Methodenartikel

Beoordeling van de metabole activiteit van hele regenererende zebravisventrikels ex vivo met behulp van een extracellulaire fluxassay

538 weergaven

⸱

DOI:

10.3791/70459

⸱

17 april 2026

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Physiology, Anatomy and Genetics, University of Oxford, 2Institute of Developmental and Regenerative Medicine, University of Oxford, 3King Faisal Specialist Hospital & Research Centre, 4Department of Chemistry, University of Oxford

In dit artikel

Samenvatting

In dit artikel beschrijven we een gedetailleerd protocol voor het kwantificeren van de zuurstofconsumptiesnelheid en extracellulaire verzuringingssnelheid van ex vivo volwassen zebravisventrikels om hun oxidatieve en glycolytische metabole capaciteit te karakteriseren.

Samenvatting

Het vermogen van zebravissen om hun hart te regenereren gedurende de volwassenheid, wordt deels toegeschreven aan metabole aanpassingen. Hoewel er is verondersteld dat het vishart sterk afhankelijk is van glycolyse, hebben recente studies een complexer metabolisch profiel blootgelegd waarin oxidatief metabolisme een essentieel onderdeel is van cardiomyocytredifferentiatie en succesvolle regeneratie van het hart in een late stadium. In 2025 hebben we een high-throughput methode aangepast om het metabole profiel van hele zebravisventrikels ex vivo te beoordelen, met behulp van de Seahorse-assay (extracellulaire flux-assay). Deze methode maakt een snelle, realtime beoordeling mogelijk van basale en maximale zuurstofverbruikssnelheid (OCR) en extracellulaire verzuringssnelheid (ECAR) met behulp van de XF Mito Stresstest op de Seahorse XFe24-analyzer. In dit artikel beschrijven we een gedetailleerd protocol voor het uitvoeren van extracellulaire fluxanalyse op hele zebravisventrikels. Het vermogen om de OCR en ECAR ex vivo in levende hele harten te kwantificeren, biedt de mogelijkheid om het hartmetabolisme op kritieke momenten tijdens ontwikkeling, ziekteprogressie en regeneratie te verduidelijken.

Inleiding

In tegenstelling tot mensen behouden zebravissen (Danio rerio) het vermogen om verloren hartweefsel te regenereren gedurende hun volwassen leven1. Bij hartschade de-differentiëren de cardiomyocyten in de wondgrenszone en gaan ze terug in celcyclus 2,3 om het aantalcardiomyocyten 4 te herstellen en de wond opnieuw te bevolken. Recentelijk is het belang van cardiomyocyten-redifferentiatie in het regeneratieve proces erkend5. Beide processen worden streng gereguleerd door metabole veranderingen in het zebravishart, waarbij glycolyse proliferatie 6,7 aandrijft en oxidatieve fosforylering (OXPHOS) redifferentiatie8 bevordert. Hoewel farmacologische en genetische methoden om metabolisme te manipuleren wijdverbreid zijn op het gebied van regeneratie 6,7, blijft validatie van de metabole effecten van die verstoringen een uitdaging vanwege de kleine omvang van het zebravishart, dat een complexe, op maat gemaakte opstelling vereist voor canulatie 9,10,11 of het samenvoegen van meerdere harten voor massaspectrometrie12 of NMR-spectroscopie 8, 13.

Om deze beperkingen te omzeilen, beschreven we onlangs het gebruik van de Seahorse XFe24 Analyzer voor high-throughput metabole profilering van hele zebravisventrikels ex vivo8. De extracellulaire fluxassay is ontworpen om de zuurstofverbruikssnelheid (OCR) en extracellulaire verzuringssnelheid (ECAR) van cellen, alvleeskliereilandjes en sferoïden te meten. Dit wordt bereikt door solid-state sensoren die veranderingen in zuurstof- en protonconcentratie (pH) in de media detecteren die voortkomen uit het gebruik van zuurstof en glycolyseafhankelijke lactaatproductie in de respiratorische elektronentransportketen (Figuur 1A)14.

De extracellulaire fluxanalyse kan worden uitgevoerd op een 96-well plaatopstelling (XFe96 en XF Pro), 8-well miniplaten, of diverse iteraties van 24-well platen (XFe24). Hoewel de 96-putplaten een hogere doorvoer bieden, is de werkafstand tussen de sensor en de bodem van de put niet geschikt om een hele zebravisventrikel te huisvesten. Bovendien is er bij het 96-put plaatformaat geen voorziening om de ventrikel aan de onderkant van de put vast te zetten zodat deze niet in het medium drijft en de sensoren verstoort. Aan de andere kant was de XFe24 eilandjesvangstmicroplaat oorspronkelijk ontworpen voor de metabole karakterisering van primaire pancreaseilandjes en maakt daardoor de afzetting van het weefsel aan de bodem van de put mogelijk, dat vervolgens wordt vastgezet met een scherm (raster). Door de kleine grootte van het zebravishart konden we de eilandjesvangstmicroplaat aanpassen om te worden gebruikt op zebravisventrikels, die gedurende de duur van de test onder het rooster worden bevestigd.

Om de mitochondriale ademhalingscapaciteit te evalueren, gebruikten we de Mito Stress-test, waarbij vier remmers van de elektronentransportketen en de adenosinetrifosfaat (ATP) synthase werden gebruikt (Figuur 1A). Ten eerste worden basislijnmetingen van de OCR verkregen (Figuur 1B, magenta). Vervolgens wordt oligomycine, een complexe V-remmer, geïnjecteerd. Oligomycine remt de ATP-syntaseactiviteit en leidt daardoor tot een vermindering van OCR, wat te wijten is aan ATP-productie (Figuur 1B, groen). Het resterende zuurstofverbruik is het gevolg van niet-gekoppelde ademhaling en niet-mitochondriale zuurstofopname (Figuur 1B, respectievelijk oranje en grijs)15. Na oligomycine wordt FCCP geïnjecteerd, waardoor de protongradiënt over het mitochondriale membraan wordt verspreid (Figuur 1A). In een poging de protongradiënt te herstellen, verhogen de mitochondriën hun zuurstofverbruik tot hun maximale capaciteit (Figuur 1B, blauw). Ten slotte wordt een mengsel van rotenon en antimycine A gebruikt dat respectievelijk complexen I en III remt (Figuur 1A). Deze medicijncombinatie leidt tot de volledige uitschakeling van de mitochondriale respiratorische elektronentransportketen door het ontbreken van elektronenstroom van complexen I en III naar complex IV15. Dit maakt het mogelijk om het niet-mitochondriale zuurstofverbruik te meten (Figuur 1B, grijs).

