Methodenartikel

Toegankelijke siliconenchip-tot-membraan-afdichtingsprocedure voor flexibele, betrouwbare hechting

831 weergaven

⸱

DOI:

10.3791/69980

⸱

20 maart 2026

 ,  ,  , 
1Department of Pathology and Medical Biology, EXPIRE Lab, University of Groningen, University Medical Center Groningen, 2GRIAC Research Institute, University of Groningen, University Medical Center Groningen, 3Department of Biomaterials and Biomedical Technology, University Medical Center Groningen, University of Groningen, 4Tissue Engineering and Cells Therapy Group (GITTC), School of Medicine, University of Antioquia, Alma Mater Hospital of Antioquia, 5Department of Pulmonary Diseases, University Medical Center Groningen, University of Groningen

In dit artikel

Samenvatting

Een nieuw afdichtingsprotocol om waterdichte, siliconengebaseerde afdichtingen te produceren voor membranen van polydimethylsiloxaan (PDMS) chipapparaten. Bedoeld voor laboratoria die chipmodellen opzetten en kleinschalige chipplatformontwikkeling. We demonstreren het protocol met behulp van plastic en native weefselmembranen. Deze procedure vereist alleen PDMS, tolueen, schimmel, membraan en een vacuümkamer.

Samenvatting

Orgaan-op-Chip-platforms zijn een snelgroeiend aspect van biomedisch onderzoek. De uitbreiding van dit vakgebied heeft geleid tot een reeks verschillende materialen en methodologieën voor hun constructie en toepassing. Hoewel het aantal verschillende apparaten – commercieel aangeboden of ontwikkeld in de academische wereld – blijft groeien, blijft er meestal een grote stap te zetten voor nieuwe onderzoekers die het Organ-on-Chip-veld betreden. Een van de centrale kwesties in zowel nieuwe als bestaande chiptechnologieën blijft het creëren van een veilige en lekvrije afdichting van chipapparaten. In dit artikel bieden we een nieuw pad naar chipontwikkeling door een chipsealingworkflow te presenteren die betrouwbare waterdichte verbindingen produceert tussen siliconenchips en drie kweekmembranen van verschillende materialen. De gepresenteerde procedure is beschikbaar voor de ontwikkeling van nieuwe chips met beperkte inputmaterialen en biedt een lucht-vloeistofinterface (ALI) Organ-on-Chip. Deze chips zijn bedoeld voor celkweek die via een poreus membraan worden gevoed en apicaal blootgesteld aan lucht, zoals in een darm-, huid-, of-zoals in het hier gepresenteerde geval, Airway-on-Chip. Wij bieden twee verschillende 3D-ontwerpen van chipmallen, waarbij hun binding aan commercieel verkrijgbare plastic membranen en varkens-extracellulaire matrix (ECM) steigers worden getoond. Deze Airway-on-Chip kan intern worden geproduceerd; de verschillende obstakels die je kunt tegenkomen worden hier gepresenteerd, en een voorbeeld van hun eerdere gebruik als Airway-on-Chip. Deze nieuwe afdichtingsprocedure houdt in dat tolueenverdunde polydimethylsiloxaan (PDMS) mortel wordt gevacuümeerd om het tolueen te verwijderen, wat leidt tot een dunne en sterke siliconenlaag die in het poreuze plastic of het native ECM-membraan wordt ingebed. De tweede nieuwigheid van deze procedure is het uitharden van de PDMS-mortel bij kamertemperatuur om verstoring van de membranen door verschillende thermische expansie in de materialen die aan elkaar worden gesloten te voorkomen. Dit leidt tot een breed toepasbare techniek om de geteste materialen te binden, waardoor multi-kamerige PDMS-chips met geïnternaliseerde kweekmembranen worden geproduceerd.

Inleiding

Orgaan-op-chip-apparaten worden een hoeksteen van biomedisch onderzoek, met een grote verscheidenheid aan commerciële en open-access modellen die in laboratoria over dehele wereld worden ontwikkeld. Nu deze modellen een belangrijk onderdeel van onderzoek worden en het traditionele statische plastic en diermodellenblijven vervangen, wordt het steeds belangrijker dat deze modellen gemakkelijk toegankelijk en beschikbaar zijn voor onderzoekers van verschillende achtergronden wereldwijd. Centraal hierin staat de toegankelijkheid van het realiseren van op maat gemaakte, kleine batchontwikkeling, onafhankelijk van input en productiekosten4, vooral in niet-commerciële of academische modellen1.

Een van de grootste uitdagingen in On-Chip-technologieën is het garanderen van een veilige afdichting van chips zonder lekkages tijdens de stroom. Een recente review van lektesten in chipapparaten identificeerde lekkage tussen de kamers of naar de omgeving als een topmodus voor model- en experimentele falen, zowel in de industrie als in de academische wereld 5,6. Er zijn verschillende redenen voor het niet succesvol afdichten van een afdichting: de kleine afmetingen van de apparaten, de stroming en druk die wordt toegepast, en vooral het feit dat deze apparaten bestaan uit verschillende materialen die in lagen samengevoegd zijn en met verschillende processen zijn verbonden6. Het scala aan verschillende materialen die als kweekmembranen in chipplatforms worden gebruikt, is net zo breed als het scala aan toepassingen, waaronder polyethyleentereftalaat (PET), polycarbonaat (PC), PDMS en ECM-membranen1. Hierdoor zijn er verschillende procedures en behandelingen om deze verschillende materialen in de uiteindelijke apparaten te verbinden. Deze procedures omvatten compressie met lijm/PDMS, plasma-gemedieerde silaanchemie, chemische functionalisatie van structuren, elektrospinning en verdampte oplosmiddelbindingen, afhankelijk van de materialen die in model7 worden gebruikt. Het feit dat deze processen verschillende vaardigheden en laboratoriumomgevingen vereisen, legt enkele beperkingen op aan de academische toegankelijkheid van On-Chip onderzoek. Er is vastgesteld dat hoewel de kosten en beperkingen van commerciële systemen de toegang tot academische systemen beperken, de lange, meerfasige processen van het bouwen van chips en de benodigde apparatuur hun onafhankelijke academische ontwikkelingbeperken 1,8,9. Aan de voorhoede van dit onderzoek ligt een van de huidige kwesties in de standaardisatie en validatie van modellen voor hun reproduceerbaarheid10,11. Maar er blijft een gat in het bereiken van dit punt voor veel laboratoria die proberen te beginnen met chipontwikkeling om specifieke onderzoeksvragen te beantwoorden, dierwerk te vervangen en te werken in meer biologisch relevante modellen12.

In dit artikel presenteren we een workflow voor het afdichten van chips die alleen de vaardigheden en apparatuur vereist die beschikbaar zijn voor de meeste onderzoeksomgevingen. Deze procedure produceert waterdichte PDMS-chip-membraaninterfaces voor drie verschillende membraanmaterialen. Het proces vereist slechts beperkte actieve werktijd, kan worden toegepast in niet-chiplabomgevingen en kan worden opgeschaald van kleine tot middelgrote batch chipproductie.

