen over verschillende monsters vergemakkelijkt. In de huidige studie werden gensets gehaald uit de Molecular Signatures Database. Het GSVA-algoritme werd gebruikt om samengestelde scores voor elke genset te berekenen, waardoor mogelijke biologische functionele veranderingen over verschillende monsters konden worden geëvalueerd. De resultaten van de GSVA-verrijkingsanalyse zijn opgenomen in het aanvullende materiaal (Aanvullende Tabel 1).
CTD-medicijnvoorspelling
Het doelgen (DBNL) werd ingevoerd in het zoekveld van de Comparative Toxicogenomics Database (CTD), de ziektecategorie "cardiovasculaire ziekte" werd geselecteerd en de zoekopdracht werd uitgevoerd om geneesmiddelvoorspellingsgegevens te verkrijgen die verband houden met de aandoening "hartfalen". De verkregen voorspellingsresultaten werden vervolgens geïmporteerd in Cytoscape-software om datavisualisatie te vergemakkelijken en de constructie van een gen-chemische interactienetwerkkaart mogelijk te maken.
Moleculaire koppelmethoden
Vanwege de onopgeloste driedimensionale kristalstructuur van het menselijke DBNL-eiwit (UniProt ID: Q9UJU6) voorspelde deze studie de driedimensionale structuur van DBNL op basis van AlphaFold317. Pirinixinezuur (WY-14643) is beschikbaar om te downloaden uit de PubChem-database (PubChem CID: 5694). Daarna werd de eiwitstructuur voorbewerkt met MGLTools-software (versie 1.5.7)18, inclusief stappen zoals het toevoegen van waterstofatomen. Tegelijkertijd werden eiwitten en kleine moleculen omgezet in het PDBQT-formaat dat nodig is voor docking. AutoDock Vina-software (versie 1.1.2)19 werd gebruikt voor globale moleculaire koppeling (exogeniciteit=16, num_modes=30) om potentiële bindingsmodi te verkennen. Na voltooiing van de koppelingsberekeningen moet de complexe conformatie met de hoogste affiniteit, aangegeven door de laagste bindingsvrije energie, worden gekozen als beginstructuur voor latere moleculaire dynamica-simulaties.
Moleculaire dynamica simulatiemethode
Om systematisch de bindingsstabiliteit en interactiemechanismen tussen kandidaatverbindingen en eiwitten te onderzoeken, werden conventionele moleculaire dynamica (MD) simulaties uitgevoerd met behulp van het GROMACS-softwarepakket (versie 2024.03)20. De eiwitparameters werden gegenereerd met het Amber14SB krachtveld21, het watermolecuulmodel met het TIP3P-model22, en de ligandtopologieparameters werden gegenereerd met behulp van de Antechamber Python Parser Interface (ACPYPE)-tool, die gebaseerd is op het General Amber Force Field (GAFF). Het ligand-eiwitcomplex systeem werd vervolgens geplaatst binnen een periodieke grens-octaëdrische doos gevuld met TIP3P-watermoleculen. Natrium (Na⁺) en chloride (Cl⁻) ionen werden toegevoegd om een concentratie van 0,15 mol/L te bereiken en de algehele lading van het systeem te neutraliseren. Na voltooiing van de systeemconstructie bestond de eerste stap uit het minimaliseren van de energie met de steilste afdalingsmethode over 50.000 treden, met als doel het elimineren van mogelijk onredelijke conformaties binnen de constructie. Vervolgens werden twee fasen van systeemequilibratie uitgevoerd: een 100 ps NVT (constant particle number, volume and temperature) simulatie, gevolgd door een 100 ps NPT (constant particle number, pressure, and temperature) simulatie. Tijdens deze simulaties werden positionele beperkingen toegepast op de zware atomen van de eiwitruggengraat om de structurele integriteit van het eiwit te behouden. De temperatuur werd op 300 K gehouden met behulp van de V-rescale thermostaat, en de druk werd geregeld op 1 bar door gebruik te maken van de Parrinello-Rahman barostaat voor drukkoppeling. Na voltooiing van de equilibratiefase werd een productiefase-simulatie van 100 nanoseconden uitgevoerd, waarbij alle positionele beperkingen werden geëlimineerd. De baan werd geïntegreerd met een tijdstap van 2 femtoseconden, en de deeltjes-mesh Ewald (PME) methode werd toegepast om nauwkeurig elektrostatische interacties op lange afstand te beheren. De baan werd elke 10 ps opgeslagen en in totaal werden 10.000 frames uitgegeven voor latere analyse. Daarnaast werden stabiele trajecten in het interval van 90-100 ns uit de simulatie geëxtraheerd, en werd de bindingsvrije energie van ligandeiwitcomplexen berekend met behulp van het gmx MMPBSA-instrument23.
Statistische analyse
De geldigheid van deze Mendeliaanse randomisatie (MR) analyse is afhankelijk van drie fundamentele aannames. (1) Relevantie: De instrumentele variabelen (IV's) moeten een sterke associatie vertonen met de blootstelling. (2) Onafhankelijkheid: De IV's moeten onafhankelijk zijn van eventuele verstorende factoren die zowel de blootstelling als het resultaat beïnvloeden. (3) Uitsluitingsbeperking: De IV's moeten de uitkomst uitsluitend beïnvloeden door hun impact op de blootstelling. Een schending van deze aanname, waarbij een IV het resultaat beïnvloedt via routes die niet de blootstelling betreffen, wordt horizontale pleiotropie genoemd. Alle statistische analyses werden uitgevoerd met R-versie 4.3.0, met tweezijdige tests, en een p-waarde van minder dan 0,05 werd over het algemeen beschouwd als een indicatie van statistische significantie.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Resultaten
Identificatie van DBNL als een gen geassocieerd met het risico op hartfalen via Mendeliaanse randomisatie- en colocalisatieanalyse
De uitkomstidentificatie voor steekproeven gerelateerd aan hartfalen, GCST90162626, werd verkregen uit de samenvattende statistiekdataset. Causale relaties tussen 1.247 paren expressie-kwantitatieve eigenschapsloci (eQTL's) en uitkomsten werden bepaald met behulp van de extract_instruments- en extract_outcome_data functies (Aanvullende Tabel 2). Latere Men...
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Discussie
Hoewel ontsteking een fundamenteel aspect vormt van de pathofysiologie van hartfalen (HF), concentreerden eerdere onderzoeken zich voornamelijk op gegeneraliseerde ontstekingsmediatoren en celoppervlakmarkers 17,18,24. Deze focus heeft de opheldering van de specifieke cellulaire mechanismen die betrokken zijn, beperkt. Om deze beperkingen te overwinnen, maakten we gebruik van een integratieve be...
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Openbaarmakingen
De auteurs verklaren dat zij geen concurrerende belangen hebben.
Dankbetuigingen
Dit onderzoeksprogramma werd ondersteund door de Zhejiang Provincial Natural Science Foundation of China (LTGY24H020001), het Project of Science and Technology on Traditional Chinese Medicine in de provincie Zhejiang (2023ZR131, 2023ZL158), het Ningbo Public Welfare Key Project (2024S030), het Key Technology R&D-programma van Ningbo (2022Z149), het Key Laboratory of Precision Medicine for Atherosclerotic Diseases van de provincie Zhejiang (2022E10026), en het Special Fund Project for Clinical Medical Research van de Zhejiang Medical Association (2021ZYC-A11).
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Materialen
| Naam | Bedrijf | Catalogusnummer | Opmerkingen |
|---|---|---|---|
| CellMarker Database | Harbin Medical University (CellMarker 2.0) | http://bio-bigdata.hrbmu.edu.cn/CellMarker/ | CellMarker Database; Voor het opvragen van weefsel/celtype markergenen tijdens single-cell annotatie |
| Comparative Toxicogenomics Database (CTD) | CTD (Duke University et al.) | http://ctdbase.org/ | CTD Database; Voor het ophalen van interacties tussen chemicaliën, genen, fenotypes en ziekten, gebruikt voor medicijnvoorspelling |
| deCODE Plasma pQTL Dataset (2021, 4.907 aptamers, 35.559 Europese monsters) | deCODE genetics | https://www.decode.com/summarydata/ | 2021 pQTL data release; Gebruikt als pQTL blootstellingsgegevens voor MR-analyse |
| eQTLGen Whole Blood eQTL Data | eQTLGen Consortium | https://www.eqtlgen.org/ | eQTLGen fase I/II (specifieke versie naargelang gebruik); Gebruikt als eQTL blootstellingsgegevens voor MR en coloclisatie-analyse |
| GEO Single-cell RNA-seq Dataset GSE161470 (Human Cardiac Tissue: 4 control + 1 pathologisch monster) | NCBI Gene Expression Omnibus (GEO) | https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/query/acc.cgi?acc=GSE161470 | GSE161470; Om single-cell RNA sequencing data van menselijk hartweefsel te verkrijgen voor downstream analyse |
| GWAS Catalog | NHGRI–EBI | https://www.ebi.ac.uk/gwas/ | GWAS Catalog; Om HF-gerelateerde GWAS informatie, annotaties en aanvullende analyse op te halen |
| Heart Failure GWAS Summary Statistics (GCST90162626) | NHGRI–EBI GWAS Catalog | https://www.ebi.ac.uk/gwas/studies/GCST90162626 | Studietoegang: GCST90162626; Gebruikt als resultaatgegevens voor MR en coloclisatie-analyse |
| Molecular Signatures Database (MSigDB) v7.0 | Broad Institute | https://www.gsea-msigdb.org/gsea/msigdb | MSigDB v7.0; Voor GSEA / GSVA achtergrondgenensets en padannotaties |
| Pirinixic acid (WY-14643) Structuurdata (PubChem) | NCBI PubChem | https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/compound/5694 | PubChem CID: 5694; Gebruikt om de 3D-structuur van de ligand te verkrijgen voor moleculaire docking en dynamische simulatie |
| UniProt Protein Database (DBNL, UniProt ID: Q9UJU6) | UniProt Consortium | https://www.uniprot.org/uniprot/Q9UJU6 | UniProt: Q9UJU6; Gebruikt om de aminozuursequentie van DBNL te verkrijgen voor structuurvoorspelling en docking |
| Whole Blood mQTL Meta-Analyse (Ref 11, 3.701 Europese monsters, 426.636 mQTL eigenschappen) | Auteurs / Consortium (volgens jouw referentie 11) | Wacht op auteur om originele database URL / DOI toe te voegen | Referentie DOI of Dataset ID; Gebruikt als mQTL blootstellingsgegevens voor MR-analyse |
Referenties
- Darvish, M., et al. Heart failure: Assessment of the global economic burden. Eur Heart J. 46 (31), 3069-3078 (2025).
- Giambartolomei, C., et al. Bayesian test for colocalisation between pairs of genetic association studies using summary statistics. PLoS Genet. 10 (5), e1004383(2014).
- Ferkingstad, E., et al. Large-scale integration of the plasma proteome with genetics and disease. Nat Genet. 53 (12), 1712-1721 (2021).
- Yang, M., et al. No evidence of a genetic causal relationship between ankylosing spondylitis and gut microbiota: A two-sample mendelian randomization study. Nutrients. 15 (4), 1057(2023).
- Lee, D. S., et al. Simultaneous profiling of 3D genome structure and DNA methylation in single human cells. Nat Methods. 16 (10), 999-1006 (2019).
- Martini, E., et al. Single-cell sequencing of mouse heart immune infiltrate in pressure overload-driven heart failure reveals extent of immune activation. Circulation. 140 (25), 2089-2107 (2019).
- van der Ende, M. Y., Said, M. A., van Veldhuisen, D. J., Verweij, N., van der Harst, P. Genome-wide studies of heart failure and endophenotypes: Lessons learned and future directions. Cardiovasc Res. 114 (9), 1209-1225 (2018).
- Inoue, S., et al. Drebrin-like (Dbnl) controls neuronal migration via regulating N-cadherin expression in the developing cerebral cortex. J Neurosci. 39 (4), 678-691 (2019).
- Luo, X., et al. Chamber-enriched gene expression profiles in failing human hearts with reduced ejection fraction. Sci Rep. 11 (1), 11839(2021).
- Lingscheid, T., et al. Pharmacokinetics of nirmatrelvir and ritonavir in COVID-19 patients with end-stage renal disease on intermittent hemodialysis. Antimicrob Agents Chemother. 66 (11), e0122922(2022).
- Hatton, A. A., et al. Genetic control of DNA methylation is largely shared across European and East Asian populations. Nat Commun. 15 (1), 2713(2024).
- Bense, R. D., et al. Relevance of tumor-infiltrating immune cell composition and functionality for disease outcome in breast cancer. J Natl Cancer Inst. 109 (1), djw192(2017).
- Hu, C., et al. CellMarker 2.0: An updated database of manually curated cell markers in human/mouse and web tools based on scRNA-seq data. Nucleic Acids Res. 51 (D1), D870-D876 (2023).
- Aran, D., et al. Reference-based analysis of lung single-cell sequencing reveals a transitional profibrotic macrophage. Nat Immunol. 20 (2), 163-172 (2019).
- Zhang, Y., et al. CellCall: integrating paired ligand-receptor and transcription factor activities for cell-cell communication. Nucleic Acids Res. 49 (15), 8520-8534 (2021).
- Trapnell, C., et al. The dynamics and regulators of cell fate decisions are revealed by pseudotemporal ordering of single cells. Nat Biotechnol. 32 (4), 381-386 (2014).
- Abramson, J., et al. Accurate structure prediction of biomolecular interactions with AlphaFold 3. Nature. 630 (8016), 493-500 (2024).
- Morris, G. M., et al. AutoDock4 and AutoDockTools4: Automated docking with selective receptor flexibility. J Comput Chem. 30 (16), 2785-2791 (2009).
- Trott, O., Olson, A. J. AutoDock Vina: Improving the speed and accuracy of docking with a new scoring function, efficient optimization, and multithreading. J Comput Chem. 31 (2), 455-461 (2010).
- Abraham, M. J., et al. GROMACS: High performance molecular simulations through multi-level parallelism from laptops to supercomputers. SoftwareX. 1, 19-25 (2015).
- Hornak, V., Abel, R., Okur, A., Strockbine, B., Roitberg, A., Simmerling, C. Comparison of multiple Amber force fields and development of improved protein backbone parameters. Proteins. 65 (3), 712-725 (2006).
- Zahn, D., Schilling, B., Kast, S. M. Enhancement of the wolf damped coulomb potential: Static, dynamic, and dielectric properties of liquid water from molecular simulation. J Phys Chem B. 106 (41), 10725-10732 (2002).
- Valdés-Tresanco, M. S., Valdés-Tresanco, M. E., Valiente, P. A., Moreno, E. gmx_MMPBSA: A new tool to perform end-state free energy calculations with GROMACS. J Chem Theory Comput. 17 (10), 6281-6291 (2021).
- Davis, A. P., Wiegers, T. C., Johnson, R. J., Sciaky, D., Wiegers, J., Mattingly, C. J. Comparative toxicogenomics database (CTD): Update 2023. Nucleic Acids Res. 51 (D1), D1257-D1262 (2023).
- Stiber, J. A., et al. The actin-binding protein drebrin inhibits neointimal hyperplasia. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 36 (5), 984-993 (2016).
- Liu, N., et al. HIP-55/DBNL-dependent regulation of adrenergic receptor mediates the ERK1/2 proliferative pathway. Mol Biosyst. 10 (7), 1932-1939 (2014).
- Bai, Y., et al. Identification of drug targets for Sjögren's syndrome: Multi-omics Mendelian randomization and colocalization analyses. Front Immunol. 15, 1419363(2024).
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Herprints en machtigingen