Al met al konden we met behulp van de eilandvangstmicroplaat met de Mito Stresstest snel en reproduceerbaar de oxidatieve en glycolytische metabole capaciteit van hele zebravisventrikels ex vivo evalueren. We beschrijven hieronder het gedetailleerde protocol voor deze procedure. Tot slot tonen we de overleving aan van ongedeerde, wildtype geïsoleerde ventrikels ex vivo in de extracellulaire fluxanalysator, en valideren we de Mito Stresstest op 14 dagen post-cryoinjury (dpci) transgene zebravisventrikels8.

Protocol

Alle hieronder beschreven procedures met betrekking tot dieren zijn uitgevoerd in overeenstemming met de herziene Animals (Scientific Procedures) Act 1986 in het Verenigd Koninkrijk en Richtlijn 2010/63/EU in Europa en zijn goedgekeurd door het centrale comité voor dierenzorg en ethische beoordeling van de Universiteit van Oxford.

OPMERKING: Dit protocol werd uitgevoerd met een Seahorse XFe24-analyzer en het Seahorse DMEM-medium zonder fenolrood en bicarbonaat.

1. Zebravis-hartcryoletsel (optioneel)

  1. Verkrijg de juiste ethische goedkeuring van de lokale instelling en de nationale autoriteiten voordat het experiment begint.
  2. Voer cryoinjury uit op de zebravisharten zoals eerder beschreven 16,17,18.

2. Het hydrateren van de sensorcartridge

  1. Open de extracellulaire fluxassaykit en laad de 24-put nutsplaat (Figuur 2A) door 500 μL van de kaliberoplossing per put te pipetten.
  2. Sluit de bedieningsplaat met behulp van de sensorcartridge en hydrobooster (Figuur 2A).
  3. Incubeer de cartridge en de gereedschapsplaat in een bevochtigde broedmachine bij 37 °C 's nachts (18–72 uur). Houd het deksel op de sensorcartridge gedurende de hele incubatie.

3. Bereiding van de geneesmiddeloplossingen en media

  1. Maak standaardoplossingen van de geneesmiddelen: los oligomycine op in dimethylsulfoxide (DMSO) tot een concentratie van 10 mM, het carbonylcyanide 4-(trifluoromethoxy)fenylhydrazon (FCCP) in DMSO tot een concentratie van 5 mM, het rotenon in DMSO tot een concentratie van 10 mM en het antimycine A in ethanol tot een concentratie van 10 mM en bewaar het in -20 °C als het niet direct wordt gebruikt.
    OPMERKING: Het wordt aanbevolen om elke 2–3 maanden verse oligomycine-, rotenon- en antimycineoplossingen te bereiden, en elke keer FCCP-oplossing vóór het uitvoeren van de assay.
  2. Bereid de werkconcentratie van de geneesmiddelen voor (500 μM oligomycine, 300 μM FCCP, 450 μM rotenon/antimycine A-mix) door de voorraadoplossing te verdunnen in DMEM-media. Zorg ervoor dat het uiteindelijke volume voor de werkconcentraties 1,5 mL is voor oligomycine, 1,65 mL voor FCCP en 1,8 mL voor rotenon/antimycine A, zodat 30 poorten kunnen worden geladen (24 poorten per remmer op de cartridge plus 6 extra poorten per geneesmiddel om pipetfouten te corrigeren).
    OPMERKING: Er zal wat neerslag verschijnen in rotenon/antimycine A, maar na goed mengen wordt dit geminimaliseerd. Let op dat de concentraties die in 3.2 worden genoemd 10 keer de uiteindelijke concentratie van de geneesmiddelen zijn wanneer ze in de putten worden geïnjecteerd.
  3. Bereid het DMEM-medium (pH 7,4) voor om 10 mM glucose, 1 mM pyruvaat en 2 mM glutamine te bevatten, en bewaar het bij -20 °C tot gebruik.

4. Het inschakelen van de extracellulaire fluxanalysator

  1. Zet de analyzer aan vanaf de zijknop 's nachts voor de test om temperatuurbalans met de omgeving te garanderen.
  2. Zet de computer aan en open de Wave-software.
  3. Selecteer de Mito Stress-test in de software.
  4. Schakel de verwarming linksonder in de software uit zodat de temperatuur in de analyzer onder de 37 °C zakt en 28–29 °C bereikt om de standaardtemperatuur van zebravishouderij19 te benaderen.
  5. Stel de injectiestrategie in op de pagina Groepsdefinities (onder het tabblad injectiestrategieën ) door de verbindingen toe te voegen die in elke poort uit de verbindingencatalogus worden gedeponeerd. Voor de Mito Stresstest voeg je oligomycine toe in poort A, FCCP in poort B, en rotenon/antimycine in poort C. Er is capaciteit voor de toevoeging van nog een medicijn in port D, dat in dit protocol niet wordt gebruikt.
  6. Verwijder alle andere vooraf ontworpen strategieën die bestaan onder het tabblad injectiestrategieën zodra de experimentele strategie is gedefinieerd. Specificeer de experimentele groepen (bijv. wild-type en mutant) aan de Groepen-kant van de pagina, en geef de injectiestrategie aan die zij zullen ontvangen (die gedefinieerd in stap 4.5). Zorg ervoor dat de injectiestrategieën overeenkomen tussen groepen en ook aansluiten bij de ontwikkelde injectiestrategie.
  7. Op de pagina Plaatkaart specificeer je de positie van elk monster op de 24-put plaat door op elke groep te klikken en vervolgens op de putten te klikken die de monsters zullen bevatten.
    1. Let op dat vier van de putten niet geschikt zijn voor monsterafzetting (Figuur 2B) en dienen als blanks die worden gebruikt voor achtergrondcorrectie. Zorg ervoor dat de monsters in elke groep gelijkmatig over de plaat zijn verdeeld om potentiële positionele bias in metingen of omgevingsomstandigheden te compenseren.
  8. Verwijder op de protocolpagina het tabblad Control of Experimenteel als er geen extra remmer wordt gebruikt behalve hierboven vermeld, en zorg ervoor dat de softwarepoorten overeenkomen met de posities van de medicijnen op de cartridge.
  9. De software stelt automatisch 3 cycli van mengen, wachten en meten per conditie in. Pas het aantal cycli aan naar 10 basislijnmetingen (onbehandeld), 3 oligomycine, 7 FCCP en 9 rotenon/antimycine A-metingen om stabiele sporen te laten plaatsvinden en de remmers op het 3D-weefsel te laten werken. Zorg ervoor dat elke cyclus bestaat uit 3 minuten mengen, 2 minuten wachten en 3 minuten meten.

5. Kalibratie van de analyzer

  1. Verwijder de cartridge en de bedieningsplaat uit de bevochtigde broedmachine (zie stappen 2.1–2.3).
  2. Verwijder de hydrobooster en het deksel (Figuur 2A) van de cartridge en plaats de sensorcartridge op de bedieningsplaat met het kaliber.
  3. Pipetteer de inhibitoren voorzichtig in hun respectievelijke poorten terwijl je de zijwand van de poort raakt met de pipetpunt, zodat de vloeistof soepel stroomt: 50 μL oligomycine in poort A, 55 μL FCCP in poort B, en 60 μL rotenon/antimycine A in poort C (Figuur 2C).
    1. Let op dat de vloeistof alleen op zijn plaats wordt gehouden door oppervlaktespanning bij het gat in de poort, dus vermijd vanaf deze stap abrupt pipetteren of het plakken van de cartridge. Zorg ervoor dat er geen vloeistof in de sensorpoort komt (Figuur 2C), want dit zou de analyzer beschadigen.
  4. Klik op start run in de software, geef de run een naam en sla het op op de computer. Op dat moment opent de tray van de analyzer zich om de cartridge en de bedieningsplaat te plaatsen.
  5. Plaats de cartridge geladen met de medicijnen en de bedieningsplaat met het kaliber op de analyzertray volgens de plaatkaart op de tray (A1-put linksboven) en zorg voor een goede pasvorm. Haal de brandkraanbooster en het deksel (Figuur 2A) van de plaat voordat je het op de bak zet. Als dit niet gebeurt, beschadigt u de analyzer.
  6. Als het klaar is, geef je de software instructies om de assay te starten door op 'run assay' te drukken. Op dat moment neemt de analyzer de geladen tray binnen en start de kalibratie.
  7. Begin met de hartisolatie (zie stappen 6.1–6.12). De kalibratie duurt ongeveer 40 minuten, maar de plaat kan in de analyzer blijven zitten zolang het nodig is om de harten te isoleren en in de eilandvanger-microplaat te plaatsen (Figuur 2B,D).

6. Het isoleren van de visharten en het laden ervan op de 24-put Eilandplaat

  1. Open de eilandvanger-microplaat en laad de 24-put eilandplaat met 500 μL DMEM (10 mM glucose, 1 mM pyruvat, 2 mM glutamine) bij kamertemperatuur.
  2. Plaats alle roosters in een 35 mm petrischaal met DMEM-media op kamertemperatuur, zodat ze volledig ondergedompeld zijn en vrij van grote bellen.
  3. Bereid een extra 35 mm petrischaal voor met DMEM (10 mM glucose, 1 mM pyruvaat, 2 mM glutamine) bij kamertemperatuur. Dit dient om de harten bij het verzamelen te spoelen en de ventrikel van de atria en bulbus arteriosus te ontleden.
  4. Cul één vis in 5 g/L MS-222 en controleer op het ontbreken van reflexen.
  5. Plaats de vis op een spons die vastzit op een 92 mm petrischaal, open de hartholte en dissectieer het hart zoalseerder beschreven.
  6. Spoel de harten af in de 35 mm petrischaal met DMEM (10 mM glucose, 1 mM pyruvaat, 2 mM glutamine) op kamertemperatuur.
  7. Verwijder het atrium en bulbus arteriosus met de pincet in de 35 mm petrischaal.
  8. Schud en knijp zachtjes in de ventrikel zodat het bloed uit zijn lumen kan weglopen. Beschadig de ventrikelwand niet bij het wassen van het hart.
  9. Breng het hart over naar de aangewezen put op de eilandopvangmicroplaat en laat het zakken naar het midden van de juiste put volgens de plaatkaart. Houd het bord op kamertemperatuur. Neem alle ventrikels mee in de testsay, zelfs als ze zichtbaar stoppen met kloppen.
  10. Herhaal het proces voor alle beschikbare vissen. Als je de metabole activiteit van verschillende experimentele groepen vergelijkt, raden we aan om één hart per groep te isoleren in plaats van alle harten uit één groep, voordat je doorgaat naar de volgende. Hoewel de harten minstens 180 minuten in de analyzer kunnen overleven (Figuur 3A), stellen wij voor dat isolatie één hart per groep tegelijk plaatsvindt als beste praktijk om een gelijke tijdsverdeling in het medium tussen groepen te waarborgen.
  11. Zodra alle harten zijn geïsoleerd (ongeveer 60 minuten voor een plaat van 20 harten), leg ze dan onderaan de microplaat-opvang van het eiland (Figuur 2B) en plaats ze in het midden van de put met behulp van een dunne pincet (Figuur 2D, E).
  12. Gebruik een tang om ze met het rooster te bedekken (ongeveer 20 minuten) (Figuur 2D). Zorg ervoor dat het raster in de juiste oriëntatie staat (mesh naar beneden gericht naar het hart) en geen grote belletjes bevat, omdat dit de metingen kan verstoren (Figuur 2E).
    1. Zodra het rooster op zijn plaats is, gebruik je de tang om het vanaf de randen vast te duwen totdat er een zacht klikje klinkt. Zorg ervoor dat je het hart niet met de tang door het raster laat crashen.

7. Het laden van de monsters op de analyzer en het verzamelen van metingen

  1. Zodra de harten zijn omsloten in de eilandvangermicroplaat, controleer je in de software of alle putten succesvol zijn gekalibreerd, zoals blijkt uit groene vinkjes op het computerscherm. Gooi nu de gereedschapsplaat uit door op de open bak te drukken.
    OPMERKING: De cartridge wordt op dit moment niet uitgeworpen, en alleen de bedieningsplaat met het kaliber zal verschijnen.
  2. Vervang de nutsplaat door de microplaat van het eilandje met de monsters op de analyzertray. Zorg ervoor dat de microplaat van het eilandje correct is geplaatst (A1 linksboven) en dat het deksel is verwijderd. Het niet verwijderen van het deksel beschadigt de analyzer.
  3. Zodra de eilandplaat is gepositioneerd, geef je de software instructies om het experiment te starten door op de load cell plaat te drukken. Gedurende ongeveer de eerste 10 minuten voeren de sensoren een equilibratiestap uit en beginnen de metingen.
  4. Zodra het experiment is voltooid (ongeveer 4 uur), druk je op de uitwerppatroon zodat de tray kan openen en de eilandjesmicroplaat en patroon worden uitgeworpen.
  5. Verwijder de microplaat en cartridge van het eilandje en druk klaar zodat de tray sluit. Op dit punt kun je de resultaten bekijken om de verzamelde gegevens te zien.
  6. Sla de metingen op, exporteer ze van de analyzercomputer en upload ze op de analytics-interface voor verdere analyse en verwerking. Dit zal de excisie van de eilandplaat en cartridge uit de analyzer activeren.
  7. Verwijder de eilandplaat en het patroon van de analyzer en sluit de patroon met het deksel.
  8. Bevries de eilandplaat op droogijs of verwijder de harten uit de putten (zie stap 8.2) en bewaar bij -20 °C als de eiwitisolatie voor normalisatie (stap 8) niet direct wordt uitgevoerd.
  9. Zodra de data is opgeslagen, zet je de software, de analyzer en de computer uit.
  10. Upload de data op de analyse-interface en visualiseer deze door de OCR-grafiek te selecteren vanuit de optie standaardweergaven . Bekijk de data op de interface als OCR- en ECAR-niveau of -snelheid, corrigeer de achtergrond op basis van de lege putten, en selecteer putten om te visualiseren door op de plaatkaart te klikken om ze te laten verschijnen of verdwijnen.

8. Eiwitisolatie en kwantificering voor normalisatie

  1. Bereid een proteaseremmer-bevattende radioimmunoprecipitatietest (RIPA) buffer voor door één proteaseremmertablet op te lossen in 10 mL RIPA-buffer en goed te mengen.
  2. Als dat nog niet is gedaan (stap 7.8), gebruik de eilandopnamescherm-invoegtool (Figuur 2F) om de rasters van de eilandplaat te verwijderen om de harten vrij te maken. Verwijder de harten voorzichtig, want ze kunnen vast zitten op het raster. Als dat het geval is, gebruik dan de tang om ze los te maken. Als het rooster niet verwijderd kan worden met het scherminzetgereedschap, plaats je de plaat onder de stereoscoop en knip je met microdissectieschaar voorzichtig het rooster om het hart vrij te maken.
  3. Plaats elke ventrikel in een buis van 1,5 mL met 200 μL RIPA-buffer, verrijkt met proteaseremmer op ijs.
  4. Homogeniseer het hart met een homogenisator met wegwerpstappels op ijs.
  5. Bereid de standaarden voor door het geleverde rundveeserumalbumine (BSA) in de RIPA-buffer te verdunnen in de volgende concentraties: 2000 μg/mL, 1500 μg/mL, 1000 μg/mL, 750 μg/mL, 500 μg/mL, 250 μg/mL, 125 μg/mL, 25 μg/mL, 0 μg/mL.
  6. Bereid de werkende oplossing van de Pierce BCA voor (50:1, reagens A: reagens B, volgens de instructies van de fabrikant). Bereken het benodigde volume werkreagens met de volgende formule:
    (aantal standaarden + aantal monsters) × 2 × 200 μL
    OPMERKING: Dit volume maakt het gebruik van 200 μL werkoplossing per monster en standaard mogelijk, en maakt het mogelijk dubbele metingen per monster en standaard te verkrijgen.
  7. In een 96-well-plaat voeg je 25 μL van elke standaard toe en elke monster per put in duplicaaten.
  8. Voeg 200 μL van de werkoplossing per put toe.
  9. Breng de plaat 30 minuten uit op 37 °C.
  10. Laat de plaat 10 minuten afkoelen tot kamertemperatuur en sluit hem af met een plaatsealer. Zorg ervoor dat er geen belletjes in de gaten zitten, want dit kan de plaatlezer blokkeren. Als er een beperkt aantal bubbels ontstaat, gebruik dan een punt of de dunne tang om ze te laten knappen.
  11. Meet de absorptie bij 562 nm met een plaatlezer.
  12. Genereer een standaardcurve op basis van de absorptie van de standaarden en bereken de eiwitconcentratie van de monsters.
  13. Log de eiwitconcentratie op het normalisatietabblad (Figuur 2G) van de analytics-interface voor elke put.

9. Data-analyse

  1. Na het normaliseren met de eiwitinhoud, exporteer je de gegevens vanuit de analytics-interface als Excel- of Prism-bestanden voor verdere analyse met de cloudknop rechtsboven in de grafiek.
  2. Met behulp van de genormaliseerde gegevens bereken je de basislijn OCR en ECAR als het gemiddelde van de basislijnmetingen, exclusief de eerste drie verwervingen, omdat het signaal bij de eerste metingen onstabiel kan zijn.
  3. Met behulp van de genormaliseerde gegevens bereken men de maximale OCR en ECAR de gemiddelde metingen van de top drie aankopen van de FCCP-behandeling.

Resultaten

Dit protocol maakt het mogelijk om de OCR en ECAR van hele zebravisventrikels te kwantificeren. We valideerden de overlevingskansen van de ventrikels in een ex vivo setting door ongeschonden wildtype KCL-ventrikels in de analyzer te incuberen zonder enige medicamenteuze behandeling (Figuur 3A). De gegevens geven aan dat de ventrikels een stabiele OCR en ECAR hebben, die significant hoger zijn dan de basismetingen van de lege putten gedurende minstens 180 minuten (Figuur 3A). Deze gegevens suggereren dat de ventrikels normale ademhalingsfunctie en overleving vertonen in deze ex vivo omgeving.

We voerden verschillende OCR-metingen uit met verschillende geneesmiddelenconcentraties en mediaformuleringen om de optimale dosering voor de ventrikels te bepalen (Figuur 3B). We observeerden een milde toename in OCR-vouwverandering (FCCP/basal) bij gebruik van de combinaties [oligomycine] 10 μM, [FCCP] 8 μM en [rotenon/antimycine] 25 μM, en een iets grotere toename in [oligomycine] 50 μM, [FCCP] 30 μM en [rotenon/antimycine] 45 μM (Figuur 3B). Als gevolg daarvan gingen we door met de laatste concentraties voor onze experimenten. Omdat de ventrikel een 3D-structuur is, is het mogelijk dat de medicijnen sterk inwerken op de externe cellen van het weefsel zonder de cellen aan de luminale zijde van de ventrikel te bereiken. Om dit aan te pakken, voerden we een permeabilisatiestap uit waarbij we de harten behandelden met 0,5% saponine gedurende 30 minuten vóór incubatie in DMEM (10 mM galactose, 1 mM pyruvaat, 4 mM glutamine). Dit resulteerde in een aanhoudende vermindering van OCR en het ontbreken van de verwachte toename van OCR na FCCP-injectie (Figuur 3C), wat suggereert dat de harten metabolisch faalden. Daarom hebben we de ventrikels niet permeabiliseerd voor onze experimenten.

