Engineering van een High-fidelity Preclinical Mouse Model voor Hersenmetastase met behulp van Interlock Pulsatile Injection Technique en Microsurgical Vascular Repair

Samenvatting

Deze studie stelt high-fidelity muismodellen vast van hersenmetastase via tijdelijke intracarotidinjectie van tumorcellen met Interlock pulsatile injectie en microchirurgische reparatie. Het behoudt de cerebrale bloedtoevoer, voorkomt afsluiting van de arteria halsslagader en biedt superieure preklinische modellen met verbeterde tumormetastasesnelheden en verminderde sterfte.

Samenvatting

Hersenmetastasen blijven een verwoestend klinisