Ontstekingsremmende effecten van sesquiterpenelactonen van Eupatorium lindleyanum DC. in Rodent Models

Samenvatting

Deze studie toont aan dat sesquiterpeenlactonen afkomstig zijn van Eupatorium lindleyanum DC. (SLEL) hebben significante ontstekingsremmende effecten in xyleen-geïnduceerde muizenooroedeem en carrageenaan-geïnduceerde rattenpoot-oedeem door histopathologische schade te verlichten, de afgifte van cytokines te verminderen en de activatie van NF-κB-signalering te remmen.

Samenvatting

Acute ontsteking is een fundamenteel pathologisch proces dat betrokken is bij veel immuungerelateerde ziekten. Eupatorium lindleyanum DC., een traditioneel medicinaal kruid, is rijk aan sesquiterpeenlactonen (SLEL), waarvan is gerapporteerd dat ze farmacologische activiteit vertonen; hun ontstekingsremmende effecten en bijbehorende moleculaire veranderingen blijven echter onvolledig gekarakteriseerd. In deze studie werden acute ontstekingsreacties geïnduceerd in een xyleen-geïnduceerd muizenooroedeem en een carrageenaan-geïnduceerd rattenpoot-oedeemmodel. Weefselbeschadiging en ontstekingsinfiltratie werden beoordeeld met hematoxyline- en eosine kleuring. De niveaus van pro-inflammatoire cytokines (TNF-α, IL-6 en IL-1β) werden gekwantificeerd in serum met ELISA, en hun transcriptie-expressie in ontstoken weefsels werd geanalyseerd met kwantitatieve PCR (qPCR). Veranderingen in NF-κB-route-geassocieerde eiwitten, waaronder gefosforyleerd IκBα en p65, werden geëvalueerd met western blotting. SLEL-behandeling verminderde oedeem in oor en poot en verlichtte histopathologische kenmerken van acute ontsteking, waaronder weefseloedeem, inflammatoire celinfiltratie en vasculaire congestie. Tegelijkertijd was SLEL-toediening geassocieerd met een lagere serumspiegel en weefsel-mRNA-expressie van Tnf-α, Il-6 en Il-1β. Western blot-analyse toonde verminderde fosforylering van IκBα en p65 in ontstoken weefsels na SLEL-behandeling, wat wijst op modulatie van NF-κB-gerelateerde signaalgebeurtenissen. Samen tonen deze bevindingen een experimentele workflow aan voor het evalueren van de ontstekingsremmende activiteit van SLEL in acute ontstekingsmodellen en suggereren dat de effecten geassocieerd zijn met verminderde pro-inflammatoire cytokineexpressie en veranderde NF-κB-route-gerelateerde signalering.

Inleiding

Ontsteking is een complexe verdedigingsreactie die wordt getriggerd door pathogene invasie of weefselbeschadiging en speelt een cruciale rol bij het beperken van infecties, het elimineren van schadelijke prikkels en het bevorderen van weefselherstel¹. Hoewel gecontroleerde ontstekingsreacties essentieel zijn voor het behoud van weefselhomeostase, kan overmatige of aanhoudende ontsteking leiden tot weefselschade, orgaandisfunctie en de progressie van chronische ziekten. Klinisch wordt ontsteking gekenmerkt door roodheid, zwelling, hitte en pijn, en kan in ernstige gevallen leiden tot systemische pathologische reacties. Steeds meer bewijs heeft ontregelde ontstekingen in verband gebracht met het ontstaan van kanker, hart- en vaatziekten en auto-immuunziekten²˒³.

Niet-steroïde ontstekingsremmers (NSAID's) zijn momenteel de meest gebruikte middelen voor ontstekingsbeheersing. Ondanks hun effectiviteit bij het verlichten van symptomen wordt langdurig gebruik van NSAID's vaak geassocieerd met bijwerkingen, waaronder gastro-intestinale irritatie, overgevoeligheidsreacties en hepatotoxiciteit⁴, die hun klinische toepasbaarheid beperken. Als gevolg hiervan groeit de interesse in het identificeren van alternatieve ontstekingsremmende middelen met verbeterde veiligheidsprofielen. Natuurlijke producten, waaronder traditionele kruidengeneesmiddelen, zijn onderzocht als potentiële bronnen van bioactieve verbindingen met immunomodulerende eigenschappen. Gegeneraliseerde claims over lage toxiciteit of systemische regulerende functies moeten echter voorzichtig worden geïnterpreteerd en vereisen experimentele validatie in gedefinieerde ziektemodellen⁵.

Eupatorium lindleyanum DC. is een traditionele medicinale plant waarvan de kenmerkende fytochemicaliën sesquiterpeenlactonen omvatten, voornamelijk guaianolid- en eudesmanolide-type verbindingen, samen met germacranoliden en xanthanoliden⁶. Extracten van Eupatorium lindleyanum DC. Er is gerapporteerd dat ze lipidenverlagende, anti-atherosclerotische, antitumor- en ontstekingsremmende activiteiten vertonen in diverse experimentele omgevingen⁶. In het bijzonder ethanolextracten van Eupatorium lindleyanum DC. hebben beschermende effecten aangetoond in lipopolysaccharide (LPS)-geïnduceerde acute longbeschadiging modellen⁷. De ontstekingsremmende activiteit van SLEL en de effecten ervan in klassieke acute ontstekingsmodellen zijn echter onvoldoende gekarakteriseerd.

Om deze kloof te dichten, gebruikten we twee complementaire modellen voor acute ontsteking: xyleen-geïnduceerd ooroedeem bij muizen, dat snelle neurogene en vasculaire ontstekingsreacties vastlegt, en carrageenaan-geïnduceerde pooedeem bij ratten, een goed gevestigd model dat tijdsafhankelijke acute ontsteking weerspiegelt waarbij cytokineproductie en cellulaire infiltratie betrokken zijn. Alternatieve modellen, zoals door LPS geïnduceerde systemische ontsteking, werden niet geselecteerd vanwege hun nadruk op systemische immuunactivatie in plaats van gelokaliseerde weefseloedeem en hun beperkte geschiktheid voor gepaarde histologische en moleculaire analyses op weefselniveau⁸.

Met deze gecombineerde modelstrategie werden ontstekingsresponsen geëvalueerd via kwantitatieve oedemmetingen, histopathologische beoordeling met hematoxyline- en eosinekleuring (H&E), serumcytokineprofilering, transcriptieanalyse op weefselniveau en eiwitveranderingen geassocieerd met NF-κB. Dit protocol is bijzonder geschikt voor het screenen van ontstekingsremmende werking bij acute ontsteking, waarbij oedemvorming, cytokineexpressie en pathway-geassocieerde moleculaire uitlezingen van belang zijn. Desalniettemin moeten de beperkingen van acute modellen worden erkend, waaronder beperkte extrapolatie naar chronische ontstekingsaandoeningen en interpretatieve grenzen bij het afleiden van causaliteit uit veranderingen in signalering op weefselniveau.

Gezamenlijk benadrukt deze studie een protocol-gedreven benadering die complementaire modellen voor acute ontsteking integreert met gekoppelde histologische en moleculaire analyses, en zo een reproduceerbaar kader biedt voor het evalueren van het ontstekingsremmende potentieel van kruidenafgeleide verbindingen.

Protocol

Het dieronderzoeksprotocol werd goedgekeurd door het Institutioneel Comité voor Dierenzorg en Gebruik van de Chongqing Medische Universiteit (IACUC-CQMU-2025-10073).

Bereiding van sesquiterpeenlacton-verrijkte fractie (SLEL)

Gedroogde medicinale materialen van Eupatorium lindleyanum DC. werden verpulverd en twee keer onderworpen aan refluxextractie met 70% (v/v) ethanol onder verminderde druk. Elke extractie werd uitgevoerd met een oplosmiddel-materiaalverhouding van 10:1 (v/w) gedurende 2 uur. De gecombineerde extracten werden gefilterd, geconcentreerd onder verminderde druk bij ≤60 °C, en vervolgens vacuüm gevriesdroogd om het ruwe ethanolextractpoeder te verkrijgen.

Het gedroogde extract werd volledig opgelost in gedestilleerd water (eindconcentratie: 100 mg/mL) en sequentieel onderworpen aan polyamidharschromatografie, gevolgd door D101 macroporeuze adsorptieharschromatografie om sesquiterpenelactonen te verrijken. Nadat het adsorptieevenwicht was bereikt, werd de D101-hars gewassen met gedestilleerd water om polaire onzuiverheden te verwijderen en vervolgens geëlueerd met watervrij ethanol. Na ethanolelusie werd de verzamelde fractie onder verminderde druk geconcentreerd en onderworpen aan vriesdrogen om de SLEL-fractie te produceren, die tot gebruik bij −20 °C werd opgeslagen.

De scheiding werd bereikt op een UPLC-platform met een binair mobiel fasesysteem van acetonitril en 0,1% (v/v) mierenzuur in water. Het gradiëntprogramma bestond uit een initiële isocratische pauze van 25 minuten bij een laag organisch gehalte, een korte lineaire opbouw naar 70% acetonitril, een fase met een hoge organische stap bij 90% acetonitril, en een laatste evenwichtsstap die terugkeerde naar de startomstandigheden. Het systeem werd bediend op 0,25 mL·min⁻¹ met een kolomtemperatuur van 35 °C en een injectievolume van 0,1 μL (Aanvullende Figuur S1).

Dieren

In totaal werden 36 mannelijke Sprague–Dawley-ratten (200 ± 20 g) en 36 mannelijke BALB/c-muizen (20 ± 2 g) gebruikt in deze studie. De dieren werden gehuisvest onder gestandaardiseerde omstandigheden (22 ± 2 °C, 55 ± 5% luchtvochtigheid, 12 uur licht/donker cyclus) met vrije toegang tot voedsel en water. De dieren werden 7 dagen geacklimatiseerd voorafgaand aan de experimenten en dagelijks gecontroleerd op algemene gezondheid. Alle procedures werden uitgevoerd om het lijden van dieren te minimaliseren, en er werd verdoving toegediend voorafgaand aan bloedafname en weefseloogst.

Xyleen-geïnduceerd ooroedeem bij muizen

Het model van muizenooroedeem werd vastgesteld zoals eerder beschreven⁹. Na acclimatisatie werden muizen willekeurig ingedeeld in zes groepen (n = 6 per groep): controlegroep (CG), model (MG), dexamethason (DEX, 10 mg/kg) en SLEL lage dosis (75 mg/kg), middelmatige dosis (150 mg/kg) en hoge dosis (300 mg/kg) groepen. Alle behandelingen werden eenmaal per dag toegediend via orale gavage gedurende 7 opeenvolgende dagen (einddosering: 10 mL/kg). 1,5 uur na de laatste toediening werd ontsteking opgewekt door 30 μL xyleen gelijkmatig aan te brengen op beide oppervlakken van het rechteroor, behalve in de controlegroep. Dertig minuten later werden muizen verdoofd, werden bloedmonsters genomen en werden 8 mm ronde oorstoten genomen uit identieke anatomische posities van beide oren.

Carrageen-geïnduceerde pooedeem bij ratten

Het rattenpootedeem werd ontwikkeld met behulp van carrageen zoals eerder beschreven¹⁰. Ratten werden willekeurig ingedeeld in zes groepen (n = 6 per groep): CG, MG, DEX (5 mg/kg) en SLEL lage dosis (50 mg/kg), middelmatige dosis (100 mg/kg) en hoge dosis (200 mg/kg) groepen. De behandelingen werden eenmaal dagelijks toegediend gedurende 7 dagen (10 mL/kg). De basisvolumes van de poot werden gemeten vóór de laatste dosering. Dertig minuten na de laatste toediening werd 0,1 mL van 1% (w/v) carrageenaanoplossing subcutaan in het plantaire oppervlak van de rechterachterpoot geïnjecteerd. De pootvolumes werden gemeten 1, 2, 3 en 4 uur na injectie met behulp van een plethysmometer. Pooedeem werd berekend als:

Pooedeem (%) = (Vt − V0) / V0 × 100%

Histologisch onderzoek

Oor- en pootweefsels werden direct na functionele beoordelingen verzameld. Weefsels werden gefixeerd in 10% neutraal gebuffreerde formaline gedurende 72 uur bij kamertemperatuur, ingebed in paraffine, gesneden (5 μm) en gekleurd met H&E volgens standaardprotocollen¹¹.

Enzym-gekoppelde immunosorbent-assay (ELISA)

Serummonsters werden verkregen door centrifugatie bij 3.000 × g gedurende 10 minuten bij 4 °C. Niveaus van TNF-α, IL-6 en IL-1β werden gekwantificeerd met commercieel verkrijgbare ELISA-kits volgens standaardprotocollen.