Verder presenteren we hier de genormaliseerde sporen van ons oorspronkelijke experiment8. Door gebruik te maken van de natuurlijke variatie in regeneratief potentieel van zeven wildtype-zebravisstammen, identificeerden we mdh1ab, de cytosolische malate dehydrogenase 1Ab, die een gunstig effect heeft op regeneratie via cardiomyocytendifferentiatie. Om deze bevinding te bevestigen, produceerden we transgene zebravissen die mdh1ab overexpresseren op een cardiomyocyt-specifieke manier (mdh1ab cOE) en controleerden we visen die groen fluorescerende eiwit overexpresseren (GFP cOE). We hebben hun ventrikels cryo-gewond, ze op 14 dpci verzameld en hun metabolisme onderzocht met behulp van de Mito Stresstest (Figuur 3D). De oligomycinebehandeling veranderde de OCR niet significant, hoewel een lichte toename van ECAR werd waargenomen. Injectie van FCCP in de media resulteerde in de verwachte toename van OCR en ECAR, waarbij de mdh1ab cOE-monsters de hoogste maximale ademhalingscapaciteit behielden (Figuur 3D). Tot slot leidde rotenon/antimycine tot het volledig stoppen van het metabolisme in beide groepen. Al met al stelde deze methode ons in staat significante verschillen te identificeren in de metabole capaciteit van de mdh1ab-overexpressieve ventrikels en tussen zeven verschillende wildtype zebravisstammen8.

figure-results-1
Figuur 1: Glucosemetabolisme tijdens een Mito Stresstest. (A) Schematische weergave van glucosemetabolisme. Glucose komt via de GLUT-transporters de cel binnen en wordt via glycolyse omgezet in pyruvaat. Lactaatdehydrogenase (LDH) zet pyruvaat om in lactaat, en de resulterende protonen worden uit de cel afgescheiden. Pyruvaat wordt omgezet in acetyl-CoA en komt in de mitochondriën- en TCA-cyclus om de respiratorische elektronentransportketen in het binnenste mitochondriale membraan te voeden. De inhibitoren van complexen I, III en V, evenals de ontkoppelaar FCCP, zijn rood weergegeven. Elektronen die via de respiratorische elektronentransportketen worden aangeduid met blauwe pijlen, die uiteindelijk leiden tot de omzetting van zuurstof en protonen in water. (B) Mito Stresstest resultaten schematisch. Basale ademhaling wordt opgemerkt in magenta. Bij oligomycine-injectie daalt de OCR, waardoor de ATP-gekoppelde ademhaling (groen) en het protonlek (oranje) kunnen worden berekend. FCCP verhoogt de OCR tot de maximale ademhalingscapaciteit van de cellen (blauw). Rotenon en antimycine A-injectie leiden tot het uitschakelen van de mitochondriale ademhaling en laten alleen niet-mitochondriale ademhaling plaatsvinden (grijs). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

figure-results-2
Figuur 2: Sensorcartridge en eiland-capture microplaat-indeling. (A) Afbeelding van het deksel-sensor cartridge-hydro booster-utility plate complex (boven) en de omgekeerde sensorcartridge (onder). Schubbalk: 1 cm. (B) Afbeelding van een eilandjesvangstmicroplaat geladen met zebravisventrikels. De rode cirkels geven de lege putten aan die geen ventrikels bevatten en dienen als achtergrondcorrectie tijdens de analyse. Schaalbalk: 1 cm. (C) Schematische weergave van de poortindeling in de XFe24 sensorcartridge. Port A bevat oligomycine, B bevat FCCP en C bevat de rotenon/antimycinemix. Port D kan leeg worden gelaten, of er kan een extra medicijn worden toegevoegd. S duidt de sensorpoort aan, die geen vloeistof mag bevatten om de analyzer niet te beschadigen. (D) Representatief beeld van een zebravisventrikel onderin de put, omgeven door het raster (links) en zonder raster (rechts). Schaalbalk: 5 mm. (E) Schematische doorsnede van de eilandvangermicroplaat met een ventrikel, het rooster (geel) en de sensorcartridge (groen). P staat voor de poorten en S voor de sensor. De golvende lijn vertegenwoordigt het medium. (F) De eilandopname-scherminvoegtool. Scalebar: 1 cm. (G) Normalisatie-tabblad icoon op de analytics-interface. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

figure-results-3
Figuur 3: Vertegenwoordigende OCR- en ECAR-metingen van de ventrikels van zebravissen. (A) Vertegenwoordigende OCR- en ECAR-sporen van ongedeerde wildtype zebravisventrikels (KCL-stam) die niet zijn behandeld met de remmers die in de assay zijn gebruikt (n = 2, rode lijn). De sporen die voortkomen uit lege putten die geen biologisch materiaal bevatten, worden weergegeven in grijs (n = 4); OCR, tweerichtings-herhaalde metingen ANOVA, tijdsfactor P = 0,0200, tijd × putinteractie P = 0,0196, putfactor P < 0,0001, groepsfactor P < 0,0001; ECAR tweerichtings-herhaalde metingen ANOVA, tijdsfactor P = 0,1323, tijd × putinteractie P = 0,0216, putfactor P = 0,0009, groepsfactor P<0,0001; gegevens gepresenteerd als gemiddelde ± SEM. (B) OCR-vouwverandering bij verschillende geneesmiddelconcentraties en gebruikte media. Eenrichtings-ANOVA (P = 0,0032) met Tukey's meervoudige vergelijkingstest. [O] 5 μM, [F] 4 μM, [RA] 2 μM, n = 6; [O] 10 μM, [F] 8 μM, [RA] 25 μM, n = 8; [O] 25 μM, [F] 16 μM, [RA] 45 μM, n = 8; [O] 50 μM, [F] 30 μM, [RA] 45 μM, n = 8; [O] 100 μM, [F] 60 μM, [RA] 90 μM, n = 8. O, oligomycine; F, FCCP; RA, rotenon/antimycine. (C) Sporen van saponine-permeabiliseerde ventrikels (rood, n = 4) vergeleken met onbehandelde ventrikels (grijs, n = 4); tweerichtingsherhaalde metingen ANOVA, tijdsfactor P < 0,0001, tijdsinteractie × monster P < 0,0001, behandelingsfactor P < 0,0001, steekproeffactor P = 0,824; gegevens gepresenteerd als gemiddelde ± SEM.OCR-maximum van met saponine behandelde ventrikels vergeleken met onbehandelde ventrikels; T-test van ongepaarde leerling (P = 0,0850). (D) Representatieve OCR- en ECAR-sporen van mdh1ab cOE (rood, n = 8) en GFP cOE (grijs, n = 8) 14dpci ventrikels. OCR, tweerichtings-herhaalde metingen ANOVA, tijdsfactor P < 0,0001, tijd × steekproefinteractie P < 0,0001, genotypefactor P < 0,0001, steekproeffactor P = 0,1098; ECAR, tweerichtings-herhaalde metingen ANOVA tijdsfactor P < 0,0001, tijd × steekproefinteractie P = 0,7507, steekproeffactor P = 0,2154, genotypefactor P < 0,0001. Gegevens aangepast van Lekkos et al., 20258 en weergegeven als gemiddelde ± SEM. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Discussie

Hier beschrijven we in detail het protocol voor het analyseren van de OCR en ECAR van ex vivo zebravisventrikels met behulp van de Seahorse XFe24-analyzer en de Mito Stresstest. De metabolisme van cardiomyocyten speelt een essentiële rol bij hartregeneratie 21,22,23,24. Echter, validatie van het metabole fenotype van het regenererende zebravishart is uitdagend geweest en ontbreekt vaak in publicaties 6,7. Vanwege de kleine grootte van het zebravishart vereisen technieken zoals NMR-spectroscopie of massaspectrometrie het samenvoegen van meerdere ventrikels om voldoende signaal 8,12,13 te verkrijgen. Daarentegen maakt de hier beschreven methode het mogelijk om OCR- en ECAR-metingen van meerdere individuele ventrikels te verkrijgen, waardoor de statistische kracht toeneemt.

Klassieke methoden voor metabole profilering, zoals metabolomics, geven een momentopname van het metabole profiel van het weefsel op het moment dat het werd verzameld. Via de Mito Stresstest konden we realtime, live data verzamelen over hoe de ventrikels zich aanpassen aan verschillende metabole uitdagingen, waaronder hun maximale ademhalingscapaciteit, wat niet duidelijk is bij andere methodologieën. Om levende fenotypering van de ventrikels van zebravissen te bereiken, is geprobeerd om het zebravishart te perfusjoneren. Dit vereist complexe, op maat gemaakte apparatuur en hooggekwalificeerde technici om canulatie te bereiken terwijl het een laag-doorvoer methode blijft. De analyzer biedt een eenvoudiger alternatief met een commercieel verkrijgbaar apparaat voor high-throughput (20 ventrikels tegelijk) fenotypering van ventrikels. Voor zover wij weten, is er geen directe vergelijking gemaakt van de in dit artikel beschreven methode met andere technieken van live oximetrie, zoals een Clark-type elektrode.

Belangrijk is dat de methode die we beschrijven aanpasbaar is afhankelijk van de onderzoeksvraag. De assay is eerder gebruikt om hele zebravisembryo's te karakteriseren25,26. Naast de hier beschreven Mito Stress-test is de Mito Fuel Flex-test geoptimaliseerd om het metabole brandstofverbruik van menselijke hartsneden27 te evalueren. Bovendien is de Cell Energy Phenotype Test aangepast om de glycolytische capaciteit van regenererende Astyanax mexicanus hartente karakteriseren. We verwachten dat dit protocol zal worden gebruikt voor andere 3D-structuren zoals cardiale organoïden, en nuttig zal zijn voor het valideren van genetische verstoring van metabole routes in ongedeerde zebravisharten.

We erkennen dat deze techniek bepaalde beperkingen heeft. Wat technische uitdagingen betreft, werden de harten bij isolatie behandeld in DMEM-medium dat op kamertemperatuur was en niet op 28 °C werd gehouden, wat de optimale temperatuur is voor zebravis19. Het verlagen van de watertemperatuur tot 18 °C kan aanzienlijke effecten hebben op de functie van het zebravishart in situ29,30. We verwachten echter niet dat kortdurende blootstelling aan kamertemperatuur een significant effect zal hebben op de fysiologie van de geïsoleerde ventrikels, aangezien de ventrikels snel terugkeren naar de 28 °C analyzer. In onze handen stopten de meeste ventrikels zichtbaar met kloppen bij de dissectie van het atrium, wat wijst op het ontbreken van een pacemakerstimulus als oorzaak van de niet-contractie. Bovendien was het medium tijdens de isolatieperiode niet zuurstofrijk, wat mogelijk leidde tot milde hypoxie, die na het mengen in de analyzer vóór de eerste meting weer normaal wordt.

Een extra praktische overweging met betrekking tot de temperatuur van de harten heeft ook te maken met het uitschakelen van de verwarming in de analyzer, wat leidt tot een temperatuurverlaging van 37 °C naar 28–29 °C. De analyzer laat de verwarmer niet toe om het vermogen van de verwarming te verminderen tot de gewenste temperatuur. Toch is de temperatuur in de tray 6–7 °C hoger dan de kamertemperatuur wanneer de analyzer draait. Dit temperatuurbereik valt samen met de optimale zebravishouderijtemperatuur19.

Deze test wordt uitgevoerd op bulkventrikels van zebravissen. Daarom is het onmogelijk om de bijdragen van individuele celtypen aan de veranderingen die in de OCR en ECAR worden waargenomen te onderscheiden. Dit kan van groot belang blijken bij het onderzoeken van de metabole snelheden van vroege regeneratieve tijdstippen wanneer de hoge instroom van immuuncellen31 de OCR-veranderingen van cardiomyocyten kan maskeren. Daarnaast kan het resterende bloed in het ventrikellumen de metabole waarden beïnvloeden. Het laten bloeden van de harten in aanwezigheid van heparine7 kan de invloed van bloedcellen in het hart verder verminderen. Bovendien hebben we, om de diffusie van de remmers naar de binnenste cellen van de ventrikel te verbeteren, een permeabilisatiestap geprobeerd met saponine. Saponine-permeabilisatie leidde tot een aanhoudende daling van OCR gedurende de testsay, waardoor de ventrikels tot ademhalingsfalen leidden. Deze beperkingen kunnen worden vermeden door isolatie, kweek en analyse van geïsoleerde cardiomyocyten, hoewel deze aanpak langdurige kweek van cellen32 vereist, wat mogelijk niet optimaal is voor een regeneratieve omgeving.

Het beschadigde weefsel kan de gebruikte normalisatiemethode beïnvloeden. In deze studie normaliseren we de OCR met μg-eiwit/mL met behulp van de BCA-assay. Hoewel de BCA-assay niet sterk reageert met collageeneiwitten vanwege hun hydroxyproline- en prolinerijke samenstelling, die slecht worden gedetecteerd met coper, kan de aanwezigheid van andere celloze wondcomponenten de normalisatie beïnvloeden. Toekomstige studies zouden het gebruik van totaal DNA33 kunnen beschouwen als een nauwkeurige weergave van levende cellen in de ventrikel.

Bovendien konden we de verwachte vermindering van OCR veroorzaakt door oligomycine-afhankelijke remming van complex V15 niet reproduceren. Hoewel bepaalde studies een vermindering van OCR door oligomycinebehandeling van geïsoleerde cardiomyocyten32,34,35 aantonen, lijken de gegevens hier op het gebrek aan respons dat werd gerapporteerd in een recente studie naar geïsoleerde volwassen muiscardiomyocyten36. Aangezien de oligomycineconcentratie die we gebruiken aanzienlijk hoger is dan die in de eerder genoemde studies is gerapporteerd, is het onduidelijk of het verhogen van de uiteindelijke concentratie tot meer dan 50 μM effect zou hebben.

Ten slotte, hoewel het zuurstofverbruik voornamelijk afhankelijk is van de ademhaling, wordt de extracellulaire verzuring niet uitsluitend veroorzaakt door het lactaat dat door glycolyse wordt geproduceerd, maar ook door de omzetting van kooldioxide naar koolzuur. Er is gerapporteerd dat in door glucose gevoede myoblasten een derde van de extracellulaire verzuring het gevolg is van kooldioxide onder basisomstandigheden37. Daarom adviseren wij voorzichtigheid bij de interpretatie van de ECAR-metingen die voortkomen uit de Seahorse-analyzer als er geen correctie is uitgevoerd voor het aandeel van de door ademhaling veroorzaakte verzuring38.

Openbaarmakingen

De auteurs geven geen belangenconflict aan.

Dankbetuigingen

We zijn dankbaar voor Nick Howe (Agilent Technologies) en Thomas Nicol (University of Oxford) voor hun steun en kritische discussie tijdens de ontwikkeling van deze methode. Wij willen graag het personeel van onze dierenfaciliteit op niveau 1 (University of Oxford, Biomedical Services Unit) en van het Institute of Developmental and Regenerative Medicine (University of Oxford) erkennen voor het onderhouden en overdragen van de zebravis. Dit werk is ondersteund door de Medical Research Council (MR/W006731/1 aan KL), King Faisal Specialist Hospital & Research Centre (postdoctoraal fellowship aan RA), Wellcome Institutional Strategic Support Fund (204826/Z/16/Z tot JSOM), British Heart Foundation IBSRF (FS//17/58/33072 aan LCH), European Research Council (ERC) onder het Horizon 2020 onderzoeks- en innovatieprogramma van de Europese Unie (715895, CAVEHEART, ERC-2016-STG tot MTMM), British Heart Foundation-projectsubsidies (PG/15/111/31939 en PG/23/11189 aan MTMM), MTMM erkent steun van het BHF Oxford Centre of Research Excellence, University of Oxford (RE/24/130024) en het BHF Centre of Regeneratieve Geneeskunde (RM/13/3/30159).

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
1.5ml Eppendorf tubes StarlabS1615-5550
96-well plate ThermoFisherAB-0800
Antimycin AChemCruz sc-202467A
DMEM mediumAgilent1035755-100
DMSOSigma-Aldrich D2650-100mL
Dry ice 
EthanolSupelco1.00983.2500
Extracellular Flux Assay Kit Agilent103518-100pack bevat utility plate, hydro booster, sensor cartridge, lid (wordt geleverd met de islet plates)
FCCPSigma-Aldrich C2920
GlucoseAgilent103577-100
GlutamineAgilent103579-100
Incubator
Islet capture microplateAgilent101122-10025 roosters inbegrepen in de verpakking
Islet capture screen inster toolAgilent101135-100
microdissection forcepsideal-tek31317605-S maat (2x nodig om de ventrikkel te isoleren van de bulbus arteriosus en atrium)
microdissection scissorsFST15009-08
MS-222Sigma-Aldrich E10521
OligomycinMP 151786
Pestle mottor homogeniser VWR431-0100
PestlesVWR431-0094
petri dish 35mmGreiner Bio-One627102
petri dish 92mmStarstedt82.1473
Pierce BCA Assay KitThermo Scientific23227
Pierce Protease and Phosphatase Inhibitor Mini Tablets,EDTA-freeThermo ScientificA32961
PyruvateAgilent103578-100
RIPA lysis buffersanta-crussc-364162
RotenoneMP 02150154-CF
Seahorse Analytics Agilent interphaseAgilenthttps://www.agilent.com/en/product/cell-analysis/real-time-cell-metabolic-analysis/xf-software/agilent-seahorse-analytics-787485
Seahorse XFe24 AnalyzerAgilenthttps://www.agilent.com/en/product/cell-analysis/real-time-cell-metabolic-analysis/xf-analyzers/seahorse-xfe24-analyzer-740878
SealerThermo ScientificAB-0558
SPECTROstar NanoMG LABTECH GmbH601-0298
Spongemaak een insnijding lang en diep genoeg om de buikzijde van de vis naar boven te passen
Wave (version 2.6.1.56)Agilenthttps://www.agilent.com/en/products/cell-analysis/software-download-for-wave-desktop
XF calibrant Agilent100840-000

Referenties

  1. Poss, K. D., Wilson, L. G., Keating, M. T. Heart regeneration in zebrafish. Science (1979). 298 (5601), 2188-2190 (2002).
  2. Jopling, C., et al. Zebrafish heart regeneration occurs by cardiomyocyte dedifferentiation and proliferation. Nature. 464 (7288), 606-609 (2010).
  3. Kikuchi, K., et al. Primary contribution to zebrafish heart regeneration by gata4+ cardiomyocytes. Nature. 464 (7288), 601-605 (2010).
  4. Bertozzi, A., et al. Is zebrafish heart regeneration "complete"? Lineage-restricted cardiomyocytes proliferate to pre-injury numbers but some fail to differentiate in fibrotic hearts. Dev Biol. 471, 106-118 (2021).
  5. Nguyen, P. D., et al. Interplay between calcium and sarcomeres directs cardiomyocyte maturation during regeneration. Science (1979). 380 (6646), 758-764 (2023).
  6. Fukuda, R., et al. Stimulation of glycolysis promotes cardiomyocyte proliferation after injury in adult zebrafish. EMBO Rep. 21 (8), e49752(2020).
  7. Honkoop, H., et al. Single-cell analysis uncovers that metabolic reprogramming by ErbB2 signaling is essential for cardiomyocyte proliferation in the regenerating heart. Elife. 8, e50163(2019).
  8. Lekkos, K., et al. Oxidative phosphorylation is required for cardiomyocyte redifferentiation and long-term fish heart regeneration. Nat Cardiovasc Res. 4 (10), 1363-1380 (2025).
  9. Zhang, H., et al. A Langendorff-like system to quantify cardiac pump function in adult zebrafish. Dis Model Mech. 11 (9), dmm034819(2018).
  10. Zhang, P. C., Llach, A., Sheng, X. Y., Hove-Madsen, L., Tibbits, G. F. Calcium handling in zebrafish ventricular myocytes. Am J Physiol Regul Integr Comp Physiol. 300, 56-66 (2011).
  11. Lin, E., et al. Construction and use of a zebrafish heart voltage and calcium optical mapping system, with integrated electrocardiogram and programmable electrical stimulation. Am J Physiol Regul Integr Comp Physiol. 308, R755-R768 (2015).
  12. Miklas, J. W., et al. Amino acid primed mTOR activity is essential for heart regeneration. iScience. 25 (1), 103574(2022).
  13. García-Poyatos, C., et al. Cox7a1 controls skeletal muscle physiology and heart regeneration through complex IV dimerization. Dev Cell. 59 (14), 1824-1841.e10 (2024).
  14. How Agilent Seahorse XF Analyzers Work. , Agilent. https://www.agilent.com/en/products/cell-analysis/how-seahorse -xf-analyzers-work?srsltid=AfmBOopkIZodH4uZO 5puXTOp1U5gdkky661L6TKluz5XgBWGqujHEzww (2026).
  15. Yoo, I., Ahn, I., Lee, J., Lee, N. Extracellular flux assay (Seahorse assay): Diverse applications in metabolic research across biological disciplines. Mol Cells. 47 (8), 100095(2024).
  16. Chablais, F., Jaźwińska, A. Induction of myocardial infarction in adult zebrafish using cryoinjury. J Vis Exp. (62), e3666(2012).
  17. González-Rosa, J. M., Mercader, N. Cryoinjury as a myocardial infarction model for the study of cardiac regeneration in the zebrafish. Nat Protoc. 7 (4), 782-788 (2012).
  18. Schnabel, K., Wu, C. C., Kurth, T., Weidinger, G. Regeneration of cryoinjury induced necrotic heart lesions in zebrafish is associated with epicardial activation and cardiomyocyte proliferation. PLoS One. 6 (4), e18503(2011).
  19. Aleström, P., et al. Zebrafish: Housing and husbandry recommendations. Lab Anim. 54 (3), 213-224 (2019).
  20. Singleman, C., Holtzman, N. G. Heart dissection in larval, juvenile and adult zebrafish, Danio rerio. J Vis Exp. (55), e3165(2011).
  21. Duan, X., Liu, X., Zhan, Z. Metabolic regulation of cardiac regeneration. Front Cardiovasc Med. 9, 933060(2022).
  22. Yu, F., Cong, S., Yap, E. P., Hausenloy, D. J., Ramachandra, C. J. Unravelling the interplay between cardiac metabolism and heart regeneration. Int J Mol Sci. 24 (12), 10300(2023).
  23. Cook, M., Lal, S., Hume, R. D. Transcriptional, proteomic and metabolic drivers of cardiac regeneration. Heart. 111 (18), 851-858 (2025).
  24. Chen, X., et al. Metabolic reprogramming: A byproduct or a driver of cardiomyocyte proliferation. Circulation. 149 (20), 1598-1610 (2024).
  25. Bond, S. T., McEwen, K. A., Yoganantharajah, P., Gibert, Y. Live metabolic profile analysis of zebrafish embryos using a seahorse XF 24 extracellular flux analyzer. Methods Mol Biol. 1797, 393-401 (2018).
  26. Gibert, Y., McGee, S. L., Ward, A. C. Metabolic profile analysis of zebrafish embryos. J Vis Exp. (71), e4300(2013).
  27. Trampel, K. A., et al. Seahorse metabolic analysis for human and mouse cardiac organotypic slices. bioRxiv. , (2025).
  28. Ruggiero, G., et al. A balanced circadian glycolytic rhythm drives cardiomyocyte cell cycle progression during fish heart regeneration. bioRxiv. , (2025).
  29. Lee, L., et al. Functional assessment of cardiac responses of adult zebrafish (Danio rerio) to acute and chronic temperature change using high-resolution echocardiography. PLoS One. 11 (1), e0145163(2016).
  30. Shaftoe, J. B., Geddes-McAlister, J., Gillis, T. E. Integrated cellular response of the zebrafish (Danio rerio) heart to temperature change. J Exp Biol. 227 (20), jeb247522(2024).
  31. Ryan, R., Moyse, B. R., Richardson, R. J. Zebrafish cardiac regeneration—looking beyond cardiomyocytes to a complex microenvironment. Histochem Cell Biol. 154 (5), 533-548 (2020).
  32. Angelini, A., Pi, X., Xie, L. Evaluation of long-chain fatty acid respiration in neonatal mouse cardiomyocytes using SeaHorse instrument. STAR Protoc. 3 (2), 101392(2022).
  33. Ludikhuize, M. C., Meerlo, M., Burgering, B. M. T., Rodríguez Colman, M. J. Protocol to profile the bioenergetics of organoids using Seahorse. STAR Protoc. 2 (1), 100386(2021).
  34. Neary, M. T., et al. Hypoxia signaling controls postnatal changes in cardiac mitochondrial morphology and function. J Mol Cell Cardiol. 74 (100), 340-352 (2014).
  35. Cheng, Y. Y., et al. Metabolic changes associated with cardiomyocyte dedifferentiation enable adult mammalian cardiac regeneration. Circulation. 146 (25), 1950-1967 (2022).
  36. Li, X., et al. Inhibition of fatty acid oxidation enables heart regeneration in adult mice. Nature. 622 (7983), 619-626 (2023).
  37. Mookerjee, S. A., Goncalves, R. L. S., Gerencser, A. A., Nicholls, D. G., Brand, M. D. The contributions of respiration and glycolysis to extracellular acid production. Biochim Biophys Acta. 1847 (2), 171-181 (2015).
  38. Mookerjee, S. A., Brand, M. D. Measurement and analysis of extracellular acid production to determine glycolytic rate. J Vis Exp. (106), e53464(2015).

Herprints en machtigingen

Trefwoorden

Hartregeneratie bij zebravisSeahorse assayoxidatief metabolismeglycolysezuurstofconsumptiesnelheidextracellulaire verzuringssnelheidredifferentiatie van cardiomyocytenhartmetabolisme
Beoordeling van de metabole activiteit van hele regenererende zebravisventrikels ex vivo met behulp van een extracellulaire fluxassay
Neem contact met ons op
Aanbevelen aan bibliotheek

Privacy

Gebruiksvoorwaarden

Beleid

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Alle rechten voorbehouden.