De gepresenteerde afdichtingsprocedure kan worden uitgevoerd met poreuze plastic of ECM-membranen; De voorbeeldchips die worden meegeleverd, zijn met deze procedure gebouwd voor toepassing als een airway-on-chip apparaat met luchtblootstelling. Deze procedure kan worden gebruikt voor andere vergelijkbare apparaten, mits de membranen poriën bevatten, die essentieel zijn voor de procedure. De belangrijkste toepassing van de geleverde chips is voor ALI-kweek en luchtwegepitelcellen, maar kan ook worden gebruikt voor andere toepassingen en co-kweekmodellen met mesenchymale cellen of darmcellen, bijvoorbeeld 8,13. De eerste chip die wordt geleverd is een standaard airway-on-chip met een grootschalig kweekgebied (92 mm2) en twee kweekkamers, inclusief een apicale kamer voor luchtblootstelling die door een poreus membraan wordt gescheiden van de basale kamer die medium bevat en eventueel een ander ondergedompeld gekweekt celtype bevat (bijv. fibroblasten, endotheelcellen). Voor ALI-toepassingen is het essentieel dat de apikal gezaaide cellen in staat zijn een strakke barrière te behouden om lekkage van media in het bovenste kanaal te voorkomen. De tweede chip heeft hetzelfde ontwerp als de eerste, met twee extra kamers aan weerszijden van het membraan, hier met behulp van varkens-ECM, om het uitrekken van het kweekmembraan te vergemakkelijken door negatieve druk toe te passen, waarbij de uitrekking van een natuurlijke luchtweg wordt nagebootst.

Ons afdichtingsproces brengt verschillende elementen uit de ontwikkeling van PDMS-chips samen met de toevoeging van nieuwe voorwaarden, die tweeledig zijn. Ten eerste bevordert de snelle toepassing van vacuüm op de tolueenverdunde PDMS-mortel, wat een chemische aanval van het tolueen op de membranen voorkomt, de siliconenintrusie in de poriën of oppervlaktekenmerken van het membraan bevordert en leidt tot een dun, verplaatsingsbestendig oppervlak. Tolueen veroorzaakt zwelling en vervorming van vaste PDMS-oppervlakken, maar werkt bij hoge concentraties als oplosmiddel, vandaar het gebruik om vloeibare PDMS in deze procedure te verdunnen. Voor kunststoffen zoals de hier gebruikte PC- en PET-membranen veroorzaakt het tolueen vervorming en spanningsscheuren als het niet snel wordt verwijderd. Het is essentieel dat er bij het handmatig aanbrengen van de mortel alleen op de wand van de vooraf gebouwde chip-half wordt toegepast en dat er nooit iets in het kweekgebied komt, omdat dit de poriën van de kweekmembranen blokkeert en gebieden met PDMS ontstaan die verstoring en variatie in de celkweekcapaciteit veroorzaken. Ten tweede voorkomt het uitharden van de PDMS-mortel bij kamertemperatuur (RT) gedurende 72 uur dat het membraan zowel van de chip-half als van de mortel wordt verplaatst, wat kan gebeuren doordat de materialen na thermische uitzetting in verschillende mate krimpen.

Wij bieden twee chipmallontwerpen die gemaakt kunnen worden met een 3D-printer of microfrees (zoals beschreven in het Aanvullende Bestand 1, Aanvullend Bestand 2), evenals de methode om een dunne mortel te maken van PDMS en tolueen14. Met deze methode kan commerciële plastic membranen (PET, PC) binnen een apparaat worden afgesloten. Daarnaast testten we het toepassingsbereik van dit proces door dezelfde chip te creëren met een varkensachtige native ECM-membraan om een biologische chip te produceren met de mogelijkheid tot cyclische uitrekking. Omdat Organ-on-Chips bedoeld zijn om de fysiologische eigenschappen van de in vivo omgeving na te bootsen, zijn Airway-on-Chips die in staat zijn de mechanische krachten te produceren die het lichaam tijdens het ademen ervaren, zoals de schuifspanningen van stromende lucht en het mechanische landschap van de samentrekkende luchtwegen, biologisch zeer relevant16. Het gebruikte membraan bestaat uit het basale membraan, lamina propria, evenals collageen, laminine en andere omliggende matrixeiwitten. Voor zover wij weten is dit de eerste native basmentmembraan-gebaseerde chip en de eerste met de mogelijkheid tot rek, waardoor het nabootsen van de mechanische belasting van bijvoorbeeld ademhaling op een niet-siliconen ECM-membraan15 mogelijk wordt. Deze nieuwe toepassing benadrukt de functie van onze afdichtingsprocedure met plastic en ECM. Tot slot presenteren we de toepassing van deze chip- en membraanafdichtingsprocedure als een Airway-on-Chip die kan worden gebruikt voor ALI-celkweek8.

Protocol

Deze studie was vrijgesteld van goedkeuring door de ethische commissie onder de Experimenten op Dieren Act, omdat de materialen post-mortem werden verkregen en er geen dieren werden geofferd voor wetenschappelijke doeleinden (Wet op de dierproeven). Het isolatieprotocol van primaire menselijke luchtwegepitelcellen was volgens de onderzoekscode van het Universitair Medisch Centrum Groningen (https://umcgresearch.org/w/research-code-umcg geraadpleegd op 14 januari 2025) en de nationale en ethische professionele richtlijnen voor het gebruik van menselijk lichaamsmateriaal (https://www.coreon.org/wp-content/uploads/2020/04/coreon-code-of-conduct-english.pdf geraadpleegd op 14 januari 2025). Deze studie was vrijgesteld van de eis voor goedkeuring van de ethische commissie, omdat het tracheobronchiale weefsel overbleef van transplantaties en volledig geanonimeerd was volgens het Burgerlijk Wetboek en de Wet op de orgaandonatie (donorwet).

1. Chip-half en membraanvoorbereiding

  1. Chipproductie
    1. Download . STL-ontwerpbestanden voor de boven- en onderhelft van de chip uit Supplementair Dossier 1 en Aanvullend Bestand 2 van dit artikel. De bovenste mal produceert een 5 mm diepe chip-half, de onderste mal een 3 mm diepe chip-half; Beide chiphalves hebben 1 mm diepe kweekkamers. Of maak een chipontwerp met behulp van geschikte CAD-software.
    2. Bereid ofwel een slice-bestand voor voor 3D-printen of een freespad voor microfrees van de chipmallen. Micro-gefreesde mallen zullen klaar zijn voor gebruik; Harsbedrukte mallen vereisen twee 24 uur durende 99,9% ethanolwasbeurten voordat UV-kruisverbinding nodig is om ze goed voor te bereiden op gebruik als PDMS-mal.
  2. Productie van PDMS-chiphalve (Figuur 1)
    1. Meng de vloeibare PDMS-basis grondig met uithardingsmiddel in een verhouding van 10:1 en ontgassen in een vacuümkamer totdat alle luchtbellen zijn verwijderd.
    2. Vul de mallen met een brede spuit en ontgass ~10 minuten in een vacuümkamer totdat alle belletjes verwijderd zijn. Plaats de mallen in een droge oven tot ze 2 uur gehard zijn op 65 °C.
    3. Verwijder massieve spanhalven uit mallen met een scalpel en knip de flits van de randen. Voeg vier inlaten toe aan de bovenste helft aan elk uiteinde van de kamer en de twee aangrenzende ringen die met een biopsiepunch de locatie van de inlaten van de onderste kamer aangeven.
      OPMERKING: Voor de gepresenteerde resultaten werd een 2 mm biopsiepunch gebruikt en werd 2 mm siliconen buis ingebracht voor medium en luchtstroom tijdens de kweek. Inlaten van 1 mm en 2 mm vergemakkelijken celzaaiing met een pipet, overeenkomend met de grootte van respectievelijk 200 en 1000 μm uiteinden. Andere ponsmaten kunnen worden gebruikt voor verschillende buis- of pompsystemen.
  3. Membraanvoorbereiding (Figuur 2)
    1. Download . STL-ontwerpbestanden voor de membraanstencil uit Supplementary File 3 in dit artikel. Bereid de sjabloon voor met 3D-printen of een vergelijkbare fabricagemethode om een consistente membraanvorm te garanderen.
    2. Plaats de sjabloon over het PET- of PC-membraan, houd het stevig vast terwijl het membraan met een scalpel in vorm wordt gesneden.
      OPMERKING: Op dit punt kunnen membranen worden bedekt met matrixeiwitten voor celkweek in een petrischaal zonder de membraanbinding te verstoren. Dit zorgt ervoor dat alleen het membraan gefunctionaliseerd is voor celgroei, waardoor de PDMS-wanden celvrij blijven zoalseerder beschreven.

2. Membraanbinding

  1. PDMS Mortiervoorbereiding
    1. Meng vloeibare PDMS (stap 1.2.1) met tolueen in een verhouding van 7:5 en meng grondig door met een brede spuit op en neer te spuiten zoals eerder beschreven14. Er zijn slechts 8 druppels per chip nodig; 1,4 mL PDMS met 1 mL tolueen wordt aanbevolen per batch mortel en genoeg voor 8 chips van deze schaal. Consistent mengen van mortel is belangrijk voor betrouwbare membraanbinding.
      VOORZICHTIG: Tolueen is vluchtig en zeer brandbaar. Blootstelling kan schade veroorzaken aan het zenuw- en ademhalingssysteem. Gebruik uitsluitend in een dampkap, weg van elke ontstekingsbron, en beheer morsen met absorberend materiaal en ventilatie. Draag tijdens het hanteren beschermende bril om te beschermen tegen spetteren en ondoordringbare (nitril) handschoenen. Laat alle laboratoriummaterialen (pipetten, containers, enz.) 24 uur in de dampafzuigkap staan, waarna tolueen is verdampt en alle materialen via gespecialiseerde afvaldiensten in goedgekeurde, gelabelde containers kunnen worden gedumpt. Gooi nooit tolueen weg in een gootsteen. Raadpleeg het Safety Data Sheet (SDS) voor meer informatie.
      OPMERKING: Bereid de mortel voor op het gebruikspunt om voortijdige verdamping van tolueen en plasticbesmetting te voorkomen, in een niet-glazen container, bij voorkeur wegwerp, en gooi direct na gebruik weg. PDMS zal het oppervlak van glas uitharden en gedeeltelijk niet verwijderbaar zijn; Tolueen lost op en beschadigt de meeste kunststoffen die vaak in het laboratorium worden gebruikt.
  2. PET/PC-membraanbevestiging (Figuur 2)
    1. Breng de mortel snel aan op het oppervlak van de PDMS-chip-half waar het membraan met een pipettip wordt geplaatst.
      OPMERKING: Het hele gebied onder het membraan moet nat zijn met mortel. Met de punt moet een stevige greep worden aangebracht om de dunste laag mogelijk te maken. De microscopie geeft aan dat lagen tussen 3 en 5 μm liggen.
    2. Houd het voorbereide membraan (stap 1.3) aan één uiteinde vast met een schoon paar tangen, plaats de punt op de natte mortel op de juiste positie voor de chip, en laat het membraan op zijn plaats vallen.
      OPMERKING: Laat het membraan na dit punt niet verschuiven; natte PDMS die de kamer binnenkomt zal onregelmatige, onbruikbare wanden op het membraan veroorzaken. Als er verschuiving optreedt, zal siliconen het kweekgebied bedekken, wat het celkweekpotentieel aan beide zijden van het membraan verstoort, het membraan afwerpt en de vorige stap herhaalt.
    3. Houd het membraan voorzichtig op zijn plaats met de tang en breng opnieuw PDMS-mortel aan over de bovenkant van het membraan, waarbij je bij elke slag voorzichtig van de kamer wegbeweegt om belletjes te verwijderen en het membraan te bevestigen zonder het uit zijn oorspronkelijke positie te verplaatsen.
      OPMERKING: Wees voorzichtig dat je geen PDMS aanbrengt in het binnenste kweekgebied van het membraan; Dit is essentieel omdat siliconen celadhesie voorkomt en het natuurlijke oppervlak van het kweekmembraan verstoort.
    4. Plaats de spanhelften met membranen direct na het aanbrengen van natte mortel in een vacuümkamer en hard ze uit bij kamertemperatuur onder 25 mBar vacuüm gedurende 72 uur.
      OPMERKING: Chiphelften met eraan bevestigde membranen moeten bij kamertemperatuur worden uitgehard. PET/PC en PDMS ervaren verschillende graden van thermische uitzetting, en warmteuitharding zorgt ervoor dat het siliconen uitzet en vervolgens krimpt tijdens het afkoelen, waardoor een opgezwollen membraan ontstaat (Figuur 3).
  3. Volledige chipconstructie
    1. Membraangebonden chiphelften kunnen nu aan de tweede helft van de chip worden bevestigd. Voor de meest consistente resultaten blootstel beide helftenaan O2-plasmabehandeling (320 mBar, 30 s) en druk ze snel met de hand onder lichte druk tegen elkaar.
      VOORZICHTIG: zuurstofplasmaovens produceren zuurstofverzadigde omgevingen, gevaarlijke oxiden zoals ozon en intense UV-straling. Ovens moeten worden geïnstalleerd in een goed geventileerde ruimte of in een afzuigkap. Het ovenraam zou alle UV-straling moeten blokkeren, maar een bril wordt aangeraden. Brandbare materialen en metalen moeten uit het zuurstofplasmagebied worden gehouden om versnelde verbranding of afgifte van giftige dampen te voorkomen. Het verwijzen naar het zuurstofplasma SDS-document is essentieel voor gebruik met andere materialen dan die in dit protocol genoemd.
      OPMERKING: Als er geen plasmaoven beschikbaar is, kan vergelijkbare binding worden bereikt met een plasmawandje of door PDMS-mortel op de tweede helft aan te brengen en de helften samen te harden bij kamertemperatuur onder lichte compressie gedurende 72 uuren 13 uur. Hoewel minder effectief in vergelijking met eenvolledige O2 Plasma-oven, kunnen deze opties worden gebruikt wanneer ovens niet beschikbaar zijn.

Resultaten

Membraanafdichtingsintegriteitstest
Om de integriteit van de verzegelde chip te testen, wordt de topcultuurkamer gevuld met demi-water met blauwe kleurstof, en de onderkant met puur demi-water. Chips worden 's nachts achtergelaten om mogelijke lekkage van blauwe kleurstof uit de bovenste kamer rond het membraan naar de onderste kamer te beoordelen.

Volledig geconstrueerde siliconenchips die met onze methode zijn voorbereid, kunnen in de lengte tot 35° worden vervormd zonder de integriteit van het membraan te verstoren, nu omhuld en aan de bovenkant vastgebonden met flexibele PDMS-mortel aan beide zijden. Vervorming van PDMS-chips is een normaal onderdeel van het gebruik, bijvoorbeeld wanneer de helften of chips aan een petrischaal blijven plakken.

Chips werden aangesloten op een bidirectioneel spuitpompsysteem om hun prestaties te testen met stroom-geïnduceerde druk. Chips met PET- en PC-membranen kunnen worden gebruikt zonder lekkage tussen kamers of breuk van de chips tot en met 30 kPa (de maximale druk geleverd door de pompen). In eerdere studies worden de chips standaard op 150 μL/u gewerkt, wat 0,7 Pa druk uitoefent op de kamers van elk apparaat8.

Visualisatie van membraanbinding
Om de intrusie van de vloeibare PDMS-mortel in de 0,4 μm-poriën van het membraan onder de microscoop als gevolg van de RT-vacuümverpakking te visualiseren, werd PDMS-mortel geverfd met Nile Red. Nile Red werd gekozen omdat het een hydrofobe kleurstof is en goed mengt met PDMS in vloeibare vorm. De kleuring werd bereid door 1% Nile Red grondig te mengen in vloeibare PDMS om een rode kleur te produceren onder lichtmicroscopie. De RT-uithardingsprocedure werd herhaald zoals hierboven beschreven. Membranen met geverfde mortel werden in paraffine ingebed en met behulp van een microtoom gesneden. Membraanplakken werden op glazen glaasjes gemonteerd en met een lichtmicroscoop afgebeeld (Figuur 4). Om de noodzaak te valideren van zowel het verdunnen van PDMS tot mortel met tolueen als het toepassen van een vacuüm voor het intrusie van PDMS in membraanporiën, is een vergelijking van membranen met en zonder deze methoden te zien in Aanvullende Figuur 3.

Cellevensvatbaarheidstest
In een eerdere studie werd de mogelijke chemische toxiciteit door het gebruik van tolueen bij de constructie van de apparaten getest. De chips werden bereid met en zonder tolueen in een PDMS-mortel, menselijke longadenocarcinoomepitheliale Calu-3-cellen werden over 2 dagen tot confluentie gekweekt en 1 dag gekweekt in de chips zoalseerder beschreven. 8. Celdood werd beoordeeld door Trypan blauwe kleuring, waarbij alle cellen uit het apparaat werden verwijderd en dode cellen (blauw) werden geteld tegen niet-gekleurde levensvatbare cellen. De proliferatie werd beoordeeld door de reagentia in het chipmedium te incuberen voordat een AlamarBlue-assay werd uitgevoerd, waarbij de fluorescerende absorptie werd gemeten via een plaatlezer, wat proliferatie weergeeft (Figuur 5)8.

ECM Basement Membraanbevestiging
Om de algemene toepasbaarheid van deze procedure te tonen bij het produceren van sterke en flexibele binding met een reeks membranen, werd het protocol herhaald met een volledig extracellulair matrix (ECM) membraan (Figuur 6). Basementmembraan met ECM-steigers werd gemaakt van varkensblaasjes zoals eerderbeschreven 17. Kort gezegd werden varkensurineblaasen van vrouwelijke dieren tussen 4 en 8 maanden oud verkregen bij een lokaal slachthuis (Kroon Vlees b.v., Groningen, Nederland) en binnen 3 uur na de verzameling verwerkt. Bindweefsel en vet werden uit de blaas verwijderd, de blaas werd binnenstebuiten omgedraaid en de epitheellaag werd stomp gedissecteerd, terwijl het weefsel in PBS op kamertemperatuur bleef. ECM-steigers werden gedehydrateerd voor de membraanhechtingsprocedure17. Voorbereide steigers werden gesneden en gebonden aan PDMS-chiphelften zoals beschreven in het bovenstaande protocol. Er werd een nieuwe mal gemaakt met extra kamers voor membraanstretch in het apparaat om aan te tonen dat de vacuümgepompte siliconenbindingen ook horizontale mechanische belasting kunnen weerstaan (Aanvullend Dossier 2).

ECM Membraanintegriteitstest
De test van de integriteit van de membraanafdichting werd als hierboven uitgevoerd. Vervolgens werd de stretchchip bevestigd aan spuitpompen, die een vacuüm trokken aan de zijkamers van het apparaat om 1 mm horizontale rek op het ECM-membraan 's nachts te produceren (Figuur 7).

Differentiatie van epitheelcellen en fibroblastco-kweek in de standaard Airway-on-Chip met PET-membraan
Om de prestaties van de geleverde chip als Airway-on-Chip voor ALI-cel te valideren, werden humane longadenocarcino-epitheliale Calu-3-cellen (ATCC, Manassas, VA, VS) gekweekt tot confluence en blootgesteld aan lucht in het apparaat, in een eerdere studie8. Na 10 dagen blootstelling aan apicale lucht kunnen Calu-3 epitheelcellen zich onderscheiden tot slijmproducerende cellen, wat wordt aangetoond door de slijmproductie, gemeten met Alcian blauwe kleuring (Figuur 8)8.

Om onze procedure voor langdurige lekvrije stroming en co-cultuur te valideren, is een voorbeeld te zien uit een eerdere publicatie; Voor de volledige celkweekmethodologie, zie dit artikel8. Menselijke luchtwegepitelcellen werden 21 dagen lang gekweekt in de apicale kweekkamer van de chip onder constante luchtstroom, waarbij primaire luchtwegfibroblasten ondersteboven aan de andere kant van het membraan werden gekweekt. Kortom, primaire luchtwegepitelcellen werden geïsoleerd door proteasebehandeling (0,2 mg/mL in HBSS, 2 uur, 37 °C), celschrapen en cryopreservatie van cellen die werden verwijderd uit overgebleven tracheobronchiale weefsel van 3 gezonde longdonoren, van wie geen verdere informatie beschikbaar was. Menselijke fibroblasten (AF's) werden op dezelfde manier geïsoleerd uit het bronchiale weefsel van getransplanteerd COPD-longweefsel van één enkele donor.

In Figuur 9 is een afbeelding te zien van de chip en hoe de hierboven genoemde cellen zowel door als langs de kamers van het apparaat verschijnen.

Kweek van epitheelcellen in co-cultuur met fibroblasten op het ECM-membraan
Het basaalmembraan bevattende steiger faciliteert epitheliale en mesenchymale celkweek. Geïmmortaliseerde menselijke keratinocytoten (HaCaT-cellen) werden gezaaid met een dichtheid van 60 x 103 cellen/cm² aan de epitheliale (binnenste) zijde van het membraan, en de levensvatbaarheid was 95% na 24 uur vergeleken met 91% in een plastic celkweekfles (Figuur 10A). Vervolgens werden normale MRC-5 fibroblasten van de menselijke long met een dichtheid van 60 x 10cellen /cm² aan de stromale (buitenste) zijde gezaaid en 14 dagen in cocultuur met de HaCat-cellen gekweekt om de langetermijn epitheliaal-mesenchymale levensvatbaarheid voor co-cultuur op het native ECM-membraan te beoordelen (Figuur 10D). De epitheelcellen vormden een samenvloeiende monolaag aan de binnenzijde van het membraan, terwijl fibroblasten minder dicht verspreid waren over het buitenoppervlak van het ECM-membraan maar hun karakteristieke spilachtige morfologie behielden (Figuur 10C). De 3D-reconstructievideo is te zien in Supplementair Bestand 417.

De huidige studie presenteerde een verbeterde membraanafsluitingsprocedure die een sterke PDMS-membraanverbinding produceert, in staat om verstoringen door handmatig hanteren van de chip te weerstaan en langdurige kweek onder stroming mogelijk te maken met drukken tot 0,7 Pa. We toonden aan dat deze membranen gebonden zijn door siliconen dat door hun poriën in de kweekmembranen is binnengedrongen, wat covalente silaanbindingen tussen de twee chiphelften en de vacuümgepompte PDMS-mortel faciliteert. Bovendien veroorzaakt de gepresenteerde procedure geen cytotoxiciteit, mits de mortel correct wordt aangebracht. Bovendien faciliteerden de geproduceerde chips langdurige epitheliale mono- en epitheliaal-mesenchymale co-culturen. Hoewel deze procedure alleen toepasbaar is op poreuze membranen, blijft het een laag-input procedure voor de productie van betrouwbare en celkweek-klare ALI-chips.

figure-results-1
Figuur 1. Graphics van de productie van PDMS-chiphalve en membraanvoorbereiding. Voor de productie van PDMS chip-half (stap 1.2) worden chipmallen gevuld met vloeibare PDMS met een brede nozzlespuit, 4,4 mL in de bovenste mal en 2,4 mL in de onderste mal. PDMS-helften worden 2 uur uitgehard bij 65 °C, waarna aan de uiteinden van de kamer en de punten die in de mal zijn aangegeven, worden 4 inlaten in de bovenste spanhelft geponst. Voor membraanvoorbereiding (stap 1.3) wordt een geprinte membraansjabloon stevig op het membraanoppervlak bevestigd. Met een nieuw blad snijdt men rond de sjabloon en verwijdert men het chipmembraan van het omliggende materiaal. Membranen kunnen worden gecoat voor celkweek of direct worden gebruikt in stap 2. Gemaakt in BioRender. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

figure-results-2
Figuur 2. Membraanbindingsprocedure. PDMS-mortel wordt direct voor gebruik zoals hierboven beschreven gemengd. Mortel wordt op de vier hoeken rond de kweekkamer gedruppeld en zachtjes verspreid rond de membraanbindplek met het schuine uiteinde van een pipet. Een uiteinde van het membraan wordt op de mortel geplaatst en dan, eenmaal uitgelijnd met de kweekkamer, voorzichtig op zijn plaats laten vallen. Mortel wordt druppelgewijs opnieuw aangebracht en met grote zorg over de randen van het membraan geschilderd, waarbij er geen siliconen in aanraking komen met het membraanoppervlak in het kweekgebied. Chip-half-gebonden membranen worden onmiddellijk in een vacuümkamer geplaatst om microbellen te verwijderen, te zorgen dat siliconen invasie in het oppervlak en de poriën komen, en tolueen te verwijderen om chemische aanval op het membraan te minimaliseren. Gemaakt in BioRender. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

figure-results-3
Figuur 3. Voorbeelden van membraanplaatsing. (A) Succesvolle plaatsing van het membraan, uitharding bij RT. (B) Membraanbinding uitgehard in een oven (65 °C in plaats van bij RT), het membraan is zichtbaar opgezet in de kamer doordat het silicium na het verwarmen samenkromp. (C) Volledige chips met correcte PET- en PC-membraanplaatsing. (D) Verkeerde plaatsing van het membraan zorgt ervoor dat het volume van elke zijde van de chip verandert met de membraanbeweging, wat variabele stroming veroorzaakt en spanning uitoefent op de cellen binnen de chip evenals op de pompen die aan de chip zijn aangesloten. Gemaakt in BioRender. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

figure-results-4
Figuur 4. Lichtmicroscoopbeelden van gesneden en gemonteerde PET- en PC-membranen. Siliconeninvasie in membraanporiën als gevolg van onze vacuüm RT-uithardingsprocedure. (A) Beelden van hetzelfde membraan zonder PDMS aangebracht, heldere poriën zijn zichtbaar, evenals een schoon oppervlak in het gepolariseerde beeld. (B) PDMS-mortel is bevlekt met Nile Red, en siliconen zijn in magenta zichtbaar die succesvol de poriën zijn binnengedrongen en het oppervlak dun hebben bedekt onder vacuüm. Gemarkeerd in witte/magenta vormen. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

figure-results-5
Figuur 5. De cellevensvatbaarheid in de chipapparaten werd niet veranderd door constructie, met of zonder tolueen als verdunningsmiddel in de PDMS-mortel. Calu-3 cellen werden gezaaid met 6,5 × 104 cellen per chip en werden, na het bereiken van confluentie, 's nachts geïncubeerd voordat een AlamarBlue-assay op de supernatant werd uitgevoerd en TrypanBlue op de cellen. Verschillen tussen groepen (n=4) bereid met en zonder tolueen werden getest met de ongepaarde Student's t-test, p > 0,05 = ns (niet significant)8. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

figure-results-6
Figuur 6. Basement membraanchips. (A) De integriteit van het membraan is uitgevallen omdat de PDMS/tolueenmortel niet snel genoeg is afgezuigd; Dit heeft de matrixeiwitten beschadigd en de chipsealing verstoord. (B) Membraan- en chipsealing zijn geslaagd, maar het membraan is in een losse staat verzegeld. (C) Bij succesvolle membraan- en chipsealing is de chip functioneel voor doorstroming en rek. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

figure-results-7
Figuur 7. Twee beelden van de ECM-chip die wordt gestretcht. (A) Chip in rust. (B) Chip onder 1,2 mm horizontale rek. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

figure-results-8
Figuur 8. Alcian Blue (kernen in magenta, slijm in blauw) kleuring van menselijke long-Calu-3 epitheelcellen die in de chips zijn gegroeid na luchtblootstelling in het apparaat. Calu-3-cellen werden tot confluentie gekweekt en 10 dagen gekweekt onder een continue debiet van 150 μL/u in het basale compartiment, en werden vanaf de apicale zijde zowel medium als lucht blootgesteld. De stroming werd geproduceerd met een peristaltische pomp in een incubator bij 37 °C en 5%CO-2. Aan het einde van de kweek werden de membranen verwijderd en gekleurd. Transversale aanzicht van Alcian Blue-kleuring van Calu-3-cellen die 10 dagen onder water zijn gekweekt (A) en in de lucht blootgestelde (B)8. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

