Een multilabel Single Molecule Localization Microscopieprotocol voor het Onderzoek van Chromatine in de dichte nucleaire omgeving

Summary

We presenteren een driekleurig chromatine single molecule localization microscopy (SMLM) kleurings- en analyseprotocol dat reproduceerbare mapping van euchromatine, heterochromatine en RNAP II mogelijk maakt voor ruimtelijke analyse. Dit protocol maakt efficiënte meerkleurige etikettering mogelijk in dichte nucleaire omgevingen, inclusief chromatine-geassocieerde doelen, waardoor betrouwbare gelijktijdige detectie mogelijk is.

Abstract

Superresolutiemicroscopie heeft ons vermogen om biologische structuren voorbij de diffractiegrens te onderzoeken aanzienlijk verbeterd, waardoor het onmisbaar is voor het bestuderen van dicht opeengepakte kernstructuren zoals chromatine, nucleaire lamina en nucleaire lichamen zoals nucleoli. Chromatine vertoont multischaalorganisatie – van nanometergrote nucleosomen tot micron-domeinen – wat beeldvormingsmethoden vereist die zowel hoge resolutie als moleculaire specificiteit kunnen bieden. Single molecule localization microscopie (SMLM), met name stochastische optische reconstructiemicroscopie (STORM), maakt nauwkeurige mapping van epigenetische markeringen mogelijk, wat cruciale inzichten biedt in chromatinestructuur en -functie. Multi-label beeldvorming in de nucleaire omgeving brengt echter unieke uitdagingen met zich mee, waaronder verminderde toegankelijkheid van antilichamen, verhoogde niet-specifieke binding en fluorofoorinstabiliteit. Om deze problemen aan te pakken, presenteren we een sequentieel immunolabelingprotocol dat is geoptimaliseerd voor nucleaire omgevingen met hoge dichtheid, waardoor robuuste driekleurige SMLM mogelijk is met minimale crosstalk en minder signaaldegradatie. Deze methode omvat geoptimaliseerde bufferformuleringen, fluoroforselectie en antilichaamvalidatiestrategieën om reproduceerbare, hoogwaardige labeling over meerdere doelen te waarborgen. Belangrijk is dat we dit protocol integreren met een computationele analysepijplijn die lokalisaties van één moleculair doel gebruikt als ruimtelijke ankers (seed points) om afstanden tussen doelen, lokale dichtheden en multi-label co-affiniteit te kwantificeren. Dit maakt een gedetailleerde ruimtelijke analyse van chromatinecomponenten op nanoschaal mogelijk. Dit protocol dient als een reproduceerbaar kader voor multicomponentele beeldvorming en kwantitatieve analyse in dichte subcellulaire omgevingen, en biedt een krachtig hulpmiddel voor onderzoekers die complexe nucleaire architecturen zoals chromatine onderzoeken.

Introduction

De komst van single-molecule localization microscopy (SMLM) heeft ongekende verkenning van biologische structuren op nanometerschaal ^1,2,3,4,5 mogelijk gemaakt. Naast enkelvoudige doelbeeldvorming heeft de uitbreiding naar meerkleurige SMLM het veld verder ontwikkeld door gelijktijdige visualisatie van meerdere moleculaire soorten mogelijk te maken, evenals de ruimtelijke en temporele relaties tussen subdiffractiestructuren 6,7,8,9,10,11 . Het toepassen van gemultiplexed SMLM op overvloedig verspreide histonmodificaties blijft echter uitdagend vanwege de dichte, polymere aard van nucleair DNA en de beperkte toegankelijkheid van antilichamen binnen ^{deze omgeving.}

Chromatine vertoont een hiërarchische, multiscale organisatie die zich uitstrekt over meerdere groottes van lengte, van nanometer-schaal nucleosoomassemblages tot micrometer-schaal nucleaire architectuur. Op de grootste schalen bezetten chromosomen aparte chromosoomterritoria, waarbinnen het genoom verder wordt verdeeld in A/B-compartimenten en topologisch geassocieerde domeinen (TAD's) die langeafstandsreguleringsinteracties beperken via mechanismen zoals lusextrusie ^19,20,21,22. Op sub-200 nm-schalen is chromatine georganiseerd als een ongeordend polymeer dat bestaat uit heterogene pakdomeinen (PD's) in plaats van discrete euchromatine- en heterochromatineblokken, waarbij transcriptie-actieve gebieden bij voorkeur lokaliseren op PD-grenzen 23,24,25,26,27,28,29 . Op de kleinste schalen (5-20 nm) bestaat chromatine uit onregelmatige nucleosoomassemblages en nucleosoomkoppelingen, wat het ontbreken van een uniform hogere-orde vouwmotief benadrukt en de opkomende, schaalafhankelijke aard van genoomorganisatie 24,26,30 benadrukt. Met de snelle vooruitgang van sequencing-gebaseerde benaderingen zoals chromatine-immunoprecipitatiesequencing en high-throughput chromatine conformation capture 19,30,31,32,33^, zijn verschillende kenmerken van chromatine mesoschaal organisatiestructuren geïdentificeerd^31,32. Deze technieken slagen er echter niet in ruimtelijke geometrie vast te leggen die pas wordt waargenomen na het oplossen van deze structuren. Elektronenmicroscopiemethoden zoals chromatine-elektronenmicroscopie (ChromEM²⁴) en chromatinescanning transmissie-elektronenmicroscopie (ChromSTEM²⁵) hebben aangetoond dat chromatine heterogeen is en georganiseerd in pakdomeinen op lengteschalen van 50-200 nm^{25, 28, 29}. Hoewel deze technieken een indrukwekkende resolutie mogelijk maken om chromatine-pakdomeinen te identificeren, kunnen ze geen moleculair specifieke mapping bieden zoals SMLM biedt. DNA-puntenaccumulatie voor beeldvorming in nanoschaaltopografie (DNA-PAINT²²) en multiplexed fluorescentie in situ hybridisatie (FISH)¹⁹maken hoge multiplexing mogelijk; echter, DNA-PAINT wordt sterk beïnvloed door verhoogde achtergrondruis die ontstaat door willekeurige bindingsgebeurtenissen in de oligonucleotiderijke nucleaire omgeving^12,34, terwijl traditionele FISH-methoden op basis van warmtedenaturering verstoorde native chromatinevouwing vereisen. Eerdere studies hebben superresolutie-beeldvormingstechnieken toegepast om chromatine op deze lengteschaal te onderzoeken en hebben een hybride samenstelling van pakdomeinen geïdentificeerd, in tegenstelling tot eerdere faseseparatiemodellen 12,23,34,35. Dit protocol is voortgekomen uit een eerder gepubliceerd artikel waarin de biologische betekenis van deze bevindingen wordt besproken³⁴. Gezien de hoge resolutie en multiplexmogelijkheden blijft immunokleuringsgebaseerde dSTORM dus de meest haalbare strategie voor multikleurige chromatinebeeldvorming onder bijna-natuurlijke omstandigheden.

Dit protocol is niet het eerste dat labeling van meer dan twee nucleaire doelen aantoont, waarbij eerdere studies individuele eiwitcomplexen of genen ^12,36 labelden. Ondanks succesvolle labeling van nucleosoomposttranslationele histonmodificaties, vormen multicolor chromatine SMLM-labeling, beeldvorming en analyse aanzienlijke uitdagingen. Ten eerste vereist immunokleuring in de dichte chromatineomgeving optimalisatie van de antilichaamconcentratie, incubatiesequentie en buffersamenstelling om voldoende penetratie en binding te garanderen zonder overmatige achtergrond. Ten tweede is een uitgebreide analyse van meerdere labels noodzakelijk, aangezien de interacties tussen euchromatine, heterochromatine en enzymen zoals RNA-polymerase waarschijnlijk verder reiken dan eenvoudige binaire uitsluitingen. Tot nu toe blijft het maximale aantal kleuren dat in chromatine dSTORM-beeldvorming wordt aangetoond nog steeds twee 18,37,38,39.

Hier presenteren we een robuust protocol voor driekleurige chromatine SMLM-beeldvorming en analyse. Onze kleuringsworkflow optimaliseert de incubatietijd van antistoffen en maakt gebruik van verbeterde beeldvormingsbuffers^{van 40}voor langdurige beeldvorming voor meerdere labels. We beschrijven verder computationele pijplijnen voor tweekleurige afstandsanalyse en driekleurige gewrichtsdichtheidsanalyse, waardoor kwantitatieve karakterisering van relaties tussen heterochromatine, euchromatine en transcriptiemachines mogelijk is. In tegenstelling tot eerdere tweekleurige chromatine SMLM-studies die een scheiding van heterochromatine en euchromatine suggereerden, toont driekleurige chromatinebeeldvorming aan dat het genoom is georganiseerd in pakdomeinen, waarbij euchromatine en actieve transcriptie gelokaliseerd zijn aan de rand van constitutieve heterochromatinekernen³⁴.

Dit protocol biedt de gemeenschap een reproduceerbaar kader voor het uitvoeren van multi-color chromatine SMLM en stelt analysestrategieën vast die geschikt zijn voor meerdere functioneel geconjugeerde nucleaire doelen. Door methodologische hiaten te overbruggen, maakt het systematisch onderzoek naar de organisatie van het chromatinedomein op supra-nucleosomaal niveau mogelijk, waarbij sequencing- en elektronenmicroscopie-benaderingen worden aangevuld en de native nucleaire architectuur behouden blijven. Dit artikel is een uitgebreid protocol van een gepubliceerd artikel³⁴.

Protocol

OPMERKING: Het volgende protocolgedeelte wordt onderverdeeld in het kleuringsproces en het acquisitieproces zoals hieronder beschreven. Voor tutorials voor data-analyse kunt u terecht in de bijbehorende publicatie³⁴ die de analyse van multi-label voor gelabelde histonmodificaties beschrijft.

1. Kleurproces:

OPMERKING: Door het hele protocol heen wordt gesproken over 35 mm schotels of 8 goed gekamerde platen. Dit zijn de vaten die onze groep gebruikt voor celkweek, maar kleinere en efficiëntere methoden zijn mogelijk. Zorg ervoor dat als alternatieve materialen worden gebruikt, de aanbevolen concentraties voor bufferantilichamen worden gehandhaafd. Vanwege het sequentiële karakter van dit protocol is antistofselectie belangrijk voor succesvolle labeling. We gebruiken standaardredenering om ervoor te zorgen dat onze gastheerantilichamen voor onze doelwitten verschillend zijn, zodat onze secundaire antilichamen verschillende gastsoorten effectief kunnen aanpakken en zo de effecten van de off-target kunnen minimaliseren. De labelvolgorde wordt bepaald op basis van de doellocatie binnen de kern. Omdat we ons richten op chromatine-verpakkingsdomeinen^{25, 28, 34, 35} en begrijpen dat dit een diffusie-gedreven proces is, labelen we altijd eerst heterochromatische doelen, gevolgd door euchromatine en tenslotte RNAPII om sterische uitsluiting in dichte heterochromatische gebieden te minimaliseren. Optimalisatie van buffers werd empirisch uitgevoerd tijdens de ontwikkeling van het protocol. We ontdekten dat het toevoegen van geitenserum na het eerste doelwit nuttig was om de effecten van de off-target in latere stappen te verminderen.

1. Buffervoorbereiding
   1. Buffercomponenten:
      OPMERKING: Voor meer informatie over de componenten, inclusief opslag- en voorbereidingstijden, zie de Tabel van materialen. We raden aan dat de gebruiker alle oplossingen klaar heeft voordat het protocol wordt gestart om experimentele fouten te voorkomen. De afkoeloplossing moet als laatste worden gemaakt.
   2. Maak een blokkeringsbuffer
   3. Weeg het rundvleesserumalbumine (BSA) af zodat de uiteindelijke concentratie in het buffervolume dat voor het experiment nodig is 3% is en voeg toe aan een centrifugebuis. Kantel de buis op een hoek van 45° zodat BSA-kristallen verspreid zijn in de buis, en voeg vervolgens fosfaatgereserveerde zoutoplossing (PBS) toe. Dit wordt gedaan om de vorming van kristalklonten te voorkomen die niet zullen oplossen.
   4. Laat de buis op kamertemperatuur staan totdat alle kristallen zijn opgelost. Schud de buis of vortex niet – dit veroorzaakt bellenvorming die eiwitten naar het oppervlak trekt en voorkomt dat BSA volledig oplost.
   5. Zodra volledig opgelost, voeg Triton X-100 toe zodat de uiteindelijke concentratie 0,2% (v/v) is, gegeven het volume dat in stap 1,3 is gekozen. Als kristallen niet volledig zijn opgelost, pipetteer dan meerdere keren op en neer om de oplossing langzaam te mengen zonder belletjes te vormen.
      OPMERKING: Als je een aangepaste buffer maakt, voeg dan het 10% geitenserum toe aan dit proces. Aangepaste blokkeringsbuffers moeten echter tijdens gebruik vers worden gemaakt en niet lang worden opgeslagen, maar ervoor zorgen dat de eindconcentraties hetzelfde zijn als in de materiaaltabel - 3% BSA, 0,2% Triton X-100.
   6. Maak een wasbuffer:
      Herhaal de stappen voor de blokkeringsbuffer in 1.1.2, maar gebruik de concentraties die in de materiaalsectie en hier staan voor je gemak (0,2% BSA, 0,1% Triton X-100 in 1X -DPBS, en voor aangepaste toevoeging 1% geitenserum)
   7. Maak een fixatieoplossing:
      1. Voeg PBS toe aan een centrifugebuis.
      2. Voeg de juiste hoeveelheid 16% paraformaldehyde toe aan de centrifugebuis voor een uiteindelijke concentratie van 4%.
         OPMERKING: Bereid het vers en klaar voor wanneer je cellen uit de broedmachine haalt. Hoewel de huidige fixatieve oplossing normaal gesproken geen glutaraldehyde gebruikt, kan deze worden toegevoegd en kan deze nuttig zijn vanwege de robuustere fixatie en een langere fixatie in vergelijking met paraformaldehyde. De opstelling voor dSTORM beschikt niet over mogelijkheden voor fluorescentie-levenslange signalen van glutaraldehyde (GA), maar gebruikers die de mogelijkheid hebben, kunnen dit nuttig vinden om zich te scheiden van fluorofoor-gelabelde structuren.
   8. Maak een afkoeloplossing:
      1. Weeg natriumborhydride af op het weegpapier.
      2. Maak centrifugebuis klaar.
      3. Voeg natriumborhydride toe aan de buis.
      4. Voeg PBS toe aan de buis.
         OPMERKING: De oplossing zou bubbels moeten hebben na het toevoegen van de PBS.
   9. Maak een beeldbuffer:
      1. Los 1,4-Diazabicyclooctane (DABCO) op in gedeïoniseerd RNASE, DNASE-vrij water om een 13 mL DABCO-oplossing te maken met een concentratie van 1 M.
      2. Voeg 12 M HCl (~240 μL) toe totdat de DABCO volledig is opgelost en de pH 8,0 bereikt.
      3. Bereid 1 M natriumsulfiet door op te lossen in 10X PBS. DTT vereist geen voorbereiding.
      4. Voor de uiteindelijke voorbereiding gebruik je eerdere voorraden om 65 mM DABCO te maken met 30 mM natriumsulfiet en 30 mM DTT (1 M voorraad) in gedeïoniseerd water.
      5. Pas de pH aan door titratie met HCl en NaOH totdat de pH 8,0 is. Bewaar deze bedekt en verzegeld met Parafilm bij 4°C maximaal 2 maanden. Houd de pH-waarde in de gaten tijdens gebruik.
2. Details van het eerste labelkleuringsproces:
   1. Fixatie:
      1. Neem levende cellen uit de broedmachine en verwijder het celkweekmedium uit de schaal. Gooi het celkweekmedium weg in een container voor biohazard afval.
      2. Voeg genoeg PBS toe om de cellen te bedekken (1 mL voor een 35 mm schotel en 500 μL voor een kamerglas-dia).
      3. Draai het schaaltje voorzichtig om de cellen met PBS te wassen, en verwijder daarna het PBS uit de schaal. Gooi het PBS weg in een container voor biologisch gevaar afval.
      4. Voeg genoeg fixatieve oplossing toe om de cellen te bedekken (1 mL voor een 35 mm schotel en 500 μL voor een kamerglasglaas), en laat de cellen dan 10 minuten fixeren.
      5. Terwijl de cellen worden gefixeerd, weeg je natriumborhydride af voor de afschrikoplossing en voeg je het toe aan een centrifugebuis.
      6. Verwijder de fixatieve oplossing uit de schaal en gooi deze weg in de correct gelabelde vloeibare chemische afvalcontainer.
   2. Afkoelen
      1. Voeg genoeg PBS toe aan de schaal om het oppervlak te bedekken (1 mL voor een schaal van 35 mm en 500 μL voor een glazen kamerglaasje), en plaats de schaal dan 5 minuten op een shaker (elke standaard shaker is prima) om de cellen te wassen.
      2. Haal het schaaltje van de shaker, haal het PBS eruit en gooi het weg in de correct gelabelde vloeibare chemische afvalcontainer.
      3. Voeg voldoende (250 μL, 8-well-schotel) afschrikoplossing toe aan de schotel om het oppervlak te bedekken (1 mL voor een 35 mm schotel en 500 μL voor een kamerglasglaas), en plaats de schotel vervolgens 7 minuten op een shaker om autofluorescentie in de cellen te quenscenties.
      4. Terwijl de cellen op de shaker staan, gooi je de resterende afkoeloplossing weg in de centrifugebuis in de correct gelabelde vloeibare chemische afvalcontainer.
      5. Haal het bakje van de shaker, verwijder de afschrikoplossing en gooi het weg in de correct gelabelde vloeibare chemische afvalcontainer.
      6. Voeg genoeg (250 μL, 8-well schotel) PBS toe aan de schaal om het oppervlak te bedekken (1 mL voor een 35 mm schotel en 500 μL voor een kamerglasglaasje), en plaats het schoteltje 5 minuten op een shaker om de cellen te wassen.
      7. Haal het schaaltje van de shaker, haal het PBS eruit en gooi het weg in de correct gelabelde vloeibare chemische afvalcontainer.
      8. Herhaal stappen 1.2.2.6 en 1.2.2.7 nog twee keer (voor in totaal 3 PBS-wasbeurten).
   3. Blokkeren
      1. Voeg genoeg blokkeringsbuffer toe aan de schotel om het oppervlak te bedekken (250 μL, 8-well-schotel, 1 mL voor een schotel van 35 mm en 500 μL voor een kamerglas-slide).
      2. Plaats de schotel op een shaker gedurende minstens 1 uur om de celmembranen te permeabiliseren en de bindingsplaatsen te blokkeren (bezet de niet-gespecificeerde plaatsen, zodat ze de doelplaatsen niet verstoren). (Hoewel we verschillende keren hebben getest om de minimale succesvolle blokduur van 20 minuten te bepalen, raden we sterk aan om minstens 1 uur of langer te blokkeren tot een nacht. Optimalisatie kan nodig zijn gezien doel- en cellijn.)
      3. Terwijl de cellen op de shaker zitten, bereid je een primaire antistofkleuringsoplossing voor (zie aanbevolen concentratie op de website van de leverancier of zie de tabel in de materiaalsectie).
      4. Om het totale volume kleuringsoplossingen te bepalen, voeg 0,5 mL toe aan het volume dat nodig is om de cellen te bedekken (bijv. voor één schaal van 35 mm, bereid een oplossing van 1,5 mL).
      5. Verwijder het volume dat in sectie 1.2.3.1 is bepaald uit de blokbufferkolf en voeg dit volume toe aan een nieuwe centrifugebuis om de kleuringsoplossing te bereiden.
      6. Voeg een passend volume primaire antistofvoorraad toe aan de blokkeringsbuffer om de juiste eindconcentratie te verkrijgen. Primaire antilichaamvoorraadvolumes voor verschillende veelgebruikte antilichamen zijn te vinden in de materiaalsectie.
      7. Haal de schaal van de shaker, verwijder de blokkeringsbuffer en gooi hem weg in de correct gelabelde vloeibare chemische afvalcontainer.
   4. Primaire antilichaamkleuring:
      1. Voeg voldoende primaire antilichaamkleuringsoplossing toe aan de schaal om het oppervlak te bedekken (1 mL voor een 35 mm schotel en 500 μL voor een kamerglasglaas), en plaats de schotel vervolgens op een shaker voor minstens 1-2 uur tot een nacht om de cellulaire doelen te labelen.
      2. Haal de schaal van de shaker, verwijder de primaire antistofkleuringsoplossing en gooi deze weg in de correct gelabelde vloeibare chemische afvalcontainer.
      3. Voeg genoeg wasbuffer toe aan de schaal om het oppervlak te bedekken (1 mL voor een 35 mm schotel en 500 μL voor een kamerglas-dia), en plaats de schaal dan 5 minuten op een shaker om de cellen te wassen.
      4. Haal de schaal van de shaker, verwijder de wasbuffer en gooi hem weg in de correct gelabelde vloeibare chemische afvalcontainer.
      5. Herhaal stappen 1.2.4.3 en 1.2.4.4 nog twee keer (voor in totaal 3 wasbuffer-wasbeurten).
      6. Terwijl de cellen tijdens de laatste wasbeurt op de shaker zitten, bereid je een secundaire antilichaamkleuringsoplossing voor (zie aanbevolen concentratie op de website van de leverancier of raadpleeg eerdere experimenten).
      7. Om het totale volume kleuringsoplossingen te bepalen, voeg 0,5 mL toe aan het volume dat nodig is om de cellen te bedekken (bijv. voor één schaal van 35 mm, bereid een oplossing van 1,5 mL).
      8. Verwijder het volume dat in sectie 1.2.4.7 is bepaald uit de blokkeerbuffer en voeg dit volume toe aan een nieuwe centrifugebuis om de kleuringsoplossing te bereiden.
      9. Voeg een passend volume secundaire antistofvoorraad toe aan de blokkeringsbuffer om de juiste uiteindelijke concentratie te verkrijgen. Secundaire antilichaamvoorraadvolumes voor verschillende veelgebruikte antilichamen zijn te vinden in de materiaaltabel.
      10. Wikkel de centrifugebuis in de secundaire antilichaamkleuringsoplossing met aluminiumfolie totdat je klaar bent om aan de cellen in de schaal toe te voegen.
   5. Secundaire antilichaamkleuring:
      1. Voeg voldoende secundaire antilichaamkleuringsoplossing toe aan de schotel om het oppervlak te bedekken (1 mL voor een 35 mm schotel en 500 μL voor een kamerglasglaasje), plaats de schotel vervolgens minstens 40 minuten op een shaker om fluoroforen toe te voegen aan de gelabelde cellulaire doelen.
      2. Zorg ervoor dat de schaal bedekt is met aluminiumfolie om fluoroforbleking te voorkomen.
      3. Haal de schaal van de shaker, verwijder de secundaire antistofkleuringsoplossing en gooi deze weg in de correct gelabelde vloeibare chemische afvalcontainer.
      4. Voeg genoeg PBS toe aan de schaal om het oppervlak te bedekken (1 mL voor een 35 mm schotel en 500 μL voor een glazen kamerglaasje), en plaats de schaal dan 5 minuten op een shaker om de cellen te wassen.
      5. Haal het schaaltje van de shaker, haal het PBS eruit en gooi het weg in de correct gelabelde vloeibare chemische afvalcontainer.
      6. Herhaal secties 1.2.5.4 en 1.2.5.5 nog één keer (voor in totaal 2 PBS-wasbeurten).
      7. De cellen kunnen nu worden gefotografeerd of opgeslagen voor latere beeldvorming. Als je direct beelden neemt, volg dan de stappen in de sectie Acquisitie. Als je later opslaat voor beeldvorming, blijf dan de onderstaande stappen volgen.
      8. Voeg genoeg PBS toe aan de schaal om het oppervlak te bedekken (1 mL voor een 35 mm schotel en 500 μL voor een kamerglasglaasje) voordat je het opbergt.
      9. Wikkel het gerecht in met parafilm en daarna met aluminiumfolie om zowel vloeibare verdamping als fluorofoorbleking te voorkomen.
      10. Bewaar het ingepakte schaaltje op 4°C tot het klaar is om te fotograferen.
          OPMERKING: Voor de labels die in dit protocol worden gebruikt, kunnen schotels 2-3 dagen worden bewaard voordat de beeldkwaliteit aanzienlijk wordt aangetast; Verschillende antilichamen kunnen echter verschillende stabiliteiten hebben, maar met de juiste opslag blijven ze enige tijd stabiel nadat het protocol is voltooid. Het bewaren van een gelabeld gerecht langer dan een week wordt niet aanbevolen omdat de fixatieve oplossing niet geconcentreerd genoeg is voor langdurige stabiliteit.
3. Volgend label kleuringsproces:
   1. Blokkeren:
      1. Zie 1.2.3.1 - 1.2.3.2, maar gebruik blocking buffer met geitenserum. De incubatietijd voor blokkeren kan zo kort zijn als 1 uur, maar we raden langere tijden aan met een bovengrens van 's nachts (18-24 uur) voor deze volgende labels om de binding van het doel te verminderen. Raadpleeg eerdere experimenten.
      2. Bereid ondertussen primaire antistofoplossingen voor, in plaats van een blokkerende buffer, in de blokkerende buffer met geitenserum.
   2. Primaire antilichaamkleuring:
      1. Bereid de aangepaste blokkeerbuffer en wasbuffer met geitenserum en wasbuffer met geitenserum voor zoals beschreven in het gedeelte over de buffervoorbereiding.
      2. Zie stapsecties 1.2.3-1.2.4 (Blokkering en primaire antilichaamkleuring) met behulp van de aangepaste blokkerings- en wasbuffers:
         OPMERKING: De incubatietijd voor het primaire antilichaam kan zo kort zijn als 1 uur en zo lang als 's nachts (8-24 uur). Hoewel de beste labelprestaties zijn behaald met langere incubatietijden, vooral bij multi-labels. De gegevens in dit protocol zijn voorbereid met incubatiestappen van de nacht.
      3. Kort voordat de incubatietijd is voltooid, bereid secundaire antilichaamoplossingen voor in de aangepaste blokkeringsbuffer 1.1.3.
   3. Secundaire antilichaamkleuring:
      1. Zie sectie 1.2.5 (Secundaire antilichaamkleuring), maar gebruik blokkeringsbuffer met geitenserum.
         OPMERKING: Let op dat de incubatietijd zo kort kan zijn als 1 uur, maar we hebben langere tijden getest (2-4 uur) met vergelijkbare prestaties. Voor de volgende labels, herhaal sectie 1.3.

2. Acquisitieproces

OPMERKING: Voor gegevensverwerving gebruik Nikon Imaging Software (NIS) elements-software die compatibel is met de gebruikte microscoop. Elke software die filter, lichtpad en camera-instellingen kan regelen, is prima voor dit protocol. Het volgende beeldvormingsprotocol is aangepast voor Total Internal Reflectance Fluorescence (TIRF) verlichting van het monster; het labelingprotocol is echter compatibel met meerdere vormen van beeldvorming. Non-TIRF Imaging is mogelijk met dit labelingprotocol voor STORM en is nodig voor 3D STORM-toepassingen. Gebruik alstublieft een standaardprotocol voor alternatieve beeldvormingsmethoden.

1. Volgend label kleuringsproces:
   1. Zet de benodigde optische componenten aan en maak verbinding met de juiste software. In de meeste gevallen, zoals bij NIS, zal de software niet volledig initialiseren tenzij de computer goed kan communiceren met de microscoop, camera en de stage-control.
   2. Open NIS Software (of gelijkwaardige).
   3. Live view instellen: Zet live view aan >toggle Keep Auto scale > stel onder camera-instellingen de belichtingstijd in op 30 ms.
   4. Stel een datapad in voor acquisitie.
   5. Navigeer naar het bovenste paneel Acquire> Fast Time Lapse> Path
   6. Selecteer de juiste bestandsnaam voor de eerste acquisitie en stel het aantal frames in op 10.000.
      OPMERKING: Deze stappen worden genomen om de tijd te beperken die het monster aan de lichtbron wordt blootgesteld zodra de beeldvorming begint.
   7. Zorg ervoor dat de kritieke hoek en nulhoek van TIRF vooraf zijn ingesteld vóór de verwerving. Raadpleeg online bronnen over tutorials over hoe je dit kunt bereiken. Zoals eerder vermeld, als je geen TIRF-verlichting gebruikt, kan deze stap worden overgeslagen.
   8. Selecteer het juiste lichtpad voor de camera en schakel de Epi-verlichtingsoptie aan onder Lampen (op NIS of gelijkwaardige software) om te zorgen dat de spiegel is ingesteld voor grootveldverlichting van niet-laser standaardlichtbron.
2. Monstervoorbereiding:
   1. Haal monsters op en voeg beeldvormingsbuffer toe (formulering beschreven in sectie 1.1 Buffervoorbereiding) aan het monster. (Afhankelijk van de gebruikte beeldvormingsbuffer kunnen verschillende voorzorgsmaatregelen worden genomen. Bescherm monsters tegen licht.)
   2. Na het toevoegen van olie aan het objectief plaats je het monster op het podium met de juiste houder en zet je Perfect Focus aan en focus je vervolgens op het monster.
3. Beeldvormingsstappen:
   1. Zoek een laserspot en navigeer naar een plek op de schotel/plaat zonder cellen.
   2. Schakel TIRF-verlichting aan.
   3. Verander het filter zodat het bij het juiste filter past om rood licht (of welke laser ook gebruikt om data voor dit specifieke monster te verzamelen) licht te laten doorlaten.
      OPMERKING: Gebruik een multi-notch filter zoals beschreven in de materiaaltabel. Multi-notch filter is niet nodig, en gebruikers kunnen ook beeldvormende niet-onderscheidende filterkubussen maken die zijn ontworpen voor de fluoroforen die in hun kleuring worden gebruikt.
   4. Zet de laser aan op het laagste laservermogen ~ 1 mW (dit is afhankelijk van de lichtbron, maar wordt gedaan om per ongeluk bleken te voorkomen) en stel de spiegelhoek in op een kritische hoek.
   5. Als er geen cellen in de buurt zijn, verhoog dan het laservermogen totdat de laservlek duidelijk zichtbaar is in de livebeeld.
   6. Gebruik de Region of Interest (ROI)-tool, teken, stel de ROI in en sla de ROI op waar de laserspot zich bevindt.
      OPMERKING: Voor monsters met meerdere labels, zorg ervoor dat de laservlekken voor alle benodigde lichtbronnen voor het monster zijn uitgelijnd. In dit protocol gebruiken we drie lasers en zorgen we ervoor dat alle vlekken uitgelijnd zijn. Dit is essentieel omdat co-registratie van ruimtelijke data laseruitlijning vereist.
   7. Keer terug naar Epi-verlichting en het helder veldfilter.
   8. Gebruik de ROI-definitietool om een geschikte gezonde cel te vinden (bijvoorbeeld een geschikte HCT116-cel moet een hechtende, polygonale of ovale vorm hebben met een duidelijke celgrens).
   9. Centreer de ROI op de kern en klik op OK om in te zoomen op de ROI-positie (Voer uit met helder veldverlichting, aangezien de gezondheid van de cel niet direct kan worden bepaald aan de hand van breedveldfluorescerende beelden van de kern.
   10. Keer terug naar TIRF-verlichting met dezelfde methode als in 2.3.2.
   11. Selecteer het geschikte filter voor het langste golflengte gelabelde target (in de meeste gevallen is dit ver rood, bijvoorbeeld Alexa Fluor 647 gelabeld doel). Meestal wordt de langste golflengte als eerste gekozen om fotobleachingmonster met kortere golflengten te vermijden, in het geval gelabelde doelen secundaire spectra overlappen.
   12. Bij LAAG laservermogen voor elke benodigde laser (in het geval van meerdere labels zijn dit 3 lasers) zet de laser aan en verlicht de kern om ervoor te zorgen dat het monster goed uitgelijnd is.
   13. Gebruik TIRF-regelaars om ervoor te zorgen dat het monster wordt verlicht met TIRF.
   14. Kies de geschikte Z-positie voor acquisitie op basis van behoeften. Dit kan echter vlak voor de overname worden aangepast.
   15. Set exposure time based on needs of the fluorophores (use anywhere between 10‬-30 ms).
   16. Klik op Acquire> snelle timelapse.
   17. Stel frames in op ≥10.000 en klik op Apply om het bestand in de opgegeven map aan te maken.
   18. Zet het laservermogen aan op 50% en fotobleekmonster.
   19. De kern zou aanvankelijk moeten bleken, maar kort daarna (seconden later) zou hij moeten beginnen te knipperen.
   20. Keer terug naar de gewenste kritische hoek en Z-positie door opgeslagen posities te wisselen of handmatig de spiegelhoek en Z-positie te bedienen en snel time lapse te verkrijgen.
   21. Zorg ervoor dat er geen drift in de fase is, anders wordt co-registratie van multikanaalbeelden niet correct uitgevoerd. Gebruik fiduciaire markers (fluorescerende microkorrels) of sla de Z-positie op aan het begin van de acquisitie om later te gebruiken voor driftcorrectie met behulp van de positie opslaan-methode voor multi-punt acquisitie in het apparaat.
   22. Vervang het filter (of laat het zitten als je multi-notch met doorlaatband gebruikt voor de benodigde fluorofor) en herhaal sectie 2.3.17-2.3.20 (Voor volgende labels, zorg ervoor altijd te beginnen op laag laservermogen, pas parameters aan en verwin).
4. Gegevensverwerking:
   1. Laad de raw image stack in FIJI met de Bio-Formats plugin. Genereer een minimumintensiteitsprojectie door Image> Stacks> Z Project te selecteren en Min-intensiteit als projectietype te kiezen. Trek deze minimale projectie af van de raw image stack met behulp van Process > Image Calculator. Op de resulterende afbeelding voer je achtergrondaftrekking uit (Proces > Achtergrond Aftrekken) met een rollende balstraal van 5 pixels.
   2. Definieer het interessegebied (ROI) voor individuele cellen, handmatig of met de Nuclei Outline-plugin (Plugins > GDSC > Cells > Nuclei Outline).
   3. Voer lokalisatieanalyse uit op de voorbewerkte imagestack binnen de gedefinieerde ROI met behulp van de ThunderSTORM-plugin (Plugins > ThunderSTORM > Run analysis). Gebruik geschikte parameters voor robuuste lokalisatie (bijv. beeldfilter: B-spline, orde = 3, schaal = 2; piekintensiteitsdrempel = 1,5× std (Wave.F1); subpixel-lokalisatiemethode: Gaussisch, sigma = 2; fitradius = 4; fittingmethode: maximale waarschijnlijkheid). De resulterende coördinaten kunnen worden gebruikt om het superresolutiebeeld te reconstrueren.
   4. Voor multikanaalexperimenten voegt men kanalen samen om een samengestelde chromatine-gereconstrueerde dSTORM-afbeelding te genereren (Afbeelding > Kleur > Samenvoegkanalen).

Results

Representatieve driekleurige chromatine dSTORM-afbeeldingen

Het voorgestelde sequentiële kleuringsprotocol is getest geldig voor verschillende cellijnen, waaronder BJ fibroblast, HCT116, AC16, HeLa, MCF10A, enzovoort. Figuur 1 toont de representatieve beelden van BJ fibroblast, HeLa en MCF10A cellen.

Validatie van analysepijplijn met behulp van gesimuleerde datasets

De ontwikkeling van een driekleurig immunofluorescentieprotocol vereiste de creatie van een gespecialiseerde computationele benadering die in staat is om de complexiteit van multi-target nucleaire SMLM-data aan te kunnen (Figuur 2A,2 B). Gezien de dichte chromatineomgeving waarin meerdere doelen dicht bij elkaar bestaan, hebben we een point-cloud analyseframework geïmplementeerd dat direct localisatiecoördinaten verwerkt in plaats van gereconstrueerde afbeeldingen. Deze aanpak maakt gebruik van de uitgebreide clusteringanalysetools die beschikbaar zijn voor point-cloud data 40,41,42. We evalueerden systematisch het vermogen van de analysepijplijn om biologisch betekenisvolle ruimtelijke patronen te onderscheiden met behulp van gecontroleerde gesimuleerde datasets. Er werden vier verdelingstypen gegenereerd om verschillende chromatineorganisatiescenario's weer te geven: normale verdeling voor dicht geclusterde modificaties, uniforme verdeling voor verspreide patronen, toroidale verdelingsmodellering van uitsluitingszones en willekeurige verdeling als organisatorische controle (Figuur 2C). Deze gesimuleerde patronen waren verankerd in echte heterochromatineclusterposities afgeleid van experimentele H3K9me3-gegevens, waardoor realistische nucleaire ruimtelijke beperkingen behouden bleven. Dit analysekader maakt gebruik van DBSCAN-clustering (epsilon = 50 nm, minimumpunten = 3), wat een van de vele methoden is voor clusteranalyse in ^SMLM-data 40,41,42. Om de juiste clusteringparameters te waarborgen, hebben we eerder een optimalisatiemethode beschreven die is afgestemd op de detectie van chromatine-pakdomeinen³⁴. Let op: wanneer dit als eerste stap in de analyse wordt gebruikt, moeten gebruikers de parameters optimaliseren die de selectie bepalen aan de hand van de structuur, omgeving en functie van hun doelwit. Hier worden de clustergrenzen bepaald door convexe hullenberekeningen, waarbij aannames over domeingeometrie worden weggenomen. Onze validatie toonde duidelijk onderscheid aan tussen alle gesimuleerde distributiepatronen via histogramprofielen op verschillende afstanden (Figuur 2D). Elk ruimtelijk organisatietype produceerde karakteristieke signaturen wanneer lokalisaties werden geanalyseerd ten opzichte van heterochromatine-centroïden. Gezamenlijke bezettingsanalyse werd getest met dual-marker simulaties met gecontroleerde ruimtelijke relaties (Figuur 2E). Ruimtelijk gescheiden markers (normaal-toroïdale configuratie) leverden minimale gewrichtsdichtheid op zoals verwacht, wat resulteerde in vlakke verdelingsprofielen (Figuur 2E). Overlappende markeringspatronen (normaal-willekeurige configuratie) veroorzaakten een afnemende hechtheid van de voegen met toenemende afstand tot referentiepunten, wat overeenkwam met theoretische voorspellingen. Deze validatieresultaten tonen het vermogen van ons kader aan om ruimtelijke koppelingsrelaties in complexe multi-target datasets te detecteren en te kwantificeren. Voor meer informatie over hoe deze gesimuleerde datasets zijn gegenereerd, raadpleeg de volledige publicatie³⁴.

Representatieve resultaten uit chromatineorganisatie-analyse

De implementatie van onze gevalideerde analysemethode in biologische monsters onthult karakteristieke ruimtelijke organisatiepatronen die via dit protocol kunnen worden bereikt. Met behulp van HeLa-cellen verwerkt met onze driekleurige kleuringsprocedure voor H3K9me3, H3K27ac en RNA Polymerase II, demonstreren we de analytische mogelijkheden die deze methodologie mogelijk maakt. H3K9me3 heterochromatine dient als ideaal referentiesysteem, gegeven vastgesteld bewijs voor de organisatie van concentrische chromatine op de 200 nm-schaal uit eerdere superresolutieonderzoeken 23,28,35. De analyse begint met DBSCAN-gebaseerde identificatie van heterochromatinedomeinen, die vervolgens worden gecategoriseerd naar effectieve straal: kleine domeinen (25-40 nm), middelgrote domeinen (40-80 nm) en grote domeinen (80-253 nm). Deze groottestratificatie verklaart de gedocumenteerde heterogeniteit in de dimensies van DNA-verpakkingsdomeinen, met gemiddelde domeinen van ongeveer 80 nm in straal²⁵. Afstandsmetingen maken gebruik van een 1,5x clusterstraalzoekvenster (Figuur 2B bovenaan) om proximale euchromatine- en polymerasesignalen vast te leggen (Figuur 3A,B).

Representatieve resultaten tonen aan dat zowel H3K27ac als RNA Polymerase II consequent nabij heterochromatinegrenzen lokaliseren over alle domeincategorieën, wat overeenkomt met eerdere studies^28,44 en modellen voor transcriptielocatie ten opzichte van chromatinedomeinen^23,35,45,46. Kwantitatieve afstandsanalyse onthult gemiddelde posities zeer dicht bij domeinperiferieën: grote domeinen tonen H3K27ac bij -1,0 nm en RNA Polymerase II op 8,4 nm van grenzen, terwijl kleinere domeinen vergelijkbare perifere associaties vertonen met kleine positieverschillen. Deze metingen geven aan dat actieve chromatine-elementen zich concentreren op het grensvlak tussen repressieve en permissieve domeinen in plaats van volledig te worden uitgesloten. Analyse van gewrichtsdichtheid toont het vermogen van het protocol aan om ruimtelijke koppeling tussen co-gelabelde doelen aan te tonen (Figuur 3C-F). Analyse ten opzichte van heterochromatinedomeinen toont een piekgewrichtsdichtheid net buiten de domeingrenzen (r/r₀> 1), wat wijst op preferentiële H3K27ac-RNA Polymerase II co-lokalisatie in perifere gebieden (Figuur 3G-I). Deze resultaten laten zien hoe deze kleurings- en analysepijplijn kan helpen bij het onderzoeken van complexe ruimtelijke relaties in dichte omgevingen.

Figuur 1: Drie kleurenafbeeldingen van de gebruikte cellen. Driekleurige beelden van (A) BJ fibroblast, (B) HeLa en (C) MCF10A. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 2: Kwantitatieve analyse-framework voor ruimtelijke organisatie van doelen ten opzichte van heterochromatineclusters. (A) Analysepijplijn voor multikanaals SMLM-gegevens die in deze studie zijn gebruikt. (B) Schema van afstandsberekeningen tot periferie voor geïdentificeerde heterochromatineclusters en de Joint Affinity Counting-methode. Beide methoden worden gebruikt om kwantitatief de rangschikking van twee doelen ten opzichte van de structuur van de heterochromatinecluster te bepalen. (C) Voorbeeldverspreidingen rond specifieke heterochromatineclusters gebruikt in een studie³⁴ om verschillende biologische organisaties van doelstructuren te bepalen (geclusterd binnen een domein versus rond domein versus niet geassocieerd en willekeurig verdeeld). (D) Afstand tot periferie histogram voor centraal geclusterde, willekeurig verdeelde en toroïdaal verdeelde en (E) Gewrichtsaffiniteitscurves voor simulatiegevallen. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 3: Kwantitatieve ruimtelijke relaties van transcriptiemarkers rond histondomeinen. (A) Histogramresultaten van afstand tot periferie voor voorbeeldige biologische gegevens van multi-gelabelde HeLa-cellen. Voor kleine (<40 nm), middelgrote (40-80 nm) en grote (>120 nm) domeinen voor RNAPII en (B) H3K27ac ten opzichte van H3K9me3-clusters. (C-E) Voorbeeldafbeeldingen voor drie-label dSTORM-afbeelding van een HeLa-cel (H3K9me3, H3k27ac, RNAPII2-S2p, met inset- en ingezoomde afbeelding voor één domein. (F) Convex omhulsel (rood) fitting van domein afgebeeld in E met analysezone in grijs. (G) Affiniteitsplots voor RNAPII ten opzichte van H3K27ac en H3K27ac (H) ten opzichte van RNAPII in de analyse-ROI voor alle domeinen in de gegevens van middelgrootte in de dataset. (I) Gezamenlijke dichtheid van RNAPII en H3K27ac in analyse ROI voor alle middelgrote domeinen. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Discussion

Dit driekleurige SMLM-protocol vertegenwoordigt een belangrijke vooruitgang in ons vermogen om chromatineorganisatie binnen de dichte nucleaire omgeving te onderzoeken. De sequentiële immunofluorescentielabeling-benadering, gecombineerd met puntwolk-ruimtelijke analyse waarbij lokalisatieschattingen als punten als basis worden gebruikt, biedt onderzoekers een krachtig hulpmiddel om nanoschaalrelaties tussen verschillende chromatinemodificaties en actieve transcriptiemachines te onderzoeken die voorheen niet detecteerbaar waren met conventionele microscopietechnieken.

De sequentiële kleuringsstrategie van het protocol pakt fundamentele uitdagingen aan die inherent zijn aan multi-target nucleaire beeldvorming. In tegenstelling tot cytoplasmatische of membraan-geassocieerde structuren die relatief schaars zijn, bestaan nucleaire chromatinedoelen in extreem hoge dichtheid met overlappende ruimtelijke domeinen. Onze aangepaste blokkeringsmethode, waarbij na elke labelronde serum van secundaire antistofhostsoorten wordt opgenomen, voorkomt effectief kruisreactiviteit tussen antilichaamparen terwijl de doelspecificiteit behouden blijft. De nachtelijke incubaties bij 4°C zorgen voor volledige antilichaampenetratie door het hele nucleaire volume, wat cruciaal is voor het bereiken van een uniforme labelingsdichtheid die nodig is voor kwantitatieve SMLM-analyse. Dit protocol produceert betrouwbaar beelden met een resolutie van 15-20 nm over meerdere cellijnen, waardoor het breed toepasbaar is voor chromatineorganisatiestudies.

Hieronder volgen de tips voor het oplossen van problemen tijdens de beeldvormingssessie. Als de kernen niet bleken, is de meest waarschijnlijke oorzaak een onvoldoende laserintensiteit bij het monster, wat kan voortkomen uit een lage vermogensinstelling of een verkeerde TIRF-hoek; in dit geval kunt u het probleem oplossen door de laseruitlijning te controleren, het laservermogen te verhogen en zorgvuldig de TIRF-hoek aan te passen. Als de knipperingen in de kern zeer weinig zijn maar voortdurend helder blijven, geeft dit aan dat de kernen niet voldoende zijn gebleekt. Als knipperingen zeer schaars zijn en de kernen helemaal niet zichtbaar zijn, is de meest waarschijnlijke verklaring een mislukte kleuring, en moeten de reagentia en antistoffen worden gecontroleerd voordat het protocol wordt herhaald. Omgekeerd, als het aantal nucleaire blinks zeer hoog is (een wenselijk resultaat), is een langere bleektijd nodig totdat individuele, goed gescheiden enkelmolecuul-blinks visueel kunnen worden opgelost. In conventionele SMLM-experimenten kan de juiste labelingsdichtheid vaak worden geschat met goed gedefinieerde referentiestructuren zoals microtubuli; Chromatine vertoont echter een zeer heterogene organisatie en mist een goed gedefinieerde grondwaarheidsstructuur, waardoor dergelijke schatting uitdagender wordt. Op basis van empirische optimalisatie en eerdere ervaring zorgen we er daarom voor dat de effectieve labeldichtheid ongeveer 100 lokalisaties per μm² bereikt, wat robuuste reconstructie van chromatine-verpakkingsdomeinen mogelijk maakt. In ons protocol hebben we geen fiduciaire markers gebruikt, maar we raden aan als de gebruikers die hebben. In onze experimenten blijven de laterale verschuivingen binnen 0,2 pixels (minder dan ~5 nm), wat genegeerd kan worden. Daarom gebruikten we geen fiduciaire markers.

De keuze voor H3K9me3, H3K27ac en RNA-polymerase II biedt aanvullende informatie over chromatineorganisatie op nanoschaalniveau. H3K9me3 dient als een ideale ruimtelijke referentie omdat het discrete, goed gedefinieerde clusters vormt die constitutieve heterochromatine vertegenwoordigen en betrouwbaar kunnen worden geïdentificeerd via geautomatiseerde clustering-algoritmen. H3K27ac markeert enhancer-geassocieerde chromatine die actief deelneemt aan genregulatie, terwijl RNA-polymerase II direct aangeeft op plaatsen van actieve transcriptie. Samen maken deze drie doelwitten het mogelijk om te onderzoeken hoe transcriptiemachines en regulatiechromatinemodificaties zich organiseren ten opzichte van heterochromatische gebieden binnen de nucleaire architectuur.

Het point-cloud analyseframework pakt kritieke beperkingen van eerdere chromatineorganisatiestudies aan door uitgebreide ruimtelijke analyse in dichte nucleaire omgevingen mogelijk te maken. Traditionele pargewijze vergelijkingsmethoden kunnen de complexe ruimtelijke relaties die ontstaan wanneer meerdere chromatinemodificaties binnen dezelfde kerngebieden naast elkaar bestaan, niet vastleggen. Onze aanpak maakt gebruik van gewrichtsdichtheidsanalyse om te onthullen waar H3K27ac en RNA-polymerase II co-lokaliseren ten opzichte van H3K9me3-clusters, wat kwantitatieve informatie levert die niet uit afzonderlijke tweekleurexperimenten kan worden verkregen.

Representatieve resultaten tonen consequent een samenhangend organisatiemodel in plaats van strikte chromatinecompartimentering. Zowel H3K27ac als RNA-polymerase II lokaliseren zich bij voorkeur bij de periferiteiten van heterochromatineclusters over verschillende domeingroottes, waarbij kwantitatieve metingen positionering binnen 10 nm van clustergrenzen aantonen, wat bevindingen van andere groepen met vergelijkbare methoden en transcriptiemodellen^ondersteunt 23,28,35,45,46 . De analyse van gewrichtsdichtheid toont aan dat actieve transcriptiemachines en enhancer-geassocieerde chromatine het vaakst koppelen in gebieden rondom heterochromatische clusters. Deze bevindingen dagen eenvoudige faseseparatiemodellen uit en ondersteunen geïntegreerde organisatorische principes waarbij verschillende chromatinemodificaties nauwe ruimtelijke nabijheid behouden in plaats van aparte compartimenten te vormen.

Het modulaire ontwerp van het protocol maakt het mogelijk om diverse chromatinebiologische vragen te onderzoeken via doelsubstitutie, terwijl hetzelfde analytische kader behouden blijft. Studies naar replicatietiming kunnen celcycluseiwitten vervangen zoals proliferatiecel-nucleair antigeen (PCNA) en mini-chromosoomonderhoud (MCM), terwijl DNA-schaderesponsonderzoeken zich mogelijk richten op γH2AX en reparatiefactoren. Celcyclusstudies zouden histonmodificaties kunnen onderzoeken die tijdens deling veranderen, en differentiatieonderzoek zou zich kunnen richten op epigenetische kenmerken die samenhangen met afstammingsverbintenis. De sequentiële labelingbenadering houdt rekening met elke combinatie van nucleaire eiwitten of chromatinemodificaties waarvoor betrouwbare antilichamen bestaan, voornamelijk beperkt door spectrale compatibiliteit en kruisreactiviteit. Deze flexibiliteit stelt onderzoekers in staat fundamentele vragen over chromatinedynamiek tijdens verschillende cellulaire processen te behandelen, terwijl ze de kwantitatieve ruimtelijke analyse behouden.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Andor iXon Ultra 888 electron-multiplying CCD	Andor	DU-888U3-CSO-#BV	NA
Bovine serum albumin	Sigma Aldrich	A7030	Used in blocking and washing buffers. Do not store BSA based blocking buffer for more than 1 month at 4°C
Changchun New Industries Optoelectronics Tech. Co., Ltd., Model MGL-FN-532 (532 nm)	PSU-H-LED	https://www.cnilaser.com/MGL-FN-532.htm	NA
Coherent OBIS Laser Box (405 nm, 488 nm, 532 nm, 552 nm, 637 nm)	Coherent	1228877	Lasers collimated with 3–10 kW/cm³ average power at sample, minimum 10,000 frames collected per wavelength channel with 10–30 ms acquisition time.
DABCO (1,4-Diazabicyclo-(2.2.2)-octane)	Sigma	D27802	NA
DBPS (1X)	Thermo Fisher	14190-136	NA
Distilled water	NA	NA	Any Distilled Water is fine
DTT (Dithiothreitol), 1M	Sigma	43816	NA
Eight well chambered cover glass	Cellvis	C8-1.5H-N	Can be any glass bottom plate, but volumes must be adjusted depending on vessel.
Goat anti Mouse AF568	Thermo Fisher	A11004	Stock Concentration: 2 mg/mL Stability Post Labeling: 2–3 days
Goat anti Rabbit AF647	Thermo Fisher	A21245	Stock Concentration: 2 mg/mL Stability Post Labeling: 4–5 days
Goat anti Rat A488	Thermo Fisher	A11006	Stock Concentration: 2 mg/mL Stability Post Labeling: 2–3 days
H3K27ac Primary Antibody	Thermo Fisher	MA5-23516	Stock Concentration: 1.0 mg/mL
H3K9me3 Primary Antibody	Abcam	AB1769156	Stock Concentration: 1.287 mg/mL
High Clarity Poly-Propylene Conical Tube 15 mL	Corning	352096	Used for Fixative and Quenching solutions
High Clarity Poly-Propylene Conical Tube 50 mL	Corning	352070	Used for 40 mL working stocks of blocking and washing buffers
Hydrochloric acid (HCl), 12M	Sigma	258148	NA
Nikon Eclipse Ti-E with perfect focus system	NIikon	TI-DH 611392	Inverted microscope
Nikon SR APO TIRF, 100x magnification, 1.49 NA	Nikon	https://www.microscope.healthcare.nikon.com/products/optics/cfi-apochromat-tirf-series	NA
Normal goat serum	Abcam	AB7481-1002	Used after first label is done. Should be present in Blocking and Washing Buffers
Paraformaldehyde 16 %	Electron Microscopy Sciences	15710	Used in fixative solution which should be used up within 2 weeks of making. Keep protected from light at 4°C
Phosphate buffered saline (PBS) 10X	Ambion	AM9625	NA
Pipette Tips 1000 uL	SureOne	02-707-404	Any pipette tip is fine as long as it’s appropriate for the volume
RNAPII-PS2	Abcam	AB252855	Stock Concentraion: 0.98 mg/mL
Sodium Borohydride	Thermo Fisher	S678-10	Use fresh for quenching buffer every single time.
Sodium hydroxide(NaOH)	Thermo Fisher	A16037.36	NA
Sodium sulfite	Sigma	S0505	NA
Triton X-100 10%	Thermo Fisher	28314	NA