Gebruik van oplossings-NMR om biomoleculaire condensaten onder bifasische omstandigheden te karakteriseren

Samenvatting

Hier presenteren we protocollen voor NMR-methodologieën, REstricted DIFfusion of INvisible speciEs (REDIFINE) en CONdensate DEtectioN door SEmi-solid Magnetization Transfer (CONDENSE-MT), die labelvrije, kwantitatieve karakterisering van biomoleculaire condensaten onder biphasische omstandigheden mogelijk maken, waarmee moleculaire verdeling, uitwisselingsdynamiek, condensaathydratatie en druppelstructuur zonder sedimentatie of labeling aan het licht komen.

Samenvatting

Biomoleculaire condensaten die worden gevormd door vloeistof-vloeistof fase-scheiding (LLPS) organiseren de intracellulaire omgeving en reguleren diverse biochemische processen. Ondanks hun belang blijft het onderzoeken van condensaatsamenstelling, uitwisselingsdynamiek en interne organisatie uitdagend, vooral zonder externe tags. Kernmagnetische resonantie (NMR) spectroscopie kan een uniek labelvrij venster bieden in deze mesoschaalassemblages, waarbij zowel moleculaire beweging als omgevings-heterogeniteit worden vastgelegd. Twee complementaire NMR-methodologieën maken een uitgebreide karakterisering van condensaten direct binnen hun bifasische toestand mogelijk. Voor condensaten die dynamisch genoeg zijn om met NMR waarneembaar te zijn, maakt de diffusie-uitwisselingsbenadering, REstricted DIffusion of INvisible speciEs, afgekort als REDIFINE, gebruik van het diffusiecontrast met chemische uitwisseling om het aandeel moleculen te kwantificeren dat verdeeld is tussen gecondenseerde en verdunde fasen, druppelgrootte en interfacepermeabiliteit te bepalen, en moleculaire uitwisselingssnelheden over de fasegrens te extraheren. Voor meer stijve condensaten die NMR-onzichtbaar zijn, maakt de water-detectieve semi-vaste magnetisatie-overdrachtsmethode, CONdensate DEtectioN via SEmi-solid Magnetization Transfer, of kortweg CONDENSE-MT, gebruik van het relaxatiecontrast en protonuitwisseling tussen gecondenseerde biomoleculen en verdunde faseoplosmiddel om condensaten op de bulkwaterprotonen te monitoren, waardoor toegang wordt tot relatieve verdeling, moleculaire tumblingsnelheden, hydratatiedynamiek en gebonden waterinhoud. Samen leveren deze benaderingen een multidimensionaal, kwantitatief beeld van condensaatstructuur en -dynamiek onder bijna-native biphasische omstandigheden zonder fluorescentie- of detectietags. Hun integratie breidt de NMR-toolbox uit voor het bestuderen van biomoleculaire fase-scheiding en legt een basis voor het verbinden van fysisch-chemische eigenschappen van condensaat met hun biologische functie en pathologische misregulatie.

Inleiding

Cellen bereiken hun buitengewone ruimtelijke en temporele organisatie door biochemische reacties^te compartimentaliseren ^1,2,3. Naast membraangebonden organellen vinden veel cruciale cellulaire processen plaats binnen membraanloze compartimenten die worden gevormd door vloeistof-vloeistof fasescheiding (LLPS) van eiwitten en nucleïnezuren⁴. Deze dynamische assemblages, vaak biomoleculaire condensaten genoemd, omvatten de nucleolus, stresskorrels, nucleaire speckles en verwerkingslichamen, die essentiële rollen spelen in bijvoorbeeld RNA-metabolisme, transcriptieregulatie of signaaltransductie ^5,6. Hun vermogen om componenten te vormen, op te lossen en uit te wisselen als reactie op omgevingssignalen biedt cellen een veelzijdig mechanisme om biochemische activiteiten te organiseren zonder afhankelijk te zijn van lipidemembranen.

Een grote subset van biomoleculaire condensaten ontstaat uit RNA-bindende eiwitten (RBP's) die intrinsiek ongeordende regio's (IDR's) en RNA-bindende domeinen (RBD's⁾ bevatten^. Deze eiwitten kunnen afzonderlijk of in een complex met RNA faseren, wat condensaten met diverse materiaaleigenschappen en biologische functies oplevert. Zo vormt het SARS-CoV-2 nucleocapside-eiwit (N) RNA-afhankelijke biomoleculaire condensaten⁹ die betrokken zijn bij het verpakken en assembleren van virale genoomen, terwijl het polypyrimidine-tractiebindende eiwit 1 (PTBP1) nucleaire condensaten vormt die bijdragen aan gen-silencing¹⁰. Bovendien ondergaan eiwitten zoals FUS en DDX4 LLPS die worden aangedreven door hun ongeordende gebieden, wat de RNA-metabolisme en stressgranulaatvorming^{beïnvloedt 11,12}. Dysregulatie van deze processen wordt in verband gebracht met neurodegeneratieve ziekten zoals amyotrofische laterale sclerose (ALS) en frontotemporale dementie, waarbij afwijkende faseovergangen kunnen leiden tot aggregatie en functieverlies¹³.