figure-results-9
Figuur 9. Visualisatie van primaire menselijke epitheelcellen en fibroblasten in uitgebreide co-cultuur binnen het apparaat. Luchtwegfibroblasten werden in het apparaat gezaaid en mochten zich een nacht hechten, waarna het apparaat werd omgekeerd en epitheelcellen aan de andere kant van het membraan werden gezaaid. De cellen werden tot confluentie gekweekt, aan de lucht blootgesteld en 21 dagen gekweekt onder een continue stroom van 150 μL/u, geproduceerd met een peristaltische pomp in een incubator bij 37 °C en 5%CO2. De membranen werden na de kweek verwijderd, vastgezet, ingebed en op de preparaten gemonteerd voordat ze werden gekleurd. Epitheelcellen werden gekleurd op Mucin 5AC (MUC5AC)18, een bestanddeel van slijm, en forkhead box-eiwit J1 (FOXJ1)19, een transcriptiefactor die betrokken is bij de signalering van de ciliaproductie. Fibroblasten werden gekleurd met tarwekiem-agglutinine (WGA) om de cellulaire fosfolipide-dubbellagen te visualiseren. Cellen werden 15 minuten geïncubeerd met 5 μg/mL in HBSS en drie keer gewassen met PBS vóór beeldvorming. Alle celkernen werden met DAPI gevisualiseerd. (A) Doorsnedeweergave: geproduceerd vanuit een Z-stackprojectie van beelden van (B) en (C). (B) Epitheliale MUC5AC/FOXJ1/DAPI-kleuring op een chipmembraan. (C) Volledige externe structuur van de fibroblastlaag in de basale kamer8. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

figure-results-10
Figuur 10. Cellevensvatbaarheid en cocultuur op de basale membraansteiger. (A) LEVENDE/DODE levensvatbaarheid van HaCaT-cellen die aan de epitheelzijde zijn gezaaid, 3 onafhankelijke monsters zijn getest, 3 willekeurige velden zijn van elk monster verzameld (n = 3). Er werd een gewone eenrichtings-ANOVA-test met Tukey's correctie uitgevoerd. De grafiek toont het gemiddelde met de standaarddeviatie. Cocultuur van (B) HaCaT-cellen aan de epitheelzijde en (C) MRC-5 longfibroblasten aan de stromale zijde van de basale membraanhoudende steiger omgeven door collageenvezels, schubbalken zijn 50 μm. (D) 3D-weergave van de cocultuur vanuit de isometrische boven- en onderaanzichten, schaalbalken zijn 100 μm, geanimeerde visualisatie is te vinden in aanvullende figuur 4. (E) De dikte van het basalmembraansteiger vóór en na decellularisatie werden 14 mucosa's gemeten, en daaruit werden 6 (vertegenwoordigd door driehoeken) genomen voor decellularisatie. Op elk van de steekproeven werden drie willekeurige velden gescand en waren er minstens 10 punten per veld met maat17. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Aanvullende Figuur 1. Chipmallontwerpen voor de boven- en onderhelften van de standaard PET/PC-chip. (A) Afbeelding van de onderste mal van de chip die kan worden geproduceerd uit de . STL in Aanvullend Dossier 1. (B) Afbeelding van de bovenste mal van de chip die kan worden geproduceerd uit de . STL in Aanvullend Dossier 2. (C) Afbeelding van de membraansjabloon voor het snijden van membranen voor de chip die geproduceerd kan worden uit de . STL in Aanvullend Dossier 3. Klik hier om dit bestand te downloaden.

Aanvullende figuur 2. Chipmallontwerpen voor de boven- en onderhelften van de stretch ECM-membraanchip. (A) Afbeelding van de onderste mal van de chip die kan worden geproduceerd uit de . STL in Aanvullend Dossier 4. (B) Afbeelding van de bovenste mal van de chip die kan worden geproduceerd uit de . STL in Aanvullend Dossier 5. Klik hier om dit bestand te downloaden.

Aanvullende figuur 3. Validatie van de afdichtingsprocedure: vergelijking van PDMS-intrusie in poriën zonder tolueen om de viscositeit van de mortel te verlagen en uitgehard bij RT zonder vacuüm. Alle aandoeningen zijn met PET-membranen (0,4 μm poriën), na PDMS (Nile Red 1%) behandeling werden membranen in paraffine ingesloten vóór montage en lichtmicroscoopbeeldvorming. (A) Onverdunde PDMS wordt op een PET-membraan gestofzuigd. Op het oppervlak van het membraan is een dikke laag PDMS te zien, terwijl er geen PDMS is waargenomen die de poriën is binnengekomen (gemarkeerd met witte vakjes). (B) Dunne PDMS-mortel gevacuümeerd op een PET-membraan. Een laag PDMS is zichtbaar op het oppervlak van het membraan, terwijl er geen PDMS is die de poriën is binnengedrongen (gemarkeerd met witte vakjes). (C) Dunne PDMS-mortel op een PET-membraan gestofzuigd. Een dunne laag PDMS is zichtbaar op het oppervlak van het membraan, evenals intrusie in de poriën langs het membraan (gemarkeerd met witte vakjes). Klik hier om dit bestand te downloaden.

Aanvullende figuur 4. 3D visualisatie van Co-cultuur HaCat (epitheel) en MRC-5 (stromale) cellen op de varkens-ECM-steiger. Een geanimeerde 3D-weergave van de cocultuur vanuit isometrische boven- en onderaanzichten, waarvan afbeeldingen te zien zijn in Figuur 10D, schaalbalken zijn 100 μm. Klik hier om dit bestand te downloaden.

Aanvullende Map 1. 3D . STL-vijl van de onderste mal. De mal kan worden gebruikt om de onderste helft van de standaardchip te produceren door middel van 3D-printen of een vergelijkbare fabricagemethode. Klik hier om dit bestand te downloaden.

Aanvullend dossier 2. 3D . STL-vijl van de bovenste mal. De mal kan worden gebruikt om de bovenste helft van de standaardchip te produceren door middel van 3D-printen of een vergelijkbare fabricagemethode. Klik hier om dit bestand te downloaden.

Aanvullend dossier 3. 3D. STL-bestand van de membraanstencil. De sjabloon kan worden gebruikt om membranen van de juiste grootte voor de geleverde chip te produceren en kan worden geproduceerd door 3D-printen of een vergelijkbare fabricagemethode. Klik hier om dit bestand te downloaden.

Aanvullend dossier 4. 3D. STL-vijl van de onderste mal van de rekspaal. De mal kan worden gebruikt om de onderste helft van de rekchip te produceren door middel van 3D-printen of een vergelijkbare fabricagemethode. Klik hier om dit bestand te downloaden.

Aanvullende Dossier 5. 3D . STL-vijl van de bovenste mal van de stretchchip. De mal kan worden gebruikt om de bovenste helft van de rekchip te produceren door middel van 3D-printen of een vergelijkbare fabricagemethode. Klik hier om dit bestand te downloaden.

Discussie

Het chipsealprotocol dat we hier aanbieden, vertegenwoordigt een nieuwe manier om waterdichte PDMS-membraan chipseals te produceren die geschikt zijn voor langdurige kweek tijdens flow, met beperkte apparatuur kunnen worden geproduceerd en geen gespecialiseerde vaardigheden vereisen om het te benaderen. We tonen de procedure voor het produceren van chipwafers met membranen (PET, PC, ECM) die met siliconenmortel aan het oppervlak zijn vastgebonden, en laten zien dat snelle toepassing van vacuüm het intrusie van het PDMS in de poriën en over het oppervlak van plastic membranen vergemakkelijkt. We tonen ook aan dat de resulterende chips goed afgesloten zijn en geschikt zijn voor een breed scala aan kweektoepassingen.

Er zijn verschillende manieren om PDMS-plastische bindingen te benaderen, een veelgebruikte verbindingsstrategie vanwege de gunstige eigenschappen voor celkweek van PDMS, zoals gaspermeabiliteit of patroonbaarheid, en plastische membranen voor hun celkweek-levensvatbaarheid7. Deze omvatten de activatie van het oppervlak metO2-plasma , corona of ozonbehandeling, die de vorming van covalente bindingen tussen siliconen of glas20 bevordert. Anders worden chemische lijmtechnieken gebruikt met organosilanen zoals APTES ((3-aminopropyl)triethoxysilaan) of MPTMS ((3-mercaptopropyl)trimethoxysilaan) om het oppervlak van de twee materialen te functionaliseren door reactieve groepen21 toe te voegen. Als alternatief kunnen PDMS en plastic substraten worden gelijmd met een lijmmethode waarbij epoxy of andere lijmenworden gebruikt 22. We presenteren een hybride tussen oppervlakteactivatie en chemische lijming, met het gebruik van poreuze membranen en vacuüm om een fysieke verbinding door het membraan te creëren die alleen doorO2-plasma oppervlakactivatie kan worden gebonden. Door het PDMS te verdunnen met tolueen, maken we de invasie van het PDMS mogelijk via de poriën van een membraan onder vacuüm, waardoor verschillende membranen covalent kunnen worden gebonden via PDMS-PDMS-bindingen over de chiphelften en het mortel-ingebedde membraan. Door een fysiek siliconennetwerk via deze poriën te produceren, vermijden we de noodzaak van oppervlaktechemische behandeling of warmte en druk die door een warme reliëfmachine worden geleverd, watdeze technieken vaak ondersteunt.

In de huidige studie wordt een grootschalige tweekamerchip (Supplemental File 1) verstrekt die een reeks functies kan hebben. Ten tweede een chip die in staat is tot cyclische horizontale rekking (Supplemental File 2). Deze apparaten functioneren als een Airway-on-Chip, terwijl het model ook als een gut-on-chip kan worden gebruikt, zoals eerder getoond13. Voornamelijk wordt een stapsgewijze handleiding geleverd met verschillende opties voor malproductie, membraanvoorbereiding en chipconstructie die kunnen worden toegepast op aanvullende nieuwe chipplatforms afhankelijk van de gewenste toepassing van de onderzoekers. Het wordt aanbevolen om eenO2 plasmaoven te gebruiken voor de uiteindelijke afdichting. Desalniettemin is ook een handplasma-apparaat of handmatige compressie met PDMS-mortier succesvol gebleken voor deze stap24. In dit protocol voor deze afdichtingsprocedure zijn op elk punt belangrijke obstakels en specificaties benadrukt. Deze omvatten de optie om de membranen vooraf te coaten, het belang van direct gebruik van de PDMS/tolueenmortel, het belang dat de mortel niet het kweekgebied binnenkomt, en hoe essentieel het is dat het membraan niet beweegt nadat verbinding met de mortel is gemaakt.

De reproductie van deze afdichtingsprocedure is herhaaldelijk uitgevoerd door onderzoekers met een geschreven protocol; Alleen de volgende verduidelijkingen waren nodig voor een succesvolle afdichting bij een tweede poging. Bij het optreden van lekkages tijdens stresstesten of uitgebreide celkweek kunnen enkele opties worden onderzocht. Ten eerste moet de onderzoeker ervoor zorgen dat de mortel vers is gemaakt van PDMS-vloeistof die nog niet is begonnen te uitharden en grondig is gemengd met tolueen. De lage viscositeit van de mortel maakt een dunne, gladde laag mogelijk die in de poriën van het membraan kan stromen terwijl de lucht wordt weggezogen. Ten tweede moet men voldoende mortel aanbrengen om de hele onderkant en bovenkant van het membraan te bedekken; terwijl te veel het bij compressie in het kweekgebied kan stromen, laat te weinig openingen achter die een doorgang bieden voor lekkage tussen de kamers. Ten derde moeten membranen vlak zijn voor en tijdens de hechting. Ten slotte moeten de chips, ondanks de handmatige inspanning, grotendeels vuilvrij blijven om een volledige eindbinding te garanderen, dus snel en schoon werken is essentieel.

Hoewel we in dit artikel de hechting van drie verschillende typen poreuze membranen aantoonden, kan de functie van deze methode voor andere membranen niet worden voorspeld. Dit komt doordat verschillende chemische resistenties tegen tolueen, evenals andere dichtheden en groottes van poriën, het resultaat van deze afdichtingsprocedure beïnvloeden. We tonen echter wel de eerste rekbare, volledig ECM-gebaseerde membraanbinding, wat wijst op een hoge veelzijdigheid van het protocol. Toch is de consistentie van de rekprestaties niet betrouwbaar gecontroleerd, omdat verschillende basale membraangebieden, organen en bronnen mechanische verschillen veroorzaken. Daarnaast is de levensvatbaarheid voor celkweek van de ECM-membranen ook gevoelig om in de loop van de tijd te veranderen, zowel in kweek als in opslag19. Hoewel deze procedure werkt voor verschillende membranen en chipopstellingen, vereist het handmatig schilderen van de mortel om effectief te zijn, wat relatief weinig tijd kost maar vaker succesvol zal zijn bij grotere modellen zoals die wij leveren. Ten slotte, hoewel het membraanbindingsproces alleen PDMS, tolueen, een membraan en een vacuümkamer vereist, is de uiteindelijke afdichting van de chip afhankelijk van de toepassing vanO2-plasma , dat niet universeel beschikbaar is.

Ondanks de beperkingen is het aangeboden protocol nieuw en vereist het geen gespecialiseerde vaardigheid om te benaderen. Voor zover wij weten is de productie van siliconennetwerken via de membraanporiën door het vacuümeren van de laag-viscositeit PDMS-mortel de eerste in zijn soort. In tegenstelling tot andere chemische of mechanische functionele bruggen tussen de verschillende materialen onder een functionele chip, is deze oplossing mogelijk in de meeste laboratoriumomgevingen.

Openbaarmakingen

De auteurs hebben geen belangenconflict.

