Methodenartikel

Spectroscopische superresolutiebeeldvorming van DNA-moleculen met intrinsiek contrast

DOI:

10.3791/69917

⸱

6 maart 2026

 ,  ,  ,  , 
1Department of Biomedical Engineering, Northwestern University, 2Center for Physical Genomics and Engineering, Northwestern University, 3Department of Gastroenterology and Hepatology, Northwestern Memorial Hospital

In dit artikel

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dit protocol biedt gedetailleerde bewerkingen voor monstervoorbereiding, gegevensverzameling en analyse van DNA intrinsieke fluorescentiespectra.

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Superresolutiebeeldvorming heeft biologisch onderzoek gerevolutioneerd door structurele details op nanoschaal bloot te leggen. De meeste optische superresolutiemethoden vertrouwen op fluorescentielabeling van biomoleculen, wat specifieke tagging van moleculaire soorten mogelijk maakt, maar cellulaire functies kan verstoren, onnauwkeurigheden van linkermoleculen kan introduceren en niet de consistente hoge labelingdichtheid kan leveren die nodig is voor chromatinebeeldvorming op de schaal van individuele DNA-moleculen. Een technologie die labelvrije, in situ genomische beeldvorming met nanometerresolutie mogelijk maakt, zou een diepgaande impact op de biologie hebben. Hier presenteren we een protocol dat de intrinsieke fluorescentie van DNA benut om spectroscopische single-molecule localization microscopy (sSMLM) uit te voeren. Het protocol beschrijft de voorbereiding van monsters, gegevensverzameling en spectrale analyse. Kort gezegd wordt een dunne DNA-gel gemaakt door een polynucleotideoplossing op glas af te brengen en het urenlang te laten drogen. Na gelvorming wordt het monster in aanwezigheid van een beeldvormingsbuffer met behulp van sSMLM gefotografeerd. De opgenomen dataset bestaat uit een afbeelding van nulde orde, die ruimtelijke lokalisaties biedt, en een afbeelding van de eerste orde, die het emissiespectrum van elke lokalisatie codeert. Ruimtelijke reconstructies worden gegenereerd uit de nulde-orde data, waarna de bijbehorende spectra worden geëxtraheerd uit het eerste-orde signaal. Tot slot demonstreren we de haalbaarheid van deze aanpak met behulp van meerdere excitatiegolflengten en DNA-moleculen met verschillende lengtes, sequenties en samenstellingen.

Inleiding

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Superresolutie-fluorescentiemicroscopietechnieken – waaronder structured illumination microscopy (SIM), gestimuleerde emissiedepletiemicroscopie (STED) en single molecule localization microscopy (SMLM) benaderingen zoals fotoactivated localization microscopy (PALM) en stochastic optical reconstruction microscopie (STORM) – hebben de resolutie van optische microscopie ver voorbij de diffractiegrens 1,2,3,4 gebracht.5,6,7, waardoor ongekende toegang tot de nanoschaalorganisatie van chromatine 8,9,10,11,12 mogelijk is. Huidige kleuringsmethoden voor het visualiseren van nucleïnezuurstructuren zijn echter gebaseerd op het labelen van DNA-geassocieerde eiwitten in plaats van op het DNA zelf, of maken gebruik van kleine-molecuulkleurstoffen die de natuurlijke chromatineconfiguratie kunnen verstoren en de levensvatbaarheid van cellen kunnen aantasten13,14. Vanwege deze beperkingen is de ontwikkeling van labelvrije optische superresolutie-beeldvormingsmethoden onder inheemse, niet-verstorende omstandigheden zeer wenselijk. Het hier gepresenteerde protocol is bedoeld voor synthetisch gezuiverde enkelstrengs of dubbelstrengs DNA-nucleotiden, waarbij intrinsieke fluorescentie betrouwbaar kan worden gedetecteerd; het is niet geoptimaliseerd voor het beeldgeven van nucleaire DNA-moleculen in vaste cel of levende.

Omdat nucleïnezuren lange tijd als niet-fluorescerend werden beschouwd vanwege hun extreem lage quantumopbrengst (ongeveer 10−4 bij UV-excitatie) en ultrasnelle fluorescentieverval bijkamertemperatuur 15, waren studies naar de intrinsieke fluorescentie van DNA (voornamelijk de fluorescentielevensduur) zeldzaam totdat femtosecondenspectroscopie werd ontwikkeld. Het is algemeen bekend dat nucleotiden zwak fluoresceren onder UV-verlichting, terwijl hun absorptie in het zichtbare bereik aanzienlijk zwakker is. Desalniettemin is recentelijk waargenomen dat zichtbare, door licht geëxciteerde fluorescentie van ongemodificeerde nucleïnezuren bij fysiologisch relevante concentraties bestaat16. Dit fenomeen is waarschijnlijk over het hoofd gezien omdat de meeste fotochemische studies van nucleotiden werden uitgevoerd in verdunde oplossingen (10-100 μM)17,18,19,20, terwijl in kernen en chromosomen DNA-concentraties kunnen oplopen tot 0,1-1 M 21,22,23. Belangrijker nog, stochastische fluorescentieswitching onder zichtbare verlichtingwerd waargenomen, waarmee de basis werd gelegd voor het gebruik van ongemodificeerde nucleïnezuren als endogene contrastmiddelen voor lokalisatie-gebaseerde superresolutiemicroscopie.

De fotochemische eigenschappen van nucleotidemonomeren en enkelstrengs DNA-moleculen met eenvoudige sequenties bij fysiologische concentraties onder zichtbaar-licht excitatie zijn onderzocht24. Er is ook aangetoond dat deze DNA-moleculen stochastische fluorescentieswitchende eigenschappen hebben, wat goed aansluit bij de theorie van grondtoestanddepletie (GSD)6,7 door het fluorescentieherstel van nucleotiden onder wisselende depletieomstandigheden te onderzoeken. Bovendien, omdat nucleotiden relatief hoge kwantumopbrengsten en lage intersysteem-kruisingskansen vertonen, zijn de fotonentellingen en knippertijden van emissiegebeurtenissen van één molecuul vergelijkbaar met die van populaire exogene kleurstoffen in STORM (bijv. Alexa Fluor 647), met verschillende spectra25,26 en maken DNA een ideaal intrinsiek contrastmiddel voor beeldvorming met hoge resolutie. Daarnaast maakt het implementeren van het spectrale regressie-algoritme zoals beschreven in de vorige sectie sub-tien nanometer superresolutiebeeldvorming van polynucleotiden en lineaire enkelstrengs DNA-vezelsmogelijk 27.

Om het volledige spectrum van DNA-intrinsieke fluorescentie vast te leggen, gebruikten we een dual-wedge prisma (DWP) voor spectrale detectie, waarmee gelijktijdige high-throughput single-molecule spectroscopische analyse en beeldvorming mogelijk is met minimaal transmissieverlies en golffrontfout 28,29,30, en een open source spectroscopische SMLM-analysesoftware (RainbowSTORM) voor automatische dataverwerking 31,32. Voortbouwend op deze capaciteit ontwikkelden we een multi-laser SMLM-platform geïntegreerd met spectroscopische detectie en een speciale spectrale analysepijplijn. Het protocol dat we hier presenteren omvat monstervoorbereiding, gegevensverzameling en analyse, en biedt een reproduceerbare workflow voor het benutten van DNA-intrinsieke fluorescentie in single-molecule localisatiemicroscopie. Naast het mogelijk maken van proof-of-concept-studies naar het beelden van enkelstrengs oligonucleotiden en dubbelstrengs DNA-moleculen met intrinsiek contrast, legde de aanpak een basis voor bredere toepassingen in DNA-beeldvorming onder native, labelvrije omstandigheden, zoals sequentievoorspelling gebaseerd op intrinsieke fluorescentie van DNA gecombineerd met computationele methoden.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Voorbereiding van DNA-gelmonsters (Figuur 1A)

  1. Los het DNA-monster (ofwel oligonucleotide of dubbelstrengs DNA) poeder op in nucleasevrij gedeïoniseerd water tot een uiteindelijke concentratie van 100 mM en bewaar de voorraadoplossing bij -4 °C.
  2. Bereid 5 μL aliquots voor om herhaalde vries-dooicycli te minimaliseren. Als je bevroren aliquots gebruikt, ontdooi ze dan 5-15 minuten op kamertemperatuur, afhankelijk van het volume.
  3. Maak een glazen glaasje voorzichtig schoon met een laboratoriumdoekje. Pipetteer 5 μL van de 100 mM DNA-molecuuloplossing op de vers gereinigde glazen glaasglade en laat deze 1-3 uur verdampen, waardoor een DNA-gel ontstaat.
  4. Bedien deze stap in een dampkap voor de veiligheid. Bereid de beeldbuffer voor volgens de Materiaaltafel. Zowel de β-mercaptoethanolbuffer als de DABCO-buffer werden gevalideerd om stochastische fotoswitching van DNA-moleculen te ondersteunen.
  5. Bedien deze stap in een dampkap voor de veiligheid. Voeg 5 μL beeldvormingsbuffer toe aan de DNA-gel en plaats direct voor de beeldvorming een deklaag bovenop. Er zouden belletjes in het bedekte monster kunnen zitten. Gebruik een pincet om de belletjes in het bedekte monster te verwijderen,

2. Kalibratie van het sSMLM-systeem en gegevensverzameling (Figuur 1B)

  1. Bereid een gefabriceerde nanogatarray voor met een gatdiameter van 100 nm en een afstand van 4 μm, gerangschikt in 8 rijen x 5 kolommen voor de volgende kalibratie van het spectroscopische SMLM-systeem33.
    OPMERKING: Alternatief kan de resolutiekaart (R3L1S4N) van de United States Air Force (USAF) uit 1951 ook worden gebruikt voor de spectrale kalibratie33.
    1. Produceer de nanogatarray door sequentiële metaalsputtering en gefocust ionenbundel (FIB) frezen. Eerst breng je een aluminiumfilm van 150 nm dik aan op een 22 x 22 mm borosilicaatglazen deklaag met DC-sputtering bij 75 W en 20 standaard kubieke centimeter per minuut (SCCM) argonstroom bij 3 mTorr.
    2. Vorm een 5 x 8 nanogatarray in de aluminiumlaag met behulp van FIB-frees, werkend op een versnellingsspanning van 30 kV.
  2. Zet het spectroscopische SMLM-systeem aan (Figuur 2), plaats smalbandfilters (532 nm, 580 nm, 633 nm, 680 nm en 750 nm) direct voor de camera, en gebruik een witte lichtbron (bijvoorbeeld de microscooplamp) om het kalibratiemonster te verlichten.
  3. Verzamel 10 frames per filter. Stel de belichtingstijd in op 532 nm, 580 nm, 633 nm en 680 nm op 200 ms en op 2000 ms op 750 nm vanwege de lage intensiteit van de lamp en de lage efficiëntie van de camera in het nabij-infraroodgebied (Figuur 3).
  4. Laad het DNA-gelmonster op de microscoop, zorg dat de dekmantelzijde naar het objectief is gericht, en open de camerasoftware voor gegevensverzameling.
  5. Identificeer de juiste z-positie met behulp van het automatische scherpsteltrackingsysteem, zodat duidelijk stochastisch knipperen zichtbaar is. Deze stap is cruciaal en vereist geduld, omdat DNA-gelmonsters duidelijke morfologische aanwijzingen zoals celstructuren missen, waardoor het moeilijk is om naar een goed signaal te navigeren.
  6. Zorg ervoor dat het objectief de afdekkingsrand niet raakt, omdat dit bufferlekkage in de dompelolie kan veroorzaken en de tracking kan verstoren.
  7. Verkrijg 10.000-30.000 beelden met een typisch belichtingsvermogen van 5 kW/cm² en een belichtingstijd van 30 ms. Pas het aantal beelden, het belichtingsvermogen en de belichtingstijd aan indien nodig. Na de acquisitie zal de software de gegevens standaard in nd2-formaat opslaan.
  8. Na voltooiing van het experiment wordt het glazen glaasje in een goedgekeurde container voor scherp afval (bijvoorbeeld gebroken glas of vuilafvalbak) weggegooid en alle resterende buffers in de aangewezen container voor vochtig afval gegooid in overeenstemming met de institutionele veiligheidsrichtlijnen.

3. Analyse van kalibratie- en spectroscopiegegevens (Figuur 1C)

  1. Laad de verkregen ruwe beeldstack van het DNA-monster in FIJI (Windows 64-bit), met behulp van de Bio-Formats Plugin.
  2. Trek de minimale projectie af van de stapel om een achtergrond-afgetrokken dataset te verkrijgen en bewaar deze voor spectrale analyse. Voor de geladen raw image stack selecteer je Image > Stacks > Z Project en kies Min-intensiteit in het type Projectie. Selecteer vervolgens de calculator Beeldverwerking >om de minimale projectie van de raw-beeldstapel af te trekken en op te slaan als een TIFF.
  3. Voer lokalisatieidentificatie uit op de nulde-orde ruwe beeldstack met behulp van de ThunderSTORM-plugin (versie 1.3). Gebruik geschikte parameters (bijv. drempel = 1,2 x std (Wave.F1), sigma = 1,5, fit radius = 3) om het nule-orde beeld te reconstrueren en de coördinaten van het emissie-evenement (eenheden: nm) te extraheren. Voor de bijgesneden raw-image stack van nulde orde kies je Plugin > ThunderSTORM > Run analysis.
  4. Gebruik FIJI en de open-source software RainbowSTORM (GitHub-link in32, met MATLAB-versie nieuwer dan 2020b) om de kalibratiegegevens te verwerken en zo de relatie tussen horizontale en verticale verschuivingen en de golflengten31,32 te verkrijgen.
    1. Voer lokalisatieidentificatie uit op de kalibratiebeelden van de 5 golflengten met behulp van de ThunderSTORM-plugin. Gebruik geschikte parameters (bijv. drempel = 5 x std (Wave.F1), sigma = 1,5, fitradius = 3) om de lokalisaties van de nanogaten op de nulde orde en hun bijbehorende spectrale lokalisaties op de eerste orde te reconstrueren.
    2. Pas de drempel aan (bijvoorbeeld in een bereik van 5-10 x std (Wave.F1)) totdat er 80 lokalisaties zijn voor elk kalibratiebeeld.
    3. Voer de RainbowSTORM uit en klik op Spectrale Kalibratie > Blader door en laad de CSV-bestanden voor elke kalibratiegolflengte (532 nm, 580 nm, 633 nm, 680 nm, 750 nm) vanaf de vorige stap. Klik op Kalibratiebestand opslaan.
  5. Zet de nanometer-gebaseerde coördinaten om in pixelcoördinaten en koppel ze aan het bijbehorende spectrale venster op basis van de horizontale en verticale verschuivingen van de nulde orde naar de eerste orde, bepaald in de kalibratie (Figuur 4), om het volledige spectrum van DNA-intrinsieke fluorescentie te meten.
    1. Gebruik aangepaste Python-scripts34 (versie 3.11.7) om de volledige spectrumdata te extraheren met de volgende stappen.
    2. Stel correcte bestandspaden in voor de achtergrond-afgetrokken afbeeldingstack (.tiff) uit stap 3.2, het localisatie-CSV-bestand (.csv) geproduceerd uit stap 3.3, en het kalibratiebestand uit stap 3.4 (.mat).
    3. Gebruik 900-950 pixels als horizontale verschuiving voor de 488 nm-data die met de 3D-DWP is verkregen, wat overeenkomt met een spectraal venster van 484-588 nm, iets breder dan het filterbereik van 500-550 nm om dekking te garanderen.
    4. Gebruik 925-984 pixels als horizontale verschuiving voor de 532 nm data die met de 3D DWP worden verkregen, overeenkomend met een spectraal venster van 525-750 nm, opnieuw gekozen om breder te zijn dan het 590-650 nm filterbereik.
    5. Gebruik 23 pixels als verticale verschuiving voor zowel de 488 nm als 532 nm data met de 3D DWP.
      De bovenstaande waarden zijn afgeleid van de spectrale kalibratiecurve verkregen met RainbowSTORM. De Python-scripts voor de full spectrum meting zijn te vinden in34.
  6. Lineariseer het niet-lineaire spectrum voor latere analyse (vergelijking, classificatie, enz.) met behulp van een3-rde orde polynomiële fitting (Figuur 3).

Resultaten

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Het volledige proces – van monstervoorbereiding tot dataverzameling en analyse – voor één beeldstack van een DNA-monster duurt ongeveer 120 minuten, ervan uitgaande dat DNA-gelvorming 1 uur duurt (Figuur 1). De gecombineerde tijd voor ontdooien, gelvorming en spectrale kalibratie is vastgesteld op ongeveer 90 minuten, ongeacht het aantal beelden of monsters in het experiment. Om de efficiëntie te maximaliseren, raden we aan om meerdere beeldstacks over meerdere samples in één sessie te verzamelen.

Representatieve realtime beelden die na de DWP zijn verkregen, worden weergegeven in Figuur 1B en Figuur 3A, waarbij fluorescentiesignalen worden opgesplitst in de nulde orde (links, met ruimtelijke informatie) en de eerste orde (rechts, met spectrale informatie). In Figuur 1B werden beelden gemaakt met de 2D DWP-configuratie, waarbij de afstand tussen nulde en eerste-orde beelden relatief klein is. Daarentegen toont Figuur 3A gegevens verzameld met de 3D DWP, waarbij de twee diffractieordens verder van elkaar gescheiden zijn vanwege het ontworpen optische padverschil dat nodig is voor tweedekker 3D-beeldvorming. Alle gegevens in Figuur 1C, Figuur 3 en Figuur 4 zijn verzameld met de 3D DWP-configuratie. De keuze tussen 2D- en 3D-beeldvorming hangt af van het experimentele doel: voor intrinsieke fluorescentiespectrale metingen van gesynthetiseerde DNA-monsters wordt de 2D-DWP over het algemeen geprefereerd omdat deze monsters geen relevante driedimensionale structurele kenmerken hebben, hoewel de 3D-DWP-configuratie ook kan worden gebruikt wanneer axiale informatie gewenst is.

Samen tonen deze representatieve resultaten de kerncapaciteit van het DWP-gebaseerde beeldplatform aan om gelijktijdig ruimtelijke lokalisatie- en emissiespectra van individuele DNA-moleculen in realtime te onderscheiden. Goede systeemprestaties worden aangegeven door de duidelijke en stabiele scheiding tussen het nule-orde ruimtelijke beeld en het eerste-orde spectraal verspreid beeld, waarbij elke enkele molecuul-lokalisatie in de nulde orde overeenkomt met een onderscheiden spectraal spoor in de eerste-orde. Kwantitatieve spectrale analyse wordt uitgevoerd door geïsoleerde gebeurtenissen van één molecuul in het nulde-orde beeld te identificeren, de relatieve pixelverschuiving van het bijbehorende eerste-orde signaal te meten en deze verschuiving om te zetten in golflengte met behulp van een gekalibreerde mappingfunctie. Omdat de relatie tussen pixelverplaatsing en emissiegolflengte niet-lineair is, wordt een derde-orde polynoompassing toegepast om lineaire emissiespectra nauwkeurig te reconstrueren uit ruwe data28. De resulterende enkelmolecuulspectra kunnen verder worden geïntegreerd in computationele analysepijplijnen, waaronder machine learning- of deep learning-modellen, om spectrale classificatie en afleiding van DNA-sequentiesamenstelling of moleculaire structuur mogelijk te maken op basis van intrinsieke fluorescentiesignaturen onder verschillende verlichtingsomstandigheden en fotofysische toestanden.

Alle gegevens die in dit protocol worden getoond, zijn verzameld met behulp van de β-mercaptoethanol-gebaseerde imaging buffer35. In principe zou elke beeldvormingsbuffer die het fluorofor-fotoschakelgedrag verbetert, compatibel moeten zijn met deze benadering, bijvoorbeeld DABCO-gebaseerde beeldvormingsbuffer36. De geteste DNA-moleculen omvatten 20-base enkelstrengs A, G, C, T; 40-basis enkelstrengs AC-keten (A1C1, A5C5, A10C10, A20C20); enkelstrengs Guanine van 5, 8, 12, 16 basis; 20-basenpaar dubbelstrengs GC en AT (zie Materiaaltabel voor gedetailleerde informatie). De selectie van 20- en 40-base DNA-constructen is gebaseerd op de observatie dat een 40-base DNA-keten een compacte conformatie aanneemt met een effectieve grootte van minder dan 40 x 3,4 = 13,6 nm, waardoor deze onder de resolutielimiet van het gereconstrueerde SMLM-beeld komt. De excitatiegolflengten (488 nm en 532 nm) waren niet uniek geoptimaliseerd voor specifieke sequenties, maar werden eerder geselecteerd om aan te tonen dat intrinsieke DNA-fluorescentie robuust kan worden gedetecteerd over verschillende basissamenstellingen en conformationele toestanden met behulp van beide golflengten. We testten de beeldvormingsbuffer zoals weergegeven in Aanvullende Figuur 1 en vonden bijna geen stochastische blinksignalen waargenomen, waardoor buffercomponenten en glasbehandelingen werden uitgesloten. Alleen de DNA-gel + beeldvormingsbuffer gaf een significant aantal knipperingen. De glazen glaasjes en dekfolies waren schoon en zorgvuldig behandeld, terwijl de monstergel in een afgesloten omgeving werd gevormd. Daarom is het onwaarschijnlijk dat de gedetecteerde signalen afkomstig zijn van onzuiverheden of autofluorescentie van het substraat. We hebben ook het signaal van zowel de drooggel als de DNA-oplossing gemeten en ontdekt dat er geen significant verschil was, dus fotochemische artefacten tijdens het drogen zijn niet de belangrijkste bron van de signalen. Fotodegradatieproducten vertonen meestal brede spectra en hebben geen knipperende eigenschappen, wat nooit in onze studie is waargenomen. De kwantitatieve detectielimieten, weerspiegeld door het minimale fotonenaantal van lokalisaties, zijn 30 - 50 [fotonentelling]. Deze waarde blijft hetzelfde voor DNA-monsters en gelabelde systemen, zoals AF647-gelabelde H3K9me3 in gefixeerde cellen. De gemiddelde lokalisatieprecisie van de DNA-intrinsieke fluorescentie is ongeveer 15 - 25 nm, terwijl de AF647 ongeveer 10 - 15 nm is.

In het 2D-scenario heeft het gereconstrueerde SMLM-beeld een pixelgrootte van 22 nm. De precisie van de lokalisaties van stochastische emissies heeft een gemiddelde van ~20 nm, wat het betrouwbaarheidsinterval beschrijft van waar het enkele molecuul zich lokaliseert. De monsters die op intrinsieke fluorescentie zijn getest, hebben echter geen biologische structuren, waardoor de resolutie van de structuren niet kan worden geïnterpreteerd. De coherente Ramanverstrooiingsmicroscopie zou een resolutie hebben van 250 - 300 nm37, en de UV-tweefoton heeft een resolutie van 300 nm38. De signaal-ruisverhouding van coherente Ramanverstrooiingsbeeldvorming ligt tussen 10 en 10039, terwijl deze 2 - 20 is (vaak uitgedrukt als signaal-naar-beide-standaardafwijking, SSDR) voor UV 2-fotonmicroscopie 40,41. De SNR voor DNA-intrinsieke fluorescentie met sSMLM is ongeveer 5 vanwege het lage aantal fotonen en beperkingen door cameradetectieruis.

figure-results-1
Figuur 1: Werkstroom met geschatte duur. (A) Monstervoorbereiding omvat het ontdooien van de voorraad, het voorbereiden van de DNA-gel en het toevoegen van beeldvormingsbuffer. De totale tijd varieert van 1 tot 3 uur, afhankelijk van het monster en de omgeving. (B) Elke acquisitie vereist een kalibratieproces met een speciaal ontworpen nanogatarraymonster. De totale kalibratietijd zal ongeveer 20 minuten zijn, en de tijd voor data-acquisitie voor één beeldstack ongeveer 10 minuten, inclusief sample-zoeken (10.000 frames en 50 ms belichtingstijd). (C) De analysepijplijn omvat FIJI-preprocessing en spectrale analyse in Python. De preprocessing in FIJI duurt ongeveer 10 minuten, terwijl de spectrale analyse snel is met de vastgestelde codes. De gepresenteerde spectra werden verzameld van 16-basis Guanine. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

figure-results-2
Figuur 2: Optisch schema. De vier laserlijnen (405 nm, 488 nm, 532 nm, 647 nm) worden via laseruitlijning naar de omgekeerde microscoop geleid, waardoor het systeem stabiel en eenvoudig te bedienen is. De DWP wordt direct voor de sCMOS-camera geplaatst, waardoor spectroscopische detectie van enkele moleculen mogelijk is. Bij het kalibreren voor de DWP wordt er een filterwiel tussen de camera en de DWP geplaatst. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

figure-results-3
Figuur 3: Spectrale kalibratie. De gebruikte kalibratiegolflengten zijn 532 nm, 580 nm, 633 nm, 680 nm en 750 nm. Door sequentieel smalle bandbreedtefilters met deze centrale golflengten na de DWP en vóór de camera te plaatsen, kunnen de overeenkomstige horizontale en verticale verschuivingen van verschillende golflengten worden gemeten, waardoor een kalibratiecurve tussen pixelpositie en golflengte in kaart kan worden gebracht. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

figure-results-4
Figuur 4: Spectra van geselecteerde dubbelstrengs en enkelstrengs DNA-moleculen onder respectievelijk 532 nm en 488 nm excitatie. (A - B) De niet-lineaire en lineaire spectra van GC_alter, die verwijzen naar een type dubbelstrengs DNA-molecuul, met beide strengen als 20-base 5'-GCGCCGCGCGCGCGCGCG-3'. Het gemarkeerde groene spectrum toont de gemiddelde curve. (C - D) De niet-lineaire en lineaire spectra van A10C10, wat verwijst naar een type enkelstrengs DNA-molecuul, met een lengte van 40 basen en herhaalde 10 adenine en 10 cytosinen (5' - AAAAAAAAAACCCCCCCCCAAAAAAAAAAACCCCCCCCCCCC-3'). Het gemarkeerde blauwe spectrum toont de gemiddelde curve. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Aanvullende Figuur 1: Controle-experimenten voor intrinsieke DNA-fluorescentie. Klik hier om dit bestand te downloaden.

Discussie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Hier presenteren we voor het eerst een protocol voor het vastleggen van het volledige spectrum van DNA-intrinsieke fluorescentie van zowel enkelstrengs als dubbelstrengs DNA-moleculen, waarbij de workflow van monstervoorbereiding tot dataverzameling en computationele analyse wordt behandeld. Dit protocol maakt labelvrije superresolutiebeeldvorming van DNA-moleculen mogelijk door gebruik te maken van intrinsieke fluorescentie in plaats van exogene probes. In principe zou deze aanpak kunnen worden uitgebreid naar vaste cellen en mogelijk naar levende celbeeldvorming, omdat het chemische etikettering en antistof-gebaseerde amplificatie vermijdt. Chromatine in de kern omvat DNA, RNA en verschillende soorten eiwitten, wat een veel ingewikkelder systeem is dan de DNA-gel. Momenteel zijn stochastische emissies vanuit de kern in vaste/levende cellen een uitdaging vanwege het lage aantal fotonen van DNA-moleculen. Maar voor de geïsoleerde chromosomen, of kern, was het DNA intrinsieke fluorescentiesignaal gerapporteerdop 16,24,27. In zijn huidige vorm is het protocol echter beperkt tot in vitro-omgevingen met gebruik van gesynthetiseerde DNA-monsters. Ter vergelijking: het labelen van nucleair DNA of chromatine met immunokleuring omvat doorgaans langdurige meerstapsprocedures – waaronder afkoelen, blokkeren en primaire en secundaire antilichaamincubaties – die enkele uren kunnen duren (vaak ~5 uur per doel)12,42, wat zowel experimentele complexiteit als mogelijke verstoringen in de native chromatinestructuur introduceert. Door exogene labels te elimineren, verkort intrinsieke fluorescentie-gebaseerde beeldvorming niet alleen de voorbereidingstijd van monsters aanzienlijk, maar voorkomt ook structurele verstoringen en koppelingsfouten die geassocieerd worden met omvangrijke fluorescentieprobes en antilichamen, waardoor een nauwkeurigere nanoschaal lokalisatie van DNA mogelijk wordt.

Ondanks het labelvrije karakter en de conceptuele eenvoud vereist de succesvolle implementatie van dit protocol zorgvuldige aandacht voor verschillende cruciale experimentele details. Zo vermindert bijvoorbeeld tijdens de monstervoorbereiding onvoldoende tijd voor DNA-gelvorming het aantal detecteerbare localisaties van één molecuul vergeleken met volledig gevormde gels. Meestal duurt het ongeveer 1,5 uur voordat de gel gevormd is. Als de oplossing nog niet helemaal gedroogd is, wacht dan nog even. Voor een deklaag van 22 x 22 mm is 5 μL beeldvormingsbuffer voldoende, terwijl een groter volume buffer lekkage kan veroorzaken, wat de olie-onderdompelingsinterface van het objectief kan verstoren en de beeldvormingsprestaties negatief kan beïnvloeden. Als er lekkage optreedt, kan deze voorzichtig worden verwijderd met een laboratoriumdoekje. Verhoog tijdens het focussen geleidelijk het doel vanaf de laagste z-positie. Nadat het doel de immersieolie heeft geactiveerd, gebruik je de fijne aanpassingsmodus om het focale vlak te identificeren met frequente stochastische emissiegebeurtenissen van één molecuul. Als grote gelclusters geaggregeerde signalen produceren met overlappende eerste-orde spectra, kies dan een alternatief beeldgebied.

Ondanks de voordelen heeft dit protocol verschillende belangrijke beperkingen waarmee rekening moet worden gehouden bij het beoordelen van de toepasbaarheid en prestaties ervan. Ten eerste is nauwkeurige spectrale extractie afhankelijk van voldoende ruimtelijke scheiding tussen individuele enkelmolecuulgebeurtenissen; hoge lokalisatiedichtheden, zoals die ontstaan uit grote DNA-gelclusters of dicht opeengepakte macromoleculaire assemblages, kunnen leiden tot overlappende eerste-orde spectrale sporen die betrouwbare spectrumreconstructie bemoeilijken of uitsluiten. Ten tweede is de methode gevoelig voor optische uitlijning en scherpstelstabiliteit, omdat kleine misuitlijningen van het dubbelwigprisma of afwijkingen van het optimale brandpuntsvlak systematische fouten in de golflengtekalibratie kunnen veroorzaken en de signaal-ruisverhouding kunnen verminderen. Ten derde implementeert het protocol momenteel geen spectrale demixing, waardoor het gebruik beperkt wordt in monsters met een hoge moleculaire dichtheid of meerdere spectraal overlappende soorten. Gezamenlijk bepalen deze factoren het praktische werkingsregime van de methode en moeten ze zorgvuldig worden overwogen bij het uitbreiden van het protocol naar complexere of drukkere biologische systemen.

In dit protocol wordt RainbowSTORM alleen gebruikt voor spectrale kalibratie, hoewel de software ook krachtige tools biedt voor 2D/3D-kalibratie, sSMLM-data-analyse en beeldreconstructie. Dergelijke analysetools zijn zeer geschikt om ruimtelijke lokalisatie-informatie te koppelen aan spectrale uitlezingen in spectroscopische superresolutiebeeldvorming en kunnen verder worden ingezet in toekomstige uitbreidingen van dit protocol. Ten slotte is dit protocol mogelijk haalbaar voor andere typen biologische macromoleculen 43,44,45, zoals RNA, tubuline, enzovoort. Het gedetecteerde spectrum kan verder worden ingevoerd in computationele modellen, zoals deep learning modellen46, om classificatie uit te voeren, waarmee sequentie of moleculaire structuur uit intrinsieke spectra onder verschillende verlichting en fotofysische eigenschappen wordt voorspeld. Deze studie effent ook de weg voor labelvrije, moleculair-specifieke chromatinebeeldvorming, die externe etikettering of denaturatie van natuurlijke structuren vermijdt.

Openbaarmakingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De auteurs verklaren dat zij geen concurrerende belangen hebben.

Dankbetuigingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dit onderzoek werd ondersteund door subsidies R02CA225002, U54CA261694, R01CA289294 en U54CA268084 van de National Institutes of Health en subsidie CBET-2430743 van de National Science Foundation. Wij danken het laboratorium van prof. Hao F. Zhang aan de Northwestern University voor hun dual-wedge prisma-apparaat als een belangrijk onderdeel van het spectroscopische SMLM-systeem.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
488 nm emissiefilter voor beeldvormingChroma Technology Corp.ET525/50M
532 nm bandpass filter voor kalibratieThorlabsFL532-3
532 nm emissiefilter voor beeldvormingChroma Technology Corp.ET620/60M
580 nm bandpass filter voor kalibratieThorlabsFB580-10
633 nm bandpass filter voor kalibratieThorlabsFL632.8-3
680 nm bandpass filter voor kalibratieThorlabsFB680-10
750 nm bandpass filter voor kalibratieThorlabsFB750-10
Beta-mercaptoethanol SigmaM6250
BME beeldvormingsbufferNANA7 μL GLOX, 7 μL Beta-mercaptoethanol en 690 μL glucose buffer
Catalase uit runderleverSigmaC100
DABCO (1,4-di-azobicyclo-(2.2.2.)-octaan)SigmaD27802
DABCO beeldvormingsbufferNANA65 mM DABCO+30 mM Natriumsulfiet + 30 mM DTT 1 M  in DNAse, RNAse vrij gedeioniseerd water. Het natriumsulfiet moet worden opgelost in PBS 10× tot 1 M voordat de beeldvormingsbuffer wordt gemaakt.
DNA deplex voor spectroscopische SMLMIDTNA20-basenpaar dubbelstrengs GC_alter, GC_conti, AT_alter en AT_conti.
Bijv. GC_alter heeft beide strengen als 5’ - GCGCGCGCGCGCGCGCGCGC - 3’; GC_conti heeft de ene streng als 5’ - GGGGGGGGGGGGGGGGGGGG - 3’ en de andere als 5’ - CCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCC - 3’
Alle monsters zijn in HPLC-standaard.
DNA oligonucleotide/dubbelstrengs DNAIDTNA
DNA oligo's voor spectroscopische SMLMIDTNA20-base A, G, C, T; 40-base enkelstrengs AC-keten (A1C1, A5C5, A10C10, A20C20);  enkele streng 5-, 8-, 12-, 16- base Guanine.
Bijv. A10C10 is
5'- AAAAAAAAAACCCCC
CCCCCAAAAAAAA
AACCCCCCCCCC - 3'
Alle monsters zijn in HPLC-standaard.
DNase/RNase-vrij gedestilleerd waterInvitrogen10977015
DTT (DL-Dithiothreitol)Sigma43816
GLOXNANA14 mg glucoseoxidase, 50 μL catalase (17 mg/ml) + 200 μL buffer A, dat is 10 mM Tris (pH 8.0) en 50 mM NaCl. 
glucose bufferNANA50 mM Tris (pH 8.0), 50 mM NaCl en 10% glucose. 
glucose oxidasesigmaG7141
Glucose, poederThermo Fisher15023021
PBS (10X)Thermo FisherJ62036.K3
PBS (1X)Gibco10010023
NatriumchlorideThermo Fisher424290010
Natriumsulfiet SigmaS0505
Tris (1M) pH 8.0InvitrogenAM9856

Referenties

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Ellis, R. J., Minton, A. P. Join the crowd. Nature. 425 (6953), 27-28 (2003).
  2. Hell, S. W., Wichmann, J. Breaking the diffraction resolution limit by stimulated emission: stimulated emission-depletion fluorescence microscopy. Opt Lett. 19 (11), 780(1994).
  3. Rust, M. J., Bates, M., Zhuang, X. Sub-diffraction-limit imaging by stochastic optical reconstruction microscopy (STORM). Nat Methods. 3 (10), 793-796 (2006).
  4. Betzig, E., et al. Imaging intracellular fluorescent proteins at nanometer resolution. Science. 313 (5793), 1642-1645 (2006).
  5. Gustafsson, M. G. L. Nonlinear structured-illumination microscopy: wide-field fluorescence imaging with theoretically unlimited resolution. Proc Natl Acad Sci U S A. 102 (37), 13081-13086 (2005).
  6. Hell, S. W., Kroug, M. Ground-state-depletion fluorescence microscopy: a concept for breaking the diffraction resolution limit. Appl Phys B. 60 (5), 495-497 (1995).
  7. Fölling, J., et al. Fluorescence nanoscopy by ground-state depletion and single-molecule return. Nat Methods. 5 (11), 943-945 (2008).
  8. Ricci, M., Manzo, C., García-Parajo, M. F., Lakadamyali, M., Cosma, M. Chromatin fibers are formed by heterogeneous groups of nucleosomes in vivo. Cell. 160 (6), 1145-1158 (2015).
  9. Bintu, B., et al. Super-resolution chromatin tracing reveals domains and cooperative interactions in single cells. Science. 362 (6413), eaau1783(2018).
  10. Matsuda, A., et al. Condensed mitotic chromosome structure at nanometer resolution using PALM and EGFP-histones. PLoS One. 5 (9), e12768(2010).
  11. Bohn, M., et al. Localization microscopy reveals expression-dependent parameters of chromatin nanostructure. Biophys J. 99 (5), 1358-1367 (2010).
  12. Acosta, N., et al. Three-color single-molecule localization microscopy in chromatin. Light Sci Appl. 14, 7(2025).
  13. Almassalha, L. M., et al. Label-free imaging of the native, living cellular nanoarchitecture using partial-wave spectroscopic microscopy. Proc Natl Acad Sci U S A. 113 (42), E6372-E6381 (2016).
  14. Beerman, T. A., et al. Effects of analogs of the DNA minor groove binder Hoechst 33258 on topoisomerase II and I mediated activities. Biochim Biophys Acta. 1131 (1), 53-61 (1992).
  15. Cadet, J., Anselmino, C., Douki, T., Voituriez, L. New trends in photobiology. J Photochem Photobiol B. 15 (4), 277-298 (1992).
  16. Dong, B., et al. Superresolution intrinsic fluorescence imaging of chromatin utilizing native, unmodified nucleic acids for contrast. Proc Natl Acad Sci U S A. 113 (35), 9716-9721 (2016).
  17. Vayá, I., Gustavsson, T., Miannay, F., Douki, T., Markovitsi, D. Fluorescence of natural DNA: from the femtosecond to the nanosecond time scales. J Am Chem Soc. 132 (34), 11834-11835 (2010).
  18. Anders, A. DNA fluorescence at room temperature excited by means of a dye laser. Chem Phys Lett. 81 (2), 270-272 (1981).
  19. Plessow, R., Brockhinke, A., Eimer, W., Kohse-Höinghaus, K. Intrinsic time- and wavelength-resolved fluorescence of oligonucleotides: a systematic investigation using a novel picosecond laser approach. J Phys Chem B. 104 (15), 3695-3704 (2000).
  20. Takaya, T., et al. UV excitation of single DNA and RNA strands produces high yields of exciplex states between two stacked bases. Proc Natl Acad Sci U S A. 105 (30), 10285-10290 (2008).
  21. Bancaud, A., et al. A fractal model for nuclear organization: current evidence and biological implications. Nucleic Acids Res. 40 (18), 8783-8792 (2012).
  22. Daban, J. R. High concentration of DNA in condensed chromatin. Biochem Cell Biol. 81 (3), 91-99 (2003).
  23. Bohrmann, B., et al. Concentration evaluation of chromatin in unstained resin-embedded sections by means of low-dose ratio-contrast imaging in STEM. Ultramicroscopy. 49 (1-4), 235-251 (1993).
  24. Dong, B., et al. Stochastic fluorescence switching of nucleic acids under visible light illumination. Opt Express. 25 (7), 7929-7944 (2017).
  25. Gong, R., et al. DNA spectroscopic intrinsic-contrast photon-localization optical nanoscopy. Proc SPIE. 13326, 133260F(2025).
  26. Wang, G., et al. Label-free DNA spectroscopic photon-localization nanoscopy. Optica Biophotonic Congress. , (2025).
  27. Eshein, A., et al. Sub-10-nm imaging of nucleic acids using spectroscopic intrinsic-contrast photon-localization optical nanoscopy (SICLON). Opt Lett. 43 (23), 5817-5820 (2018).
  28. Song, K. H., et al. Monolithic dual-wedge prism-based spectroscopic single-molecule localization microscopy. Nanophotonics. 11 (8), 1527-1535 (2022).
  29. Song, K. H., Sun, C., Zhang, H. F. Design strategy for a dual-wedge prism imaging spectrometer in spectroscopic nanoscopy. Rev Sci Instrum. 94 (2), 023702(2023).
  30. Yeo, W. H., Sun, C., Zhang, H. F. Physically informed Monte Carlo simulation of dual-wedge prism-based spectroscopic single-molecule localization microscopy. J Biomed Opt. 29 (S1), S11501(2023).
  31. Davis, J. L., et al. RainbowSTORM: an open-source ImageJ plug-in for spectroscopic single-molecule localization microscopy (sSMLM) data analysis and image reconstruction. Bioinformatics. 36 (19), 4972-4974 (2020).
  32. Davis, J. L., et al. RainbowSTORM v2 (MATLAB app). , https://github.com/FOIL-NU/sSMLM-protocol (2020).
  33. Brenner, B., et al. Implementation and calibration of spectroscopic single-molecule localization microscopy. BMC Methods. 2 (1), 2(2025).
  34. sSMLM for DNA intrinsic fluorescence (Python scripts). , Backman Lab. https://github.com/BackmanLab/sSMLM-for-DNA-intrinsic-fluorescence (2025).
  35. N-STORM protocol. , Molecular Vista. Available from: https://www.mvi-inc.com/wp-content/uploads/N-STORM+Protocol.pdf (2014).
  36. Abdelsayed, V., Boukhatem, H., Olivier, N. An optimized buffer for repeatable multicolor STORM. ACS Photonics. 9 (12), 3926-3934 (2022).
  37. Zumbusch, A., Holtom, G. R., Xie, X. S. Three-dimensional vibrational imaging by coherent anti-Stokes Raman scattering. Phys Rev Lett. 82 (20), 4142(1999).
  38. Benninger, R. K. P., Piston, D. W. Two‐photon excitation microscopy for the study of living cells and tissues. Curr Protoc Cell Biol. 59 (1), 4-11 (2013).
  39. Zhang, C., Zhang, D., Cheng, J. X. Coherent Raman scattering microscopy in biology and medicine. Ann Rev Biomed Eng. 17 (1), 415-445 (2015).
  40. Song, J., et al. SNR enhanced high-speed two-photon microscopy using a pulse picker and time gating detection. Sci Rep. 13 (1), 14244(2023).
  41. Luu, P., Fraser, S. E., Schneider, F. More than double the fun with two-photon excitation microscopy. Comm Biol. 7 (1), 364(2024).
  42. Van de Linde, S., et al. Direct stochastic optical reconstruction microscopy with standard fluorescent probes. Nat Protoc. 6 (7), 991-1009 (2011).
  43. Wang, D., et al. Research progress on the luminescence of biomacromolecules. J Mater Sci Technol. 76, 60-75 (2021).
  44. Varejão, N., Reverter, D. Using intrinsic fluorescence to measure protein stability upon thermal and chemical denaturation. Methods Mol Biol. 2581, 229-241 (2023).
  45. Sindrewicz, P., et al. Intrinsic tryptophan fluorescence spectroscopy reliably determines galectin-ligand interactions. Sci Rep. 9 (1), 11851(2019).
  46. Ho, C. S., et al. Rapid identification of pathogenic bacteria using Raman spectroscopy and deep learning. Nat Commun. 10 (1), 4927(2019).

Herprints en machtigingen

Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

Toestemming aanvragen

Trefwoorden

Beeldvorming van DNA moleculenintrinsieke fluorescentielabelvrije genomische beeldvorminglokalisatie van enkelvoudige moleculenDNA gelbereidingspectrale analysestochastisch knipperenThunderSTORM pluginRainbowSTORM software

Gerelateerde artikelen