Condensatie is niet beperkt tot eiwitten en eiwit-RNA-complexen. RNA alleen kan LLPS ondergaan, vooral in de context van herhaalde-expansiesequenties geassocieerd met verschillende neurodegeneratieve aandoeningen^14,15. Trinucleotide- en hexanucleotide-herhalingsuitbreidingen, zoals CAG bij de ziekte van Huntington of CUG bij myotonische dystrofie, kunnen druppelachtige condensaten vormen, zowel in vitro als in cellen¹⁴. Het begrijpen van de fysieke basis van RNA-condensatie, evenals hoe deze verschilt van eiwit- en eiwit-RNA-gedreven condensaten, is cruciaal om de moleculaire mechanismen achter herhaalde expansieziekten te verduidelijken.

Ondanks hun biologische belang blijft de kwantitatieve en labelvrije karakterisering van biomoleculaire condensaten een formidabele uitdaging¹⁶. Conventionele fluorescentiemicroscopie- en spectroscopietechnieken zijn afhankelijk van externe labels, die de structuur, dynamiek of fasegedrag van het biomolecuul kunnen verstoren^17,18. Bovendien zijn sommige condensaten NMR-onzichtbaar vanwege beperkte moleculaire beweging en brede lijnvormen, waardoor de informatie die via traditionele NMR-benaderingen toegankelijk is, wordt beperkt. Daarom is er een dringende behoefte aan experimentele strategieën die condensaten direct in hun bifasische, inheemse toestand kunnen onderzoeken, zonder labeling. Gezien de belangrijke rol van de druppelfasegrens in uitwisselingsprocessen en condensaatrijping, is het even belangrijk om biomoleculaire druppels binnen een gegeven monstervolume te stabiliseren, zodat sedimentatie van de dichte fase wordt voorkomen. Dit kan gemakkelijk worden bereikt met behulp van de cytoskelet-nabootsende agarosehydrogels.

Recente ontwikkelingen in op NMR gebaseerde methodologieën bieden zo'n oplossing. De REDIFINE (REstricted DIffusion of INvisible speciEs) benadering¹⁹ combineert diffusie-NMR met chemische uitwisselingsanalyse om moleculaire verdeling, uitwisselingskinetiek en druppelgrootte in eiwit- en eiwit–RNA-condensaten te kwantificeren. Complementair detecteert de CONDENSE-MT (CONdensate DEtectioN by SEmi-solid Magnetization Transfer) techniek²⁰ NMR-onzichtbare condensaten via watermagnetisatieoverdracht, waardoor de hoeveelheid gecondenseerde materie onder bepaalde omstandigheden gekwantificeerd kan worden en hydratatiedynamiek en moleculaire tumblingssnelheden binnen het condensaat verder zichtbaar wordt. Samen maken deze methoden labelvrije, niet-invasieve onderzoeken mogelijk van diverse condensaattypes, eiwit-alleen, eiwit-RNA en RNA-only condensaten onder evenwichtsbifasische omstandigheden. Door de NMR-toolbox uit te breiden, openen zij de deur naar systematische, kwantitatieve verkenning van condensaatstructuur, dynamiek en hun verbanden met biologische functie en ziekte.

Protocol

1. Monstervoorbereiding

1. Bufferkeuze: Gebruik geteste buffers waarin de biomoleculen het meest stabiel zijn.
   OPMERKING: NMR-signalen zijn doorgaans sterker bij een lagere pH. Voeg als technische eis 5% D₂O toe als veldvergrendeling aan alle NMR-monsters (definitieve v/v).
2. Stabiliseer het biphasische monster met behulp van een cytoskelet-nabootsende agarosehydrogel als medium. Weeg agarosepoeder om een agarosevoorraad van 1,5% (met v) in dezelfde buffer te bereiden. Gebruik gewone agarose als een goedkoper alternatief voor biomoleculaire condensaten die gevormd zijn door intrinsiek geordende eiwitten (IDP's) en RNA's die hogere temperaturen kunnen weerstaan. Gebruik laagsmeltende agarose bij het bereiden van kwetsbare condensaten met eiwitten die gevouwen domeinen^{bevatten 19}.
3. Bereiding van agarose-bouillon: Verhit de suspensie tot ca. 80 °C gedurende 10 minuten en los de agarose volledig op door te mengen of te vortexen.
   VOORZICHTIG: Gesmolten agarose is heet en kan branden; Hanteer met hittebestendige handschoenen.
   OPMERKING: Houd de gesmolten agarose warm (bijvoorbeeld 55 °C voor gewone agarose en 37 °C voor laagsmeltende agarose) in een waterbad om vloeibaar te blijven voordat het met het biologische monster wordt gemengd.
   Gesmolten agarose kan enkele tientallen^{minuten warm} worden gehouden^.
4. Bereid het definitieve bifasische monster voor:
   1. Om een bifasisch monster te bereiden, gestabiliseerd door agarosehydrogel, mengt u eiwit- (en/of RNA-)voorraden met de bijbehorende warme agarosebuffer in een microcentrifugebuis van 1,5 ml.
      OPMERKING: De uiteindelijke eiwit/RNA-concentratie is doorgaans 50-500 μM om geschikt te zijn voor NMR-detectie.
   2. Breng het mengsel onmiddellijk over in een 3 mm NMR-buis met een lange glazen pipet. Laat agarose kort na de overdracht vastharden.
      OPMERKING: Zonder agarose sedimenteert het bifasische monster in de loop van de tijd, wat het verzamelen en analyseren van NMR-gegevens bemoeilijkt omdat het monster fysiek verandert op de tijdschaal van het experiment.
5. Voer visuele inspectie uit: Inspecteer het monster visueel. Als er fase-scheiding optreedt, lijkt het monster onmiddellijk troebel en blijft het zo. Dit geeft aan dat het biphasische monster succesvol is gestabiliseerd in agarose.
6. Wanneer je van plan bent CONDENSE-MT uit te voeren, bereid dan een extra agarosereferentiemonster voor door dezelfde stappen te doen, alleen zonder het toevoegen van het biomolecuul. Voeg in plaats daarvan de buffer toe om hetzelfde samplevolume te krijgen. Bereid dit monster pas voor nadat het condensaatmonster is voorbereid en alle gegevens erop is gemeten om te garanderen dat het agarosereferentiemonster niet langer wordt geïncubeerd.