Dankbetuigingen

Dit werk werd ondersteund door het Precision Medicine for More Oxygen (P4O2) consortium en financiering van Stichting Proefdiervrij. Mijn diepste dank gaat naar Isadora Kraguljac voor het idee om Nile Red-kleuring te gebruiken, omdat deze zou mengen met de PDMS voor visualisatie van de siliconennetwerken, en aan Marjan Reinders-Luinge voor haar getalenteerde snijden en monteren van de membranen. De auteurs spreken hun diepste dank uit aan de afdeling Farmaceutische Analyse en Sabeth Verpoorte voor het bieden van toegang tot hun Zuurstofplasma-oven; het proces zou zonder deze niet mogelijk zijn geweest.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
2mL wide-nozzel spuitBD Emereld307727
2mm Biopsie PunchKAI medicalBP-20F
Calu-3 CellijnATCCHTB-55RRID: CVCL_0609
HBSS (Hanks Balanced Salt Solution)Gibco14170112
O2 Plasma OvenHarrick PlasmaPDC-002
PC Track Geëtste CellenkweekmembranenipCELLCULTURE1000M25/620N403/47
PET Track Geëtste CellenkweekmembranenipCELLCULTURE2000M23/610N403/47
Polydimethylsiloxaan/Sylgard 184 Siliconen Elastomeer basis en uitharderDow CorningDOWC25100445
Polymethylmethacrylaat (8mm)ColltecN/A
Standaard Fotopolymeerhars (Grijs)(1kg)ElegooN/A
TolueenMerck 1,08,325
VacuümkamerFisherScientific12080253

Referenties

  1. Ugodnikov, A., Persson, H., Simmons, C. A. Bridging barriers: advances and challenges in modeling biological barriers and measuring barrier integrity in organ-on-chip systems. Lab Chip. 24 (13), 3199-3225 (2024).
  2. Singer, M., Akhtar, A. With What Should We Replace Nonhuman Animals in Biomedical Research Protocols. AMA J Ethics. 26 (9), E701-E708 (2024).
  3. Reardon, S. Beyond lab animals. Science. 389 (6761), 676-679 (2025).
  4. Qiu, J., Li, J., Guo, Z., Zhang, Y., Nie, B., Qi, G., et al. 3D Printing of Individualized Microfluidic Chips with DLP-Based Printer. Materials (Basel). 16 (21), 6984(2023).
  5. Survey on reliability of microfluidics-based devices and components. , The Microfluidics Association. https://microfluidics-association.org (2025).
  6. Silverio, V., Guha, S., Keiser, A., Natu, R., Reyes, D. R., van Heeren, H., et al. Overcoming technological barriers in microfluidics: Leakage testing. Front Bioeng Biotechnol. , (2022).
  7. Nahak, B. K., Mishra, A., Preetam, S., Tiwari, A. Advances in organ-on-a-chip materials and devices. ACS applied bio materials. 5 (8), 3576-3607 (2008).
  8. Rae, B., Vasse, G. F., Mosayebi, J., van den Berge, M., Pouwels, S. D., Heijink, I. H. Development of a Widely Accessible, Advanced Large-Scale Microfluidic Airway-on-Chip. Bioengineering (Basel). 12 (2), 182(2025).
  9. Nizamoglu, M., Joglekar, M. M., Almeida, C. R., Larsson Callerfelt, A. K., Dupin, I., et al. Innovative three-dimensional models for understanding mechanisms underlying lung diseases: powerful tools for translational research. Eur Respir Rev. 32 (169), 230042(2023).
  10. Piergiovanni, M., Leite, S. B., Corvi, R., Whelan, M. Standardisation needs for organ on chip devices. Lab Chip. 21 (15), 2857-2868 (2021).
  11. Silverio, V., Guha, S., Keiser, A., Natu, R., Reyes, D. R., van Heeren, H., et al. Overcoming technological barriers in microfluidics: Leakage testing. Front Bioeng Biotechnol. 10, 958582(2022).
  12. Cameron, T. C., Randhawa, A., Grist, S. M., Bennet, T., Hua, J., Alde, L. G., et al. PDMS Organ-On-Chip Design and Fabrication: Strategies for Improving Fluidic Integration and Chip Robustness of Rapidly Prototyped Microfluidic In Vitro Models. Micromachines (Basel). 13 (10), 1573(2022).
  13. Rae, B., Bood, V., Dijk, H. J., Vasse, G. F., Melgert, B. N., Nagelkerke, A., et al. Interorgan Communication Between Lung and Colorectal Epithelial Cells Studied Using a Novel Multi-Organ-On-Chip System. Compr Physiol. 15 (5), e70051(2025).
  14. van der Helm, M. W., Odijk, M., Frimat, J. P., van der Meer, A. D., Eijkel, J. C. T., van den Berg, A., et al. Fabrication and Validation of an Organ-on-chip System with Integrated Electrodes to Directly Quantify Transendothelial Electrical Resistance. J Vis Exp. (127), e56334(2017).
  15. Salimbeigi, G., Vrana, N. E., Ghaemmaghami, A. M., Huri, P. Y., McGuinness, G. B. Basement membrane properties and their recapitulation in organ-on-chip applications. Mater Today Bio. , (2022).
  16. Nawroth, J. C., et al. Breathing on chip: Dynamic flow and stretch accelerate mucociliary maturation of airway epithelium in vitro. Materials Today Bio. 21, 100713(2023).
  17. Ramirez, J. A., Estrada, S., Harmsen, M. C., Sharma, P. K. Development of an in vitro platform for epithelial-stromal interactions: A basement membrane-containing scaffold from decellularized porcine bladders. Matrix Biol Plus. 26, (2025).
  18. Bonser, L. R., Erle, D. J. Airway mucus and asthma: the role of MUC5AC and MUC5B. Journal of clinical medicine. 6 (12), 112(2017).
  19. Yu, X., et al. Foxj1 transcription factors are master regulators of the motile ciliogenic program. Nature genetics. 40 (12), 1445-1453 (2008).
  20. Lu, C. Surface modification of polyimide fibers for high-performance composite by using oxygen plasma and silane coupling agent treatment. Textile Research Journal. 92 (23-24), 4899-4911 (2022).
  21. Shakeri, A., Khan, S., Didar, T. F. Conventional and emerging strategies for the fabrication and functionalization of PDMS-based microfluidic devices. Lab on a Chip. 21 (16), 3053-3075 (2021).
  22. Borók, A., Kristóf, L., Attila, B. PDMS bonding technologies for microfluidic applications: A review. Biosensors. 11 (8), 292(2021).
  23. Tang, L., Nae, Y. L. A facile route for irreversible bonding of plastic-PDMS hybrid microdevices at room temperature. Lab on a Chip. 10, 1274-1280 (2010).
  24. Young, A. T., et al. Simple design for membrane-free microphysiological systems to model the blood-tissue barriers. Organs-on-a-Chip. 5, 100032(2023).

Herprints en machtigingen

Trefwoorden

Orgaan op een chipPDMS chipafdichtingverbinding van siliconenmembranenlucht vloeistofinterfaceporeus membraanextracellulaire matrixmembraanuitharding bij kamertemperatuurvacu mafdichtingepitheliale celkweekflexibele chipverbinding
Toegankelijke siliconenchip-tot-membraan-afdichtingsprocedure voor flexibele, betrouwbare hechting
Neem contact met ons op
Aanbevelen aan bibliotheek

Privacy

Gebruiksvoorwaarden

Beleid

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Alle rechten voorbehouden.