Method Article

Ontwikkeling en werkzaamheid van enzymresponsieve squaleen-chidamide nanodeeltjes voor alvleesklierkanker

DOI:

10.3791/69875

⸱

March 13th, 2026

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1School of Pharmaceutical Sciences, Zhejiang Chinese Medical University, 2Huzhou Institute for Food and Drug Control, 3Academy of Chinese Medical Sciences, Zhejiang Chinese Medical University, 4Institute for Innovation in Modern Traditional Chinese Medicine, The First Affiliated Hospital of Zhejiang Chinese Medical University, Zhejiang Provincial Hospital of Traditional Chinese Medicine

* These authors contributed equally

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dit protocol beschrijft de synthese en karakterisering van foliumzuur-gemodificeerde squaleen-chitosan-nanodeeltjes, evalueert hun enzymresponsieve geneesmiddelafgifte en cellulaire opname in vitro, en past deze toe om de behandeling van alvleesklierkanker te verbeteren via gerichte toediening.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Hier presenteren we een protocol om de beperkte intratumorale penetratie van kleinmolecuulgeneesmiddelen aan te pakken, veroorzaakt door de dichte extracellulaire matrix (ECM) van pancreasductaal adenocarcinoom (PDAC). Prodrugs bieden groot potentieel om deze uitdaging te overwinnen door de penetratie van geneesmiddelen en de tumordodende effectiviteit te verbeteren. Squaleen (SQ), een natuurlijke voorloper voor cholesterolsynthese met uitstekende bioveiligheid en biocompatibiliteit, kan de membraancompatibiliteit van hydrofiele geneesmiddelen verbeteren en hun cellulaire opname verbeteren wanneer het wordt geconjugeerd met chemotherapeutische middelen of bioactieve kleine moleculen. In deze studie ontwikkelden we een nieuw lipofiel SQ-gebaseerd prodrug systeem: het hydrofiele antikankermedicijn chidamide (CHI) werd via een amidebinding aan SQ geconjugeerd – een koppeling die responsief is op pancreatine en cathepsine B (belangrijke enzymen die overexpressief worden in de PDAC-microomgeving). Deze conjugatie leverde een amfifiel SQ-CHI prodrug op, dat verder zelfgeassembleerd werd tot folaat- (FA)-gemodificeerde nanodeeltjes (FA-SQ-CHI NP'S). De geoptimaliseerde NP's vertoonden een uniforme hydrodynamische diameter van 173,3 ± 1,5 nm, een polydispersie-index (PDI) van 0,181 ± 0,18, een hoge laadcapaciteit van 59,0% ± 0,77%, en een stabiel Zeta-potentiaal van -13,10 ± 0,86 mV. In vitro-vrijgavestudies toonden aan dat de NP's 80,2% ± 4,22% cumulatieve geneesmiddelafgifte binnen 72 uur behaalden in aanwezigheid van 0,25% pancreatine, terwijl slechts 33%-38% afgifte werd waargenomen in pH-gecorrigeerde buffers (pH 4,5 of 7,4) zonder enzymen. Cellulaire opname-assays bevestigden dat FA-modificatie de intracellulaire afgifte-efficiëntie significant verbeterde, met 1,8-2,3 keer een hogere fluorescentieintensiteit in PDAC-cellen (PSN-1 en CFPAC-1) vergeleken met niet-gerichte NP's na 12-24 uur. Het huidige protocol biedt een uitgebreide methodologie voor de synthese en karakterisering van het prodrug, in vitro-evaluatie van enzymresponsieve release-kinetiek, en vergelijkende analyses van therapeutische werkzaamheid en weefselpenetratie, waarbij de kernvoordelen van de nanocarrier worden benadrukt: gerichte afgifte, hoge geneesmiddelbelasting en enzymgetriggerde gecontroleerde afgifte.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Pancreasductaal adenocarcinoom (PDAC) is een zeer kwaadaardige tumor van het spijsverteringskanaal, met een incidentiepercentage dat bijna gelijk is aan het sterftecijfer en een 5-jaar overlevingspercentage van slechts 8%-9%. Een complex tumormicro-omgeving (TME) is het kenmerkende kenmerk van PDAC2. Het bestaat voornamelijk uit een abnormale extracellulaire matrix (ECM), geactiveerde kanker-geassocieerde fibroblasten (AF's) en een diep immunosuppressieve cellulaire omgeving. De PDAC ECM is rijk aan type I collageen. Zowel de veranderde inhoud als de abnormale structuur bevorderen tumorprogressie en worden geassocieerd met een slechte prognose3. AFL's zijn de meest voorkomende stromale cellen en bestaan uit functioneel verschillende subtypen, zoals matrixproducerende myCAFs en inflammatoire iCAFs, die fenotypische plasticiteitvertonen 4.

Immunologisch wordt de PDAC TME gedomineerd door pro-tumor myeloïde cellen. Anti-tumorlymfocyten zijn schaars of disfunctioneel. Rijpe B-lymfocyten dragen ook bij aan immunosuppressie 3,4. Gezamenlijk vormen deze componenten meerdere therapeutische barrières. Het dichte stroma, gekenmerkt door hoge interstitiële vloeistofdruk, creëert een significante penetratiebarrière die de afgifte van therapeutische middelen in de diepe tumorgebieden ernstig belemmert, waardoor de klinische werkzaamheid van chemotherapeutische middelen aanzienlijk beperktwordt 5. Daarom is het ontwikkelen van geneesmiddelafgiftesystemen die deze stromale barrière kunnen doorbreken en diep in het alvleeskliertumorweefsel kunnen doordringen, van cruciaal belang.

In de afgelopen jaren heeft squaleen (SQ), een natuurlijke voorloper voor cholesterolsynthese, veel aandacht getrokken vanwege zijn uitstekende bioveiligheid en biocompatibiliteit6. Omdat SQ sterk hydrofoob is, kan het worden gecombineerd met hydrofiele geneesmiddelen om amfifiele prodrugs te vormen, waardoor de biocompatibiliteit van hydrofiele kleinmolecuulgeneesmiddelen met celmembranen verbetert en hun cellulaire opname-efficiëntie wordtverhoogd 7. Eerdere studies hebben aangetoond dat SQ covalent kan worden geconjugeerd met verschillende chemotherapeutische middelen, zoals cisplatine, paclitaxel en gemcitabine, waarbij prodrug nanodeeltjes ontstaan met een hoge laadcapaciteit van het medicijn, wat de levering van het medicijn aan solide tumoren verbetert 8,9. Deze eigenschappen benadrukken het brede toepassingspotentieel van SQ bij de ontwikkeling van geneesmiddelafgiftesystemen.

Om tumortargeting te verbeteren, gebruikt deze studie foliumzuur (FA) als targeting-ligand. FA is een wateroplosbare vitamine die cruciaal is voor éénkoolstofmetabolisme, biosynthese10, redoxhomeostase11 en methyleringsreacties12. Conjugatie van FA via zijn carboxylgroepen aan de nanodrager maakt specifieke herkenning en binding aan de folaatreceptor (FR) mogelijk, gevolgd door receptorgemedieerde endocytose13. Door gebruik te maken van de verbeterde permeabiliteit en retentie-effect van tumorcellen, evalueerden Zheng et al.14 de expressie van de folaatreceptor α (FRα) in alvleesklierkanker, normale alvleesklier, aangrenzende weefsels en chronische pancreatitis met behulp van Western blotting en immunohistochemie, en analyseerden zij de correlatie met klinisch-pathologische kenmerken. FRα werd tot expressie gebracht in 94,7% (72/76) van de gevallen van alvleesklierkanker, wat correleert met metastase, maar ontbrak in normaal alvleesklierweefsel. FA-gemodificeerde nanodeeltjes kunnen selectief ophopen in FR-positieve weefsels, waardoor moleculair gerichte therapie mogelijk wordt.

Chidamide (CHI) is een nieuwe histondeacetylase-remmer. Preklinische studies hebben aangetoond dat het ook krachtige antitumoractiviteit vertoont tegen solide tumoren zoals alvleesklier- en borstkanker, en medicijnresistentie in tumorcellenkan omkeren. De sterke hydrofiliciteit wordt echter geassocieerd met een lage penetratie-efficiëntie in de tumormicro-omgeving en een slechte verspreiding binnen solide tumorweefsels, wat het klinische therapeutische potentieel voor alvleesklierkankersterk beperkt. Met chidamide (CHI) als modelgeneesmiddel stelt deze studie de bereiding voor van zelfgeassembleerde nanodeeltjes via de conjugatie van CHI met SQ en de daaropvolgende modificatie met FA. Deze strategie is gericht op het verbeteren van de antitumoreffectiviteit van CHI tegen alvleesklierkanker door de slechte penetratie in het tumormicro-milieu en de suboptimale distributie binnen vast tumorweefsel te overwinnen. Bovendien wordt verwacht dat door het evalueren van de in-vitro effectiviteit van CHI in cellijnen van alvleesklierkanker, deze aanpak de penetratie en cytotoxische effecten van CHI – een representatief hydrofiel kleinmolecuulmedicijn – binnen de micro-omgeving van de alvleeskliertumor aanzienlijk zal verbeteren, waardoor een experimentele basis wordt geboden voor het sturen van CHI-gebaseerde therapie bij alvleesklierkanker.

Onze studie gaat dieper in op de experimentele procedures voor het bereiden van CHI-SQ-PEG-FA, zelfgeassembleerde prodrug nanodeeltjes voor de behandeling van alvleesklierkanker. Specifiek beschrijven we de optimalisatie en karakterisering van het bereidingsproces voor CHI-SQ-PEG-FA-nanodeeltjes, samen met studies naar in-vitro geneesmiddelvrijgave. Het proces omvat: ten eerste het optimaliseren van de formulering met een experimentele aanpak met één factor en het bepalen van de optimale deeltjesgrootte en geneesmiddelbelasting; ten tweede, het karakteriseren van de nanodeeltjes met behulp van UPLC- en MTS-assays; en tenslotte het opzetten van een in vitro co-gekweekt tumor-sferoïdemodel. Met behulp van coumarin-6 (C6) als fluorescerende probe in gerichte nanodeeltjes valideren we verder de penetratie en distributie van de nanodeeltjes binnen driedimensionale tumorsferoïden en verkrijgen we relevante gegevens.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Synthese van SQ-CHI en SQ-PEG-FA

  1. Synthese van SQ-CHI: Weeg 120,4 mg (0,3 mmol) van 1,1',2-tris-norsqualenoïnezuur en los dit op in 1 mL N, N-dimethylformamide (DMF). Voeg achtereenvolgens NHS (46 mg, 0,4 mmol) en EDCI (72 mg, 0,38 mmol) toe en laat de reactie 90 minuten doorgaan onder stikstofbescherming.
  2. Los chidamide (58,56 mg, 0,15 mmol) op in 1 mL DMF en voeg dit druppelgewijs toe aan het reactiemengsel. Roer de reactie op kamertemperatuur onder een stikstofatmosfeer gedurende 72 uur.
  3. Na voltooiing verdamp je het oplosmiddel onder verminderde druk van 5-15 kPa om het ruwe product te verkrijgen. Zuiver het ruwe product met flashkolomchromatografie met behulp van een gradiënt-elutie van DCM/MeOH (99:1, 99:5, 85:5).
  4. Structurele verificatie van SQ-CHI: Plaats het gesynthetiseerde SQ-CHI-product in een glazen flesje en droog het 24 uur onder vacuüm in een desiccator. Los het product op in ongeveer 1 mL deutereneerd chloroform (CDCl3) en doe het over in een NMR-monsterbuis. Voer 1H NMR-analyse uit om de chemische structuur van het product te bevestigen17.
  5. Synthese van SQ-PEG-FA: Los 41,12 mg 1,1',2-tris-norsqualenoïnezuur op in 35 μL DMF. Voeg sequentieel N-hydroxysuccinimide (NHS, 15,71 mg) en 1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimide (EDCI, 24,59 mg) toe aan deze oplossing.
  6. Laat de reactie 90 minuten doorgaan onder een stikstofatmosfeer. Los 20 mg FA-PEG-NH2 op in 35 μL DMF en voeg dit druppelgewijs toe aan het reactiemengsel.
  7. Roer het resulterende mengsel 72 uur op kamertemperatuur onder stikstof. Zuiver het ruwe product met een 3 kDa MWCO ultrafiltratie-centrifugebuis van 5.200 x g gedurende 30 minuten om niet-gereageerd vrij zuur te verwijderen. Plaats de gezuiverde SQ-PEG-FA-complexe waterige oplossing in een glazen flesje en vries deze voor op -50 °C. Lyofilieer de voorbevroren oplossing in een vriesdroger om het SQ-PEG-FA-complex als gevriesd poeder te verkrijgen.

2. Structurele verificatie van SQ-PEG-FA

  1. Plaats het gelyofilieerde SQ-PEG-FA-complex in een centrifugebuis van 2 mL en droog het verder onder vacuüm in een desiccator gedurende 24 uur. Los het product op in ongeveer 1 mL gedeutegereerd dimethylsulfoxide (DMSO-d6) en doe het over in een NMR-monsterbuis. Voer 1H NMR-analyse uit om de chemische structuur van het complex te bevestigen.
  2. Optimalisatie van de voorbereiding en karakterisering van SQ-CHI-PEG-FA NP'S
  3. Weeg 6,64 mg SQ-CHI en los het op in 2 mL absolute ethanol om een 3,32 mg/mL (4,3 μM) voorraadoplossing te bereiden.
  4. Voeg de SQ-CHI ethanolische voorraadoplossing (1, 0,2, 0,1 of 0,05 mL) druppelgewijs toe aan 1 mL gedeïoniseerd water tijdens het roeren. Roer 5 minuten, verwijder daarna ethanol door verdamping onder verlaagde druk. Sonicaat het resulterende mengsel gedurende 30 minuten om een CHI-SQ nanodeeltjessuspensie te verkrijgen. Meet de hydrodynamische diameter en polydispersie-index (PDI) van de nanodeeltjes met een Zetasizer om de optimale formulering18 te identificeren.
  5. Voeg 0,1 mL van de SQ-CHI ethanolische voorraadoplossing druppelgewijs toe aan 1 mL gedeïoniseerd water na verschillende roertijden (0, 5, 10 of 20 min). Na de betreffende roerperiode wordt ethanol verwijderd door drukverdamping te verminderen, gevolgd door 30 minuten sonicatie om CHI-SQ nanodeeltjessuspensies te verkrijgen. Meet de hydrodynamische diameter en PDI om de optimale roertijd te bepalen.
  6. Voeg 0,1 mL van de SQ-CHI ethanolische voorraadoplossing druppelgewijs toe aan 1 mL gedeïoniseerd water tijdens roeren gedurende 5 minuten. Na het roeren verwijder je ethanol door drukverdamping te verminderen. Sonicate het resulterende mengsel voor verschillende duurden (0, 5, 20 of 30 minuten) om CHI-SQ nanodeeltjessuspensies te verkrijgen. Meet de hydrodynamische diameter en PDI om de optimale sonicatietijd te bepalen.
  7. Bevestig de optimale omstandigheden op basis van bovenstaande resultaten. Hier geldt de verkregen volumeverhouding van water tot voorraadoplossing = 10:1, roertijd = 5 min, en sonicatietijd = 30 minuten. Herhaal alle experimenten onafhankelijk in drievoud om betrouwbaarheid te waarborgen.
  8. Gebruik de single-factor methode terwijl je andere parameters constant houdt. Varieer de volgende factoren sequentieel om hun impact op de deeltjesgrootteverdeling en het Zeta-potentieel van de nanodeeltjes te beoordelen: massaverhouding van componenten (SQ-CHI: SQ-PEG-FA = 1:0, 1:0,05, 1:0,5, 1:0,7), fasevolumeverhouding (waterige fase: organische fase = 1:1, 1:5, 1:10, 1:20) en sonicatietijd (5, 15, 30, 45 min).
  9. Volgens het geoptimaliseerde protocol moet de SQ-CHI en SQ-PEG-FA voorraadoplossingen worden gemengd in de vastgestelde verhouding. Voeg dit mengsel druppelwijs toe aan gedeïoniseerd water onder constant roeren. Roer 5 minuten verder om een grondige menging te garanderen. Verwijder ethanol door drukverdamping, gevolgd door sonicatie van de sonikatie gedurende 30 minuten om de uiteindelijke CHI-SQ-PEG-FA nanodeeltjessuspensie te verkrijgen.
  10. Meet de hydrodynamische diameter, grootteverdeling (PDI) en Zeta-potentiaal van de nanodeeltjes met dynamische lichtverstrooiing met een laserdeeltjesgrootte-analyzer. Observeer de morfologie van de nanodeeltjes met transmissie-elektronenmicroscopie (TEM, 150.000x vergroting) en scanning-elektronenmicroscopie (SEM, 80.000x vergroting).
  11. Bepaling van het inhoud van de geneesmiddelbelasting door ultra-performance vloeistofchromatografie (UPLC)
  12. Stel de chromatografische voorwaarden als volgt in: C18-kolom (2,1 mm x 50 mm, 1,7 μm); Mobiele fase: 0,1% mierenzuur waterige oplossing - acetonitril (75:25, v/v); detectiegolflengte: 258 nm; Debietsnelheid: 0,2 mL/min; kolomtemperatuur: 23 °C; injectievolume: 5 μL; Speelduur: 10 min.
  13. Reconstrueren van de CHI-SQ-PEG-FA NP-suspension en centrifugeren op 7.500 x g gedurende 30 minuten. Verzamel het supernatant en filter het door een microporeus membraan van 0,22 μm. Gebruik het resulterende filtraat als testoplossing. Injecteer en analyseer de testoplossing onder de gespecificeerde chromatografische voorwaarden. Bereken de hoeveelheid geneesmiddellading van de nanodeeltjes op basis van de gemeten CHI-concentratie in het filtrat.

3. In vitro geneesmiddelvrijgavestudie

  1. Pipetteer nauwkeurig een 2 mL aliquot van ofwel een vers bereide CHI-voorraadoplossing of de CHI-SQ-PEG-FA nanodeeltjessuspension in een dialysezak met een molecuulgewichtsafkap van 3 kDa.
  2. Dompel de dialysezak onder in het afscheidsmedium met verschillende concentraties pancreatine (0%, 0,05%, 0,1%, 0,25%). Op vooraf bepaalde tijdsintervallen (0,1, 0,5, 1, 2, 4, 6, 8, 10, 12, 24, 30, 36, 48, 72 uur) wordt 1 mL monsters uit het loslaatmedium gehaald en onmiddellijk vervangen door een gelijke hoeveelheid voorverwarmd vers medium om de zinkcondities te behouden.
  3. Bepaal de concentratie CHI in alle monsters met behulp van de UPLC-methode (chromatografische condities zoals gespecificeerd in sectie 3) en bereken de cumulatieve geneesmiddelafgifte.
  4. Gebruik een ammoniumacetaatbuffer (pH 4,5) als afscheidsmedium. Pipetteer nauwkeurig 2 mL van de nanodeeltjessuspension in een dialysezak (3 kDa). Voeg verschillende activiteitseenheden (0, 0,7, 1,4, 2,8 U) van Cathepsine B direct toe aan de dialysezak. Dompel de zak onder in 40 mL losmedium en incubeer hem in een constante temperatuurshaker bij 37 ± 0,5 °C en 75 rpm. Op de vooraf bepaalde tijdstippen (0,1, 0,5, 1, 2, 4, 6, 8, 10, 12, 24, 30, 36, 48, 72 uur) wordt 1 mL monsters ontnomen en onmiddellijk vervangen door een gelijke hoeveelheid vers, voorverwarmd medium bij dezelfde pH om het evenwicht van het systeem te behouden.
  5. Filter de verzamelde monsters door een microporeus membraan van 0,22 μm. Analyseer de filtraten met UPLC om de geneesmiddelconcentratie te bepalen. Bereken het cumulatieve afgiftepercentage van CHI en plot de profielen van de geneesmiddelafgifte.
  6. Pipetteer nauwkeurig een 2 mL aliquot van ofwel de CHI-voorraadoplossing of de CHI-SQ-PEG-FA NP-ophanging in een dialysezak (3 kDa MWCO). Dompel de dialysezak onder in het afscheidsmedium met verschillende concentraties pancreatine (0%, 0,05%, 0,1%, 0,25%). Op de vooraf bepaalde tijdstippen (0,1, 0,5, 1, 2, 4, 6, 8, 10, 12, 24, 30, 36, 48, 72 uur) wordt 1 mL monsters ontnomen en onmiddellijk vervangen door een gelijke hoeveelheid verse, vooraf opgewarmde vrijlaatmedium om de zinkomstandigheden te behouden.
  7. Kwantificeer de geneesmiddelconcentratie in de monsters met UPLC. Bereken de cumulatieve geneesmiddelafgifte en genereer de afgiftecurves.
  8. Evaluatie van nanodeeltjesstabiliteit in PBS
  9. Meng de CHI-SQ-PEG-FA NP'S MET PBS (PH 7,4) in een verhouding van 1:20 (v/v). Incubeer het mengsel in een shaker met constante temperatuur bij 37 ± 0,5 °C en 100 rpm. Neem monsters op 1, 3, 6, 12, 18, 24, 30, 36, 42, 48, 72, 96 uur om de hydrodynamische diameter en het Zeta-potentiaal te meten.
  10. Celproliferatietest met de MTS-methode
  11. PSN-1 alvleesklierkankercellen werden gekweekt in een volledig RPMI-1640 medium. Cellen in de logaritmische groeifase werden geoogst door vertering met 0,25% trypsine bij 37 °C en opnieuw gesuspendeerd tot een dichtheid van 4-6 x 104 cellen/mL in een volledig medium. De suspensie werd ingezaaid in 96-wellplaten van 100 μL per put, en deze voor 2 uur gekweekt in een 37 °C, 5% CO2-incubator om volledige celadhesie mogelijk te maken.
  12. Aspiraat het oorspronkelijke kweekmedium. Stel een controlegroep (blank kweekmedium) op en meerdere concentratiegradiënten van chidamidegroepen (0,2, 2, 8, 10, 20, 80 pM), met drie replicatieputten per groep. Voeg 100 μL blanco of medicijnhoudend medium toe aan elke put en breng vervolgens de celplaat over naar de incubator voor verdere kweek. Behandel de experimentele groepen met 100 μL vers medium met wisselende concentraties (0,2, 2, 8, 10, 20, 80 pM) SQ-PEG, vrije CHI, CHI-SQ-PEG NP'S OF CHI-SQ-PEG-FA NP'S, TERWIJL DE CONTROLEGROEP EEN GELIJK VOLUME BLANCO MEDIUM ONTVANGT. Na verdere incubatie van 96 uur verwijder je het medium met geneesmiddelen uit elke put.
  13. Voeg 20 μL MTS-werkoplossing toe aan elke put, gevolgd door incubatie gedurende 4 uur. Schud de 96-put plaat gedurende 15 seconden om homogeniteit te waarborgen en meet onmiddellijk de absorptie (A-waarde) van elke put bij een golflengte van 490 nm met een microplaatlezer. Bereken de celproliferatiesnelheid door de OD-waarde van de blanco-groep af te trekken van de OD-waarde van de door medicijnen behandelde groep, het resultaat te delen door het verschil tussen de OD-waarde van de blanke mediumgroep en de OD-waarde van de lege groep, en vervolgens met 100 te vermenigvuldigen.
  14. Vestiging van een in vitro co-gekweekt tumor-sferoidemodel
  15. Meng PSN-1-cellen in de logaritmische groeifase met HPSC-cellen in een verhouding van 2:7 en zaad ze in ultra-low attachment 96-well platen met een dichtheid van 5.000 cellen per put. Na de vorming van de tumorsferoïden behandel je de sferoïden met verschillende nanoformuleringen (Coumarin 6-gelabelde CHI-SQ-PEG/C6 NP's en CHI-SQ-PEG-FA/C6 NP's) of DMSO (als controle) en co-incubeer je ze gedurende 48, 96 en 144 uur om de effectiviteit van het medicijn te evalueren.
  16. Voeg na de incubatie een gelijke hoeveelheid cellevensvatbaarheidsassay-reagens toe aan elke put. Plaats de plaat op een orbitale shaker en schud 15 minuten om volledige lyse te garanderen, gevolgd door incubatie bij kamertemperatuur in het donker gedurende 30 minuten.
  17. Breng het cellysaat over naar een zwarte plaat met 96 putjes. Meet het chemiluminescentiesignaal bij een golflengte van 562 nm met behulp van een multifunctionele microplaatlezer om de levensvatbaarheid van cellen te kwantificeren.
  18. Onderzoek naar de cellulaire opname van nanodeeltjes
  19. Bereid gerichte nanodeeltjes (CHI-SQ-PEG-FA/C6 NP's) en niet-gerichte nanodeeltjes (CHI-SQ-PEG/C6 NP's) voor die coumarine-6 (C6) bevatten als fluorescerende probe. Kweek routinematig PSN-1-cellen in de logaritmische groeifase gedurende 24 uur om een monolaag te vormen. Los coumarin 6 op in ethanol om een 200 μg/mL voorraadoplossing te bereiden. Meng 10 μL van de oplossing met SQ-CHI en SQ-PEG-FA (of SQ-PEG) in een verhouding van 1:0,7, en injecteer het druppelgewijs in gedeïoniseerd water tijdens het roeren. Roer 5 minuten, verwijder ethanol door verdamping en sonicate 30 minuten. Zuiver tenslotte via ultrafiltratie (3 kDa, 12.000 rpm, 20 min) om de items te verkrijgen.
  20. Behandel de cellen als volgt: de experimentele groepen ontvangen een serumvrij medium met vrije C6, CHI-SQ-PEG/C6 NP's, of CHI-SQ-PEG-FA/C6 NP's (met een uiteindelijke CHI-concentratie van 5 μmol/L en een C6-concentratie van 2,6 μmol/L), terwijl de controlegroep een gelijk volume blanco medium ontvangt.
  21. Na 4 uur, 12 uur en 24 uur aspireer je het medium dat het medicijn bevat. Kleurcelkernen gebruiken 4',6-diamidino-2-fenylindool (DAPI)19.
  22. Waarnemingen uitvoeren onder een fluorescentiemicroscoop (40x, excitatiegolflengte Ex=360 nm, emissiegolflengte Em=477 nm). Beoordeel de cellulaire opname van nanodeeltjes door de fluorescentieintensiteit van coumarin-6 te meten.

4. Statistische analyse

  1. Voer alle experimenten uit met minimaal 3 replicaten om de gegevens uit deze studie te verkrijgen. Analyseer statistieken met behulp van GraphPad Prism-software. Presenteer experimentele gegevens als gemiddelde ± standaardfout van het gemiddelde (SD), en vergelijk groepen met behulp van de Student's t-test, eenrichtings-ANOVA of Wilcoxon-test waar passend. Stel de drempel voor statistische significantie in op P < 0,05.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Deze studie ontwierp en evalueerde met succes een nieuw gericht nanogeneesmiddelafgiftesysteem -- Chidamide Squalenylation Prodrug-based Self-assembled Nanoparticles (CHI-SQ-PEG-FA NP'S; Figuur 1). We synthetiseerden CHI-SQ-PEG-FA NP'S (Figuur 2) en evalueerden systematisch de effecten van verschillende parameters, waaronder de olie-waterfaseverhouding (Figuur 3A), roerduur (Fig...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Deze studie biedt een praktische stapsgewijze gids voor het implementeren van een low-waist systeem gebaseerd op nanodeeltjeszelfassemblage. De zelfgeassembleerde nanodeeltjes die in deze studie werden verkregen, vertoonden een regelmatige bolvorm, goede verspreiding, uniforme deeltjesgrootte, hoge geneesmiddelbelasting en inkapselingsefficiëntie, en toonden bevredigende stabiliteit21. Een 3D-tumor sferoïde co-kweekmodel (PSN-1/HPSC) werd gebruikt om de penetratie...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De auteurs geven geen belangenconflicten aan.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dit werk werd ondersteund door subsidies van de Zhejiang Provincie Natuurwetenschappelijke Stichting (LZ23H290001, LY19H280001); subsidies van de National Natural Science Foundation of China (82474338 en 82274364); Zhejiang Provinciale Drie Plattelandsgebieden en Negen Partijen Landbouwwetenschap en Technologie Samenwerkingsprogramma (2025SNJF075); evenals het Public Welfare Research Project van Huzhou Science and Technology Grand (2021GZ261); evenals het Algemeen Wetenschappelijk Onderzoeksproject van het Provinciale Onderwijsdepartement van Zhejiang (Y202456442, 2025YKJ10).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

```html

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
0.25% trypsin-EDTAGibco (USA)25200072
1-Ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimide hydrochloride (EDCI)Sigma-Aldrich (USA)E6383
2 mL cryogenic vialsCorning (USA)430488
96-well cell culture platesCorning (USA)3598
absolute ethanolChina National Pharmaceutical Group Corp. (Sinopharm)100092680
acetoneChina National Pharmaceutical Group Corp. (Sinopharm)32201-2.5L
acetonitrileTedia (USA)A998-4HPLC grade
ammonium acetateChina National Pharmaceutical Group Corp. (Sinopharm)10002861
anhydrous sodium sulfateSigma-Aldrich (USA)31481
biological safety cabinetThermo Fisher Scientific, USA1380, 1332, 1356
cell culture flasksCorning (USA)CLS430372
cell culture incubatorThermo Fisher Scientific, USAHERA51901126
chidamide(CHI)Shenzhen Microcore Biotech Co., Ltd. (China)purity >95%
Cytation 5 multimode microplate readerBioTek, USACYT5MV
DF-101S thermostatic magnetic heating stirrerZhengzhou Kechuang Instrument Co., Ltd., China
dichloromethaneChina National Pharmaceutical Group Corp. (Sinopharm)80047318
dimethyl sulfoxide(DMSO)Sigma-Aldrich (USA)D2650
dioxaneAladdin (China)D116156-5ml
DMEM mediumGibco (USA)12100046
Dulbecco's phosphate-buffered saline (DPBS)Gibco (USA)14040141
ethyl acetateChina National Pharmaceutical Group Corp. (Sinopharm)10009460
ethyl etherChina National Pharmaceutical Group Corp. (Sinopharm)
FA2004B electronic balanceShanghai Tianmei Balance Instrument Co., Ltd., ChinaFA2004B
Fetal bovine serum(FBS)Gibco (USA)10099141C
folate-poly(ethylene glycol)-amine (FA-PEG-NH2)Shanghai Pengshu Biological Technology Co., Ltd. (China)PS2-NFA-2000
Formic acidAladdin (China)F112034HPLC grade
freeze dryerThermo Fisher Scientific, USA
human cathepsin BSigma-Aldrich (USA)SRP0289
Human pancreatic cancer cell lines (PSN-1, CFPAC-1)the American Type Culture Collection (ATCC)CRL-3211, CRL-1918
human pancreatic stellate cells (HPaStec, HPSC)the American Type Culture Collection (ATCC)
human trypsinSigma-Aldrich (USA)
hydrochloric acidChina National Pharmaceutical Group Corp. (Sinopharm)CFSR-10011008
inverted microscopeOlympus, JapanIX83
Iscove's Modified Dulbecco's Medium (IMDM)Gibco (USA)12440053
IX 1000 vortex mixer Hangzhou Ruicheng Instrument Co., Ltd., ChinaIX 1000
methanolChina National Pharmaceutical Group Corp. (Sinopharm)M433287-10L
methanol Tedia (USA)MS1922-001HPLC grade
microcentrifuge tubes (1.5/2.0 mL)Axygen (USA)MCT-150-C
micropipettes (20, 100, and 1000 μL)Thermo Fisher Scientific, USA4642050, 4642070, 4642090
Mill-Q water purification system Millipore, USAZR0Q00800
 MTS assay kit (3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-5-(3-carboxymethoxyphenyl)-2-(4-sulfophenyl)-2H-tetrazolium)Promega (USA)G3582
N,N-Dimethylformamide (DMF)Aladdin (China)
N-bromosuccinimide (NBS)Sigma-Aldrich (USA)B81255
N-Hydroxysuccinimide (NHS)Sigma-Aldrich (USA)56480
Optima Max ultracentrifuge Beckman, USA393490
penicillin/streptomycin solutionGibco (USA)15140-122
periodic acidSigma-Aldrich (USA)P7875
petroleum etherChina National Pharmaceutical Group Corp. (Sinopharm)
phenazine methosulfate(PMS)Sigma-Aldrich (USA)3180806
phosphate-buffered saline (PBS)Gibco (USA)70011069
Poly(ethylene glycol)-amine (PEG-NH2)Shanghai Pengshu Biological Technology Co., Ltd. (China)PG2-AM-20k
RPMI-1640 mediumGibco (USA)31800022
silica gel powderSigma-Aldrich (USA)53698300 mesh
sodium bicarbonateSigma-Aldrich (USA)401676
sodium chlorideChina National Pharmaceutical Group Corp. (Sinopharm)10019318
sodium dichromate dihydrateSigma-Aldrich (USA)1.93689
SqualeneSigma-Aldrich (USA)Y0002131
sterile centrifuge tubes (15 and 50 mL)Corning (USA)430791, 430828
sulfuric acidChina National Pharmaceutical Group Corp. (Sinopharm)10021618
TetrahydrofuranChina National Pharmaceutical Group Corp. (Sinopharm)34865-4X4Lanalytical grade
ultrafiltration centrifugal tubes (molecular weight cut-

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Wang, Y., et al. Role of the microbiome in occurrence, development and treatment of pancreatic cancer. Mol Cancer. 18, 173(2019).
  2. Chen, K., et al. Single-cell RNA-seq reveals dynamic change in tumor microenvironment during pancreatic ductal adenocarcinoma malignant progression. EBioMedicine. 66, 103315(2021).
  3. Mascharak, S., et al. Desmoplastic stromal signatures predict patient outcomes in pancreatic ductal adenocarcinoma. Cell Rep Med. 4 (11), 101248(2023).
  4. Fu, Y., et al. Unbiasedly decoding the tumor microenvironment with single-cell multiomics analysis in pancreatic cancer. Mol Cancer. 23 (1), 140(2024).
  5. Helms, E., Onate, M. K., Sherman, M. H. Fibroblast heterogeneity in the pancreatic tumor microenvironment. Cancer Discov. 10, 648-656 (2020).
  6. Navarro Chica, C. E., et al. Design and characterization of squalene-Gusperimus nanoparticles for modulation of innate immunity. Int J Pharm. 590, 119893(2020).
  7. Rodríguez-Nogales, C., et al. Squalenoylgemcitabine/edelfosine nanoassemblies: anticancer activity in pediatric cancer cells and pharmacokinetic profile in mice. Int J Pharm. 582, 119345(2020).
  8. Emamzadeh, M., et al. Dual controlled delivery of squalenoyl-gemcitabine and paclitaxel using thermo-responsive polymeric micelles for pancreatic cancer. J Mater Chem B. 6, 2230-2239 (2018).
  9. Bulanadi, J. C., et al. Biomimetic gemcitabinelipid prodrug nanoparticles for pancreatic cancer. Chemplus chem. 85, 1283-1291 (2020).
  10. Yang, H., et al. High-level 5-methyltetrahydrofolate bioproduction in bacillus subtilis by combining modular engineering and transcriptomics-guided global metabolic regulation. J Agric Food Chem. 70 (19), 5849-5859 (2022).
  11. De Santis, M. C., et al. Signaling pathways regulating redox balance in cancer metabolism. Front Oncol. 8, 126(2018).
  12. Rushing, B. R., et al. Exploratory metabolomics underscores the folate enzyme ALDH1L1 as a regulator of glycine and methylation reactions. Molecules. 27 (23), 8394(2022).
  13. Matsumura, Y., Maeda, H. A new concept for macromolecular therapeutics in cancer chemotherapy: mechanism of tumoritropic accumulation of proteins and the antitumor agent smancs. Cancer Res. 46 (12 Pt 1), 6387-6392 (1986).
  14. Zheng, H. Expression and significance of molecular imaging marker folate receptor α in pancreatic cancer. J Shandong Uni Health Sci. 48 (3), 83-85 (2010).
  15. Zhang, N., et al. Chidamide combined with paclitaxel effectively reverses the expression of histone deacetylase in lung cancer. Anticancer Drugs. 31, 702-708 (2020).
  16. He, M., et al. Chidamide Inhibits Aerobic Metabolism to Induce Pancreatic Cancer Cell Growth Arrest by Promoting Mcl-1 Degradation. PLoS ONE. 11 (11), e0166896(2017).
  17. Chen, Q. B., et al. Extraction and Structural Characterization of Squalene from Siraitia grosvenorii Seeds. Guangxi Zhiwu. 26 (6), 687-689 (2006).
  18. Xu, M. Y., et al. Application Study of Nano Laser Particle Size Analyzer in Silica Sol Particle Size Testing. Diamond Abrasives Eng. 35 (02), 55-58 (2015).
  19. Shen, Z., et al. Study on the binding characteristics of 4',6-diamidino-2-phenylindole to DNA. Acta Biophysica Sinica. (03), 352-356 (1991).
  20. Mahajan, R. R., et al. Oral Administration of Neratinib Maleate-Loaded Lipid-Polymer Hybrid Nanoparticles: Optimization, Physical Characterization, and In Vivo Evaluation. Pharmaceutics. 17 (2), 221(2025).
  21. Ouyang, P., Lu, Y. Research progress on dispersion stability of nanoparticles in lubricating oil. Appl Chem Ind. 51 (6), 1843-1847 (2022).
  22. Xiao, S., et al. Development and application of folic acid-conjugated starch nanoparticles as a tumor-targeting drug delivery carrier. Chin Sci Bull. 51 (10), 1151-1155 (2006).
  23. Song, Y., Shi, W., Chen, W. Fluorescent carbon nanodots conjugated with folic acid for distinguishing folate-receptor-positive cancer cells from normal cells. J Mater Chem. 22 (25), 12568-12573 (2012).
  24. Tie, Y., et al. Targeting folate receptor β positive tumor-associated macrophages in lung cancer with a folate-modified liposomal complex. Signal Transduct Target Ther. 5, 6(2020).
  25. Li, C., et al. Small molecule nanodrug assembled of dual-anticancer drug conjugate for synergetic cancer metastasis therapy. Bioconjug Chem. 29, 3495-3502 (2018).
  26. Dormont, F., et al. Squalene-based multidrug nanoparticles for improved mitigation of uncontrolled inflammation in rodents. Sci Adv. 6, eaaz5466(2020).
  27. Jiang, W., et al. Intravenous delivery of enzalutamide based on high drug loading multifunctional graphene oxide nanoparticles for castration-resistant prostate cancer therapy. J Nanobiotechnol. 18, 50(2020).
  28. Yong, T. Y. Exocytosis of porous silicon nanoparticles and their application in deep tumor penetration and cancer stem cell therapy. [Doctoral dissertation]. , Huazhong Univ Sci Technol. (2017).
  29. Bulanadi, J. C., et al. Biomimetic gemcitabine lipid prodrug nanoparticles for pancreatic cancer. ChemPlusChem. 85, 1283-1291 (2020).
  30. Zhang, W., et al. Prodrug-like acetylmannosamine modified liposomes loaded with arsenic trioxide for the treatment of orthotopic glioma in mice. J Pharm Sci. 109, 2861-2873 (2020).
  31. Fan, X. X., et al. ROS-responsive berberine polymeric micelles effectively suppressed the inflammation of rheumatoid arthritis by targeting mitochondria. Nano-Micro Lett. 12, 76(2020).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Enzyme Responsive NanoparticlesSqualene Chidamide ProdrugPancreatic CancerExtracellular MatrixDrug PenetrationFolate Modified NanoparticlesControlled Drug ReleaseCellular UptakeTumor TargetingProdrug Synthesis

Related Articles