Western blot-analyse

Totale eiwitextracten werden bereid uit oor- en pootweefsel met behulp van een RIPA-lysebuffer, aangevuld met protease- en fosfataseremmers. Eiwitconcentraties werden gekwantificeerd met een BCA-assay, en gelijke hoeveelheden eiwit (30 μg per monster) werden opgelost met SDS-PAGE en overgedragen op PVDF-membranen. De membranen werden 1 uur bij kamertemperatuur geblokkeerd met 5% magere melk, gevolgd door incubatie met primaire antilichamen bij 4 °C 's nachts en HRP-geconjugeerde secundaire antistoffen gedurende 1 uur bij kamertemperatuur. Immunoreactieve banden werden gedetecteerd met verbeterde chemiluminescentie en gekwantificeerd met ImageJ-software.

Kwantitatieve real-time PCR (qRT-PCR)

Totaal RNA werd geïsoleerd uit oor- en pootweefsels met behulp van het RNA-extractie-reagens dat in de Materiaaltabel is vermeld. Eén microgram totaal RNA werd reverse-getranscribeerd in cDNA met behulp van een commerciële reverse transcriptiekit volgens de instructies van de fabrikant. Kwantitatieve PCR werd uitgevoerd met behulp van SYBR Green-chemie met genspecifieke primers (Tabel 1) in een reactievolume van 10 μL onder een tweestaps-amplificatieprotocol. Gedetailleerde reverse-transcriptiecondities en PCR-cyclusparameters zijn te vinden in de Protocolsectie. Relatieve transcriptniveaus werden berekend met de 2^{⁻ΔΔCT-methode} , waarbij Gapdh als interne referentiegen werd gebruikt.

Data- en statistische analyse

De gegevens worden uitgedrukt als gemiddelde ± SD. Statistische vergelijkingen tussen twee groepen werden uitgevoerd met een ongepaarde Student's t-test, terwijl eenrichtings-ANOVA werd toegepast op analyses met meer dan twee groepen. Statistische significantie werd gedefinieerd als p < 0,05. Significantie wordt aangegeven als # p < 0,05 en ## p < 0,01 tegenover de controlegroep (CG), en * p < 0,05 en ** p < 0,01 tegenover de modelgroep (MG).

Resultaten

Chemische samenstelling in SLEL tot en met UPLC-Q/TOF/MSn

Het chemische profiel van SLEL werd onderzocht met UPLC-Q/TOF-MSn in positieve en negatieve ionenmodi. Negen sesquiterpeenlactonen werden geïdentificeerd als overheersende bestanddelen (Aanvullende Figuur S1). Moleculaire formuletoewijzingen werden afgeleid van waargenomen adductionen, waaronder [M+H]⁺ en [M+Na]⁺ in positieve modus, evenals [M−H]⁻ en [M+HCOO]⁻ in negati...

Discussie

In deze studie werden sesquiterpeenlactonen van Eupatorium lindleyanum DC toegepast. (SLEL) werden geëvalueerd met behulp van twee gevestigde modellen voor acute ontsteking, namelijk xyleen-geïnduceerd ooroedeem bij muizen en carrageen-geïnduceerde pooedeem bij ratten. Door histopathologische scoring, serumcytokinemetingen, mRNA-kwantificering op weefselniveau en eiwitniveau-signaleringsmetingen te integreren, biedt dit protocol een meerlaagse karakterisering van lokale en syste...

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
anti GAPDH	ImmunoWay	YN5585
anti IκBα	Cell Signaling Technology	4812
anti P65	Abmart	TA5006
anti p-IκBα	Cell Signaling Technology	2859
anti p-P65	Abmart	TP70621
BCA	Beyotime Biotechnology Co., Ltd	P10010
IL-1β kit	Xiamen Huijia Biotechnology Co., Ltd	EHJ-20537r
IL-6 kit	Xiamen Huijia Biotechnology Co., Ltd	EHJ-20746r
Micropipette	Eppendorf
Microplate reader	Gene Co., Ltd	Odyssey Fc
PVDF	Millipore	IPVH00010
Reverse transcription kit	MedChemExpress	HY-K051A
RIPA buffer	Beyotime Biotechnology Co., Ltd	P0013B
SYBR Green Mastermix	MedChemExpress	HY-K0522
TNF-α kit	Xiamen Huijia Biotechnology Co., Ltd	EHJ-20039r
TRIzol	Thermo Fisher Scientific	15596018CN
Ultra-low temperature freezer	SANYO