2. Het opnemen van REDIFINE-experimenten

1. Vergrendel, shim, match en stem het 1H-kanaal af zoals gewoonlijk. Kalibreer de 90° pulslengte op ¹uur met je algemene procedure.
2. Neem een 1D wateronderdrukt spectrum op. Idealiter wordt een sterk biomoleculair signaal waargenomen (aanvullende figuur 1A).
   1. Als er geen of zeer weinig signaal wordt waargenomen, ga er dan van uit dat het gecondenseerde eiwit/RNA niet NMR-waarneembaar is en dat de verdeling in de gecondenseerde fase hoog is. In dit geval moet je niet verder gaan met REDIFINE, omdat deze methodologie gebaseerd is op een waarneembaar biomoleculair signaal.
   2. In deze situatie zouden CONDENSE-MT-experimenten in principe zeer goed moeten werken, dus ga direct over naar stap 4 (CONDENSE-MT-experimenten opnemen).
3. Laad het conventionele Diffusion Ordered Spectroscopy (DOSY) experiment dat vertrouwt op een conventionele 2D Stimulated-Echo procedure met behulp van bipolaire gradiënten (Bruker pulse sequence: stebpgp1s19). Raadpleeg de gebruikershandleidingen van Bruker DOSY en Diffusion voor meer details.
4. Stel P0, P1 en P27 in op de gekalibreerde pulslengte van 90°. Als vuistregel stel NS op 32 scans, DS op 16, TD1 op 16, en pas TD2 en SW2 aan om een acquisitietijd van 80-100 ms te geven. Stel d1 in op 1,5 s.
   OPMERKING: Gradiënten moeten correct gekalibreerd zijn.
5. Optimaliseer de Watergate d19-vertraging zoals gewoonlijk volgens je magnetisch veld, om maximale excitatie te verkrijgen bij aromatische (ca. 7 ppm) of alifatische (ca. 1 ppm). Stel d20 in op 75 ms. De keuze van p30 hangt af van de eiwit-/RNA-grootte. Voor eiwitten >20 kDa, gebruik 5 ms; Voor kleinere eiwitten gebruik je 3,5 ms als vuistregel.
6. Neem een DOSY-experiment op met het commando: 'xau dosy 2 95 16 l y y', waarin de sterkte van de diffusiegradiënt in 16 stappen lineair wordt gerangschikt van 2 tot 95%.
   1. Idealiter moet men de initiële afname van het signaal vanuit de verdunde fase waarnemen, terwijl het afnemen van het condensatiefase het plateau zou moeten bereiken (Figuur 1A en Aanvullende Figuur 1B).
7. Om verder data te verzamelen voor de volledige REDIFINE-set, maak je 9 nieuwe stebpgp1s19 aan door de parameters van de eerste die je net hebt uitgevoerd te kopiëren. In elk opeenvolgend experiment wordt alleen de d20-diffusievertraging in variabele stappen gewijzigd om het bereik van 100–1000 ms te overbruggen (d.w.z. 100, 150, 200, 250, 300, 400, 500, 700, 1.000 ms).
8. Voer elk van deze experimenten uit met het commando 'xau dosy 2 95 16 l y n'. De laatste "n" zorgt ervoor dat de ontvangerversterking gedurende de 10 experimenten behouden blijft.

3. Het verwerken van REDIFINE-datasets en het visualiseren van de resultaten

1. Verwerk elk experiment (in totaal 10) op de volgende manier:
   1. Stel qsine van SSB 2 in als vensterfunctie, haal de^5e snede uit met qsin; fp, fase de 1D en sla de faserparameters op in de 2D-dataset.
   2. Verwerk vervolgens 2D met xf2, doe basislijncorrectie abs2, en extraheer deze 16 slices met split2D (verdere invoer in het pop-up venster: r – 16 – 11). Dit zal 16 spectra die met verschillende gradiëntsterktes zijn verkregen extraheren en deze opslaan als 1D-verwerkte experimenten van 11 tot 26 binnen dezelfde dataset.
   3. Herhaal hetzelfde voor de resterende 9 experimenten. Soms is het cruciaal om ten minste de eerste 4-5 plakken te controleren om te controleren of de fasing en baselinecorrectie correct zijn. Indien nodig, corrigeer handmatig – goede fasering en baseline zijn voorwaarden voor een juiste kwantificering (Figuur 1B).
2. Gebruik de verstrekte Matlab-code LLPS_REDIFINE_fit voor de analyse (Aanvullende Figuur 2A). In de code pas je het volgende aan volgens je experimenten: 'Delta' (diffusie maal d20), 'P.d' (totale gradiëntduur 2*p30), exp(1,:) tot exp(10,:) gebaseerd op het # aantal experimenten dat je hebt uitgevoerd. Stel vervolgens P.g in volgens de gradiëntsterktes van je probe (toegankelijk in de TopSpin-experimentmap onder het bestand "difflist").
3. Pas de 'map' en het 'pad' aan op basis van je gegevenslocatie. Voer de code uit tot regel 40. Dit geeft je de 1D-slice – vanaf hier kies je de integratieregio's; Deze moeten aromatische of alifatische stoffen omvatten en het gebied zo smal mogelijk kiezen, zonder rekening te houden met verschillende moleculaire groepen zoals amiden.
4. Voer de integratiegrenzen in punten in variabelen 'links' en 'rechts' dienovereenkomstig in (aanvullende figuur 2A). Dit is bedoeld om de gegevens te integreren voor de kwantitatieve analyse (Figuur 1C). Kies de matrixnaam op basis van je monster, de datum van de uitvoering en enkele experimentele details.
5. Voer de hele code uit. In 'fit0' kun je de startparameters kiezen die de optimalisatiefunctie gebruikt om de minimalisatie te starten. Begin met de standaardwaarden en als convergentie niet wordt bereikt, verander dan de tweede fit0-waarde (populatie in de gecondenseerde fase) in stappen van 0,1 van 0,1 naar 1.
   OPMERKING: Soms heeft de dataset meerdere lokale minima, en moet men de startparameters uitgebreid variëren om te kunnen convergeren naar het meer globale minimum.
6. Wanneer een bevredigende passing is bereikt, worden de passende waarden in de figuur (Figuur 1D en Aanvullende Figuur 2B) geschreven en kunnen ze worden geraadpleegd in de variabele 'fit'. Plot deze parameters verder als een statistische grafiek voor betere visualisatie.

4. Het opnemen van CONDENSE-MT-experimenten

OPMERKING: Het doel van het experiment is om de condensaten indirect te detecteren door hun observatie op het oplosmiddelwatersignaal via protonenuitwisseling²⁰. In het CONDENSE-MT-experiment wordt een vingerafdruk-MT-profiel verkregen en geanalyseerd (Figuur 2A)²⁰.

1. Neem je favoriete 1D wateronderdrukte spectrum op. Als er zeer weinig signaal wordt waargenomen, is het zeer waarschijnlijk dat het CONDENSE-MT-experiment zeer goed zal werken.
2. Kwantitatieve CONDENSE-MT-analyse vereist voorafgaande bepaling van de R1-snelheid van water. Bepaal de_R1-snelheid via T 1-inversieherstel. Kopieer de meegeleverde pulsvolgorde, Bruker parameter set en de vd-lijst naar de respectievelijke mappen. Laad de parameterset "T1_inversion_recovery" en pas de vermogens en frequenties aan op je NMR-spectrometer (volgens "edprosol").
   1. Kalibreer de 1H 90° puls (p1), stel NS in op 2, DS op 0, d1 op 20 s, SW op 10 ppm, TD2 op 16k en TD1 op 24 (van de lengte van je aangepaste vd-lijst). Schakel een zwakke gradiënt langs Z in (GPZ0 = 0,1 %) om stralingsdempingseffecten te voorkomen.
3. Voor het CONDENSE-MT-experiment,
   1. Kopieer de meegeleverde Bruker-parameterset, volgorde en frequentielijst naar de Bruker-specifieke mappen, laad de parameterset "CONDENSE-MT" en pas de frequenties en vermogens aan volgens je spectrometer.
   2. Stel P1 in op de gekalibreerde pulslengte van 90° en P4 op 1 μs voor de excitatiepuls om stralingsdemping te voorkomen. Stel NS in op 2, DS op 16, d1 op 4 s, SW2 op 20 ppm, TD2 op 8k, TD1 op de lengte van de frequentielijst (meestal 46). Stel SPNAM10 in op Squa100.1000 en de duur p10 op 5 s.
   3. Zoek het vermogen van de SP10 om 100 Hz bestraling te leveren (het commando 'pulse 100 Hz' berekent je vermogen in zowel watt als dB). Pas de SP10-kracht van de irstralingspuls dienovereenkomstig aan en voer dit pseudo-2D-experiment uit met het commando 'zg'.
      OPMERKING: Het experiment zal de meegeleverde frequentielijst gebruiken die de irstralingsoffsets bestrijkt van on-resonantie met water tot zeer ver afwijkende resonantie (100000 Hz) om het watersignaal bij verschillende irstralingsoffsets te detecteren (Figuur 2B). Een grafiek van waterintegralen (zorg voor correcte fasering van de spectra; Figuur 2C) ten opzichte van de irstralingsoffset levert het CONDENSE-MT-profiel op dat in Figuur 2A wordt weergegeven.
4. Maak 7 nieuwe experimenten en verhoog in elk opeenvolgend experiment alleen het vermogen van bestraling om het bereik van 170 Hz tot 1000 Hz te bestrijken (d.w.z. 170, 250, 330, 500, 650, 780, 1.000 Hz). Gebruik in elk experiment het commando van het vorige punt. Voor elke verzadigingskracht wordt de volledige offsetlijst verkregen (Figuur 2D).
   OPMERKING: CONDENSE-MT-fitting vereist de referentiegegevens die zijn verkregen op het agarose-only monster (medium zonder biomoleculaire condensaten). Zorg voor hetzelfde tijdsinterval tussen monstervoorbereiding en gegevensverzameling, en verkrijg dezelfde dataset van 8 experimenten op een agarose-referentiemonster. Dit is om ervoor te zorgen dat zowel de agarosereferentie als het bifasische monster even lang zijn geïncubeerd.

5. Het verwerken van CONDENSE-MT-datasets en het visualiseren van de resultaten

1. Verwerk elk CONDENSE-MT-experiment (in totaal 8, aanvullende figuur 3A) op de volgende manier.
   1. Stel qsine van SSB 2 als vensterfunctie, haal de^46e slice uit met qsin; fp, de waterpiek in 1D te faseren, en de faseparameters op te slaan in de 2D-dataset, vervolgens 2D te verwerken met xf2, en deze 46 slices te extraheren met split2D (verdere invoer in het pop-up venster: r – 46 – 11).
      OPMERKING: Dit zal 46 1D-spectra extraheren die met verschillende irstralingsoffset zijn verkregen en deze opslaan als 1D-verwerkte experimenten van 11 tot 56 binnen dezelfde dataset (aanvullende figuur 3A, getoond voor het 1000 Hz CONDENSE-MT-experiment).
   2. Herhaal hetzelfde voor de overige 7 experimenten. Controleer verschillende sneden van elk experiment om te controleren of de fasing en baseline correct zijn (Figuur 2C). Corrigeer indien nodig handmatig – goede fasering en baseline zijn voorwaarden voor een juiste kwantificatie!
2. Herhaal dezelfde stappen op gegevens verkregen met agarose-referentiemonster en voor de inversieherstelexperimenten, waarbij de 24e schijf wordt geëxtraheerd voor fasering en split2D gebruikt (r – 24 – 11).
3. Pas de verkregen data aan met behulp van de verstrekte Matlab-code. Volg de specifieke instructies in het script.
4. Voer eerst de fitting-analyse uit voor het agarose-referentiemonster om de achtergrondparameters te verkrijgen bij afwezigheid van condensaten. De read_CONDENSE_MT_data-code leest eerst de verwerkte NMR-gegevens en integreert het waterresonantiesignaal in de 1D-slices die door het split2D-commando worden gegenereerd (Aanvullende Figuur 3B).
5. Stel de integratiegrenzen individueel vast; een referentie 1D-spectrum zal in Matlab worden uitgezet om de integratiegrenzen te beoordelen (Aanvullende Figuur 3C). De code zal de data verder normaliseren en de genormaliseerde integralen van water als functie van de bestralingsoffset en het vermogen aanpassen aan het CONDENSE-MT model²⁰. De read_CONDENSE_MT_data slaat de genormaliseerde integralen op in de variabele integral_water_real_all, die vervolgens wordt gebruikt voor de volgende fitting.
6. Bepaal de_{R1-relaxatiesnelheid} van water in aanwezigheid van agarose of condensaten voordat de CONDENSE-MT-gegevens worden aangepast.
   OPMERKING: Het aanpassen van het waterinversieherstelexperiment kan worden uitgevoerd binnen het eerste deel van het CONDENSE-MT_full Matlab-script (of het CONDENSE_MT_referenceMTpool script in het geval van de agarose-referentiegegevens). De bestandsnaam en het pad van het experiment, evenals de experiment-ID van het experiment, kunnen worden ingevoerd om het Inversion_Recovery Matlab-script uit te voeren (Aanvullende Figuur 4A, sectie 1). Indien nodig kunnen het aantal 1D-sneden en de integratiegrenzen in dit script worden aangepast; de laatste hangt af van de verwerkingsparameters die in TopSpin worden gebruikt. Deze sectie bepaalt de R1-snelheid van water en slaat deze op in de P.R1w-variabele , die vereist is voor het volgende passen van de CONDENSE-MT-gegevens.
7. Voor agarose-gegevens gebruik je de genormaliseerde integralen direct voor passen, met het CONDENSE_MT_referenceMTpool-script (dat de function_1MT-functie aanroept).
8. Voor condensaatkwantificatie gebruik je de aangepaste parameters van agarose als invoer voor de globale fitting van de gegevens die op het gecondenseerde monster zijn verkregen (Aanvullende Figuur 4A). Dit zal de fysieke eigenschappen van het agarose-meshwork vastleggen als constante waarden aan de fit, waardoor kwantificering mogelijk is van het condensaatgemedieerde, extra effect van een condensaat dat in het agarose-meshwork is ingebed (Figuur 2E).
9. Doe de condensaatkwantificatie met het CONDENSE-MT_full script, dat de function_2MT Matlab-functie aanroept. De startparameters voor computationele optimalisatie worden gegeven via fit0 (Aanvullende Figuur 4B). De parameteronzekerheid van de fit wordt berekend met de Jacobiaanse matrix waaruit de variantie-covariantiematrix wordt afgeleid (aanvullende figuur 4B).
10. Beoordeel de kwaliteit van de fit aan de hand van de fitdeviatie, vergelijkbaar met de residuele afwijking van modelvoorspelling uit experimentele data. Voor verdere kwaliteitscontrole zet de passing samen met experimentele gegevens (Aanvullende Figuur 4C).

Resultaten

Het hier beschreven LLPS REDIFINE-protocol werd toegepast op het FUS N-terminal domein (NTD). FUS NTD scheidt gemakkelijk af onder omgevingsomstandigheden bij micromolaire concentraties^19,21. Dit specifieke monster werd bereid bij een concentratie van 200 μM in een 30 mM HEPES-buffer met 200 mM KCl bij pH 7,5, met 0,5% gewone agarose. Bij fasescheiding blijven FUS NTD-signalen waarneembaar in de gecondenseerde fase (Figuur 1A,B). Dit maakt het een perfecte kandidaat voor LLPS REDIFINE om te bestuderen. Namelijk, de meeste LLPS-gevoelige eiwitten bevatten lange, intrinsiek ongeordende gebieden die meestal waarneembaar blijven in de gecondenseerde fase; bij meer gestructureerde eiwitten is dit echter niet het geval.

De REDIFINE-fit (Figuur 1D en Figuur 3A,B) toonde meerdere unieke parameters voor dit FUS NTD-monster. Specifiek bepaalde het de diffusiecoëfficiënten in de verdunde en gecondenseerde fase (D_dil en D_cond), populatie van eiwit in de gecondenseerde fase (ν_cond), gemiddelde druppelgrootte R en interfasepermeabiliteit p. Druppelgrootte en permeabiliteit definiëren de interfasewisselingssnelheid van de gecondenseerde naar de verdunde fase k_cd=3p/R, waardoor we informatie kunnen verkrijgen over uitwisselingsdynamica¹⁹.

Deze resultaten kunnen op verschillende manieren worden weergegeven (Figuur 3B). Met behulp van een spinnenplot kon men resultaten vergelijken over verschillende omstandigheden of monsters. Aan de andere kant kan men de REDIFINE-parameters in het model beeldend weergeven om ze het meest effectief te visualiseren. Let op: REDIFINE levert al deze resultaten labelvrij in slechts een paar uur met slechts één monster.

Aangezien het NMR-signaal van FUS NTD detecteerbaar blijft in de gecondenseerde fase (Figuur 3C), zal CONDENSE-MT waarschijnlijk niet toepasbaar zijn vanwege het ontbreken van relaxatiecontrast. We hebben de CONDENSE-MT dataset opgenomen op FUS NTD, en er wordt inderdaad geen verschil waargenomen in het MT-profiel tussen de agarosereferentie en het fus NTD biphasische monster (Figuur 3C). Hierdoor is de CONDENSE-MT-methodologie niet toepasbaar op dit specifieke FUS NTD-monster.

De CONDENSE-MT biedt echter een dynamische karakterisering van herhalende expansie-RNA-condensaten (Figuur 3C,D)²⁰. Let op dat CONDENSE-MT meerdere parameters kan bieden die het RNA uniek karakteriseren in de gecondenseerde fase (Figuur 3D), ondanks het feit dat het signaal niet waarneembaar is in conventionele NMR (Figuur 3C). De verkregen parameters zijn de protonenuitwisselingskinetiek tussen condensaat en bulkwater (k_{condensaat, H2O} en k_{H2O, condensaat}), de T₂ relaxatiesnelheid voor het condensaat (T_{2, condensaat}), die de mate van dynamische arrestatie van de biomoleculen bij condensatie weerspiegelt, en de schijnbare_R2-snelheid van bulkwater (R_{2, water}). Deze laatste parameter is een lineaire combinatie van de tumblingsnelheid van bulk, verdund water en langzaam tumbling, gecondenseerd water. Hogere_{R2-waterwaarden} duiden op een hogere waterpopulatie in het condensaat, wat het ogenschijnlijke totale_{R2-waterpercentage} ^{met 20} verhoogt (Figuur 2E en Figuur 3D).

BESCHIKBAARHEID VAN DATA EN CODE

LLPS REDIFINE ruwe data en verwerkingscodes zijn beschikbaar in de Zenodo-repository: https://doi.org/10.5281/zenodo.15228787 . CONDENSE-MT ruwe data en verwerkingscodes zijn https://doi.org/10.5281/zenodo.15789697 in de Zenodo repository gedeponeerd. MATLAB is vereist voor de verwerking. Ze worden ook opgenomen in dit artikel (Aanvullende Codeerbestanden).

Figuur 1: REDIFINE-workflow. (A) Diffusiemetingen leveren complexe bifasische diffusievervalcurves op in gecondenseerde monsters. Het resulterende verval bevat gedeconvolveerde parameters die de diffusiecoëfficiënten van de soorten in de gecondenseerde en verdundde fase beschrijven, hun populaties, druppelgrootte en uitwisselingssnelheid tussen de fasen. (B) Om deze geïsoleerde parameters te decoderen, moet men een pseudo-3D-dataset vastleggen door niet alleen de gradiëntsterkte, maar ook de diffusievertragingen te variëren. Het is absoluut essentieel voor kwantificatie dat elke snede uit deze metingen correct gefaseerd en gecorrigeerd wordt door de baseline. (C) Na het controleren van de kwaliteit van de gemeten en verwerkte gegevens worden deze 1D-slices ingevoerd in de MATLAB-code voor analyse en definitieve plotten. (D) De gegevens worden vervolgens aangepast door een niet-lineaire programmeeroplosser. De fitting en resulterende parameters worden geïllustreerd voor het biphasische FUS NTD-monster. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 2: CONDENSE-MT workflow (A) Een uniek CONDENSE-MT-profiel waargenomen op de waterresonantie dat de verbreding door de aanwezigheid van gecondenseerde biomoleculen en water illustreert. (B) Water wordt geobserveerd bij elke bestralingsverschuiving. (C) Voor kwantificering is het essentieel dat alle spectra correct worden gefaseerd. (D) Na het verkrijgen van de waterresonantie bij verschillende bestralingsoffsets, wordt het experiment herhaald bij verschillende bestralingsvermogens. Dit levert een dataset op van het relatieve watersignaal als functie van zowel de irradiatieoffset als het bestralingsvermogen (E). De gegevens worden vervolgens aangepast door een niet-lineaire programmeeroplossing. De fitting en resulterende parameters worden geïllustreerd voor het biphasische 31xCAG RNA-monster. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 3: Presentatie van REDIFINE- en CONDENSE MT-resultaten. (A) Spiderplotweergave van REDIFINE-parameters voor vergelijkende analyse over monsters of omstandigheden. (B) Schematisch model dat REDIFINE-afgeleide parameters illustreert, waaronder diffusiecoëfficiënten, druppelstraal, partitatie en wisselkoers tussen de fasen. (C) Vergelijking van CONDENSE-MT-profielen verkregen voor agarosereferentie en biphasische FUS NTD in agarose bij 500 Hz bestraling.
(D) CONDENSE-MT-analyse van 31xCAG repeat-expansie RNA-condensaten die parameterextractie en visualisatie van condensaat-geassocieerde magnetisatieoverdrachtseffecten tonen. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Aanvullende figuur 1: REDIFINE-opstelling. (A) Het FUS N-terminale domein blijft waarneembaar bij de voorbereiding van het bifasische gecondenseerde monster. Er wordt een sterk amide/amino- en aromatisch protonsignaal waargenomen. (B) De signaalafname waargenomen in het diffusie-DOSY-experiment illustreert een snellere verval van de verdunde fase eiwitpopulatie en langzamere afneming van het eiwit in de gecondenseerde fase. Klik hier om dit bestand te downloaden.

Aanvullende Figuur 2: REDIFINE-verwerking. (A) Matlab-code gebruikt voor REDIFINE-fitting, met gemarkeerde parameters waar de specifieke invoer nodig is. De inset illustreert hoe men het integratiegebied kiest. (B) Minimalisatie van de fittingfunctie en de daaruit voortvloeiende resultaten. Klik hier om dit bestand te downloaden.

Aanvullende figuur 3: CONDENSE-MT opstelling. (A) Overzicht van de NMR-experimenten die nodig zijn voor CONDENSE-MT-analyse, inclusief het waterinversie-terugwinningsexperiment (expno. 5) en de CONDENSE-MT-experimenten bij verschillende bestralingsvermogens (expno 11-18). (B), (C) Overzicht van het Matlab-script voor het lezen en integreren van de water 1D-spectra voor CONDENSE-MT datasets. De CONDENSE-MT-experimenten worden gegeven als hoofd – hoofd8. De integratiegrenzen worden ingevoerd als water_left en water_right. Klik hier om dit bestand te downloaden.

Aanvullende Figuur 4: CONDENSE-MT verwerking. (A) Eerste sectie van het CONDENSE-MT fittingscript, dat waterinversieherstelfitting (sectie 1) en invoer van de eerder bepaalde agarose-achtergrondparameters bevat. (B) Fitting en parameteronzekerheidsbepaling van CONDENSE-MT datasets. Startparameters voor de fit kunnen binnen fit0 worden ingesteld. (C) Het plotten van het gedeelte van het CONDENSE-MT fittingresultaat. Klik hier om dit bestand te downloaden.

Aanvullende codeerbestanden: MATLAB-scripts voor REDIFINE- en CONDENSE-MT-analyse. Bruker Topspin codeert om het CONDENSE-MT-experiment op te zetten en MATLAB-scripts die worden gebruikt voor het verwerken en passen van REDIFINE diffusiedatasets en CONDENSE-MT magnetisatie-overdrachtdatasets, inclusief data-integratie, relaxatie-analyse en routines voor het aanpassen van globale modellen. MATLAB is verplicht om de scripts uit te voeren. Klik hier om dit bestand te downloaden.

Discussie

Hier presenteerden we gedetailleerde protocollen voor labelvrije, NMR-karakterisering van biphasische biomoleculaire condensaten. Deze omvatten de twee opkomende methodologieën, LLPS REDIFINE en een complementair, maar orthogonaal, experiment genaamd CONDENSE-MT. Hoewel algemeen toepasbaar, is LLPS REDIFINE afhankelijk van biomoleculaire detectie en vereist het een waarneembaar signaal bij fase-scheiding voor een juiste analyse. Hoewel dit de toepasbaarheid van REDIFINE kan beperken, bevatten de meeste condensaten eiwitten met intrinsiek ongeordende gebieden die meestal met NMR waarneembaar zijn. In het bijzonder voor eiwit:RNA en RNA-only condensaten verbreedt het signaal van biomoleculen in de gecondenseerde fase zich bij fase-scheiding voorbij de detectiegrenzen. Als de partitioncoëfficiënt in de gecondenseerde fase hoog is, wordt er bijna geen signaal waargenomen door conventionele NMR. CONDENSE-MT omzeilt deze detectiebeperking door een watergeobserveerde techniek te zijn die berust op een significant verschil in relaxatie tussen moleculaire stoffen in verdunde en gecondenseerde fasen.

Een juiste monstervoorbereiding is essentieel voor de succesvolle toepassing van zowel REDIFINE als CONDENSE-MT. Het is daarom belangrijk om ervoor te zorgen dat de agarose volledig gesmolten is voordat deze aan het mengsel wordt overgebracht, om uitgebreide vorming van luchtbellen tijdens het transport te voorkomen en voldoende materiaal te leveren om een NMR-buis betrouwbaar te vullen met bifasische mengsels die aanvankelijk aan de glaswand blijven plakken. Voor CONDENSE-MT is het cruciaal om een gegeven volume agarose reproduceerbaar over te dragen, omdat de agaroseachtergrond apart wordt gekwantificeerd. Als de verdeling van biomoleculen tussen gecondenseerde en verdunde fasen sterk scheef is, of als de uitwisseling tussen fasen zeer langzaam of snel verloopt, kunnen REDIFINE- of CONDENSE-MT-effecten afwezig zijn of te zwak voor betrouwbare kwantificering. Dit kan een belangrijke beperking van deze technieken zijn. In zo'n geval kan het verhogen of verlagen van de temperatuur echter helpen, aangezien temperatuur een krachtige modulator is van moleculaire verdeling en chemische uitwisselingssnelheden. Zodra datasets zijn verkregen, worden optimale fitingresultaten vaak iteratief verkregen door de computationele optimalisatie te herhalen met de best-fit parameters van de initiële of vorige fit als invoerwaarden.

Voor systemen die sterke REDIFINE- en CONDENSE-MT-effecten opleveren, kunnen deze experimenten labelvrije inzichten bieden in moleculaire partitionering, wisselkoersen en moleculaire dynamica die moeilijk te bereiken zijn met andere labelvrije methoden. Bovendien zijn NMR-gebaseerde methoden over het algemeen niet-invasief, waardoor monsters meerdere keren kunnen worden geanalyseerd of langdurig kunnen worden opgeslagen, waardoor condensaateigenschappen in de loop van de tijd kunnen worden gemonitord. Dit is vooral interessant in de context van pathologische condensaatrijping van fibrilisatie, wat lastig is om met complementaire methoden over zeer lange perioden te bestuderen.

Aangezien membraanloze cellulaire organellen over het algemeen multicomponent-assemblages zijn met een complexe architectuur, zullen toekomstige toepassingen van deze techniek de detectie en karakterisering van steeds geavanceerdere multicomponent-condensaatmodelsystemen omvatten, evenals condensaatanalyses in een cellulaire context via in-cel NMR. Dit vereist echter aanpassing van REDIFINE of CONDENSE-MT aan zulke complexe systemen, en er worden inspanningen geleverd om dit te bereiken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
700 Mhz Avance NEO NMR spectrometer	Bruker Biospin	https://www.bruker.com/en.html	De gegevens worden verzameld op 700 MHz NMR spectrometer.
Topspin	Bruekr Biospin	https://www.bruker.com/en.html	De gegevens worden verwerkt met deze software.
FUS NTD protein		N/A	Dit eiwit wordt tot expressie gebracht en gezuiverd in ons lab
31xCAG RNA		N/A	RNA wordt geproduceerd en gezuiverd in ons lab
MATLAB	MathWorks	https://www.mathworks.com/products/matlab.html	Gegevens worden verwerkt en gevisualiseerd met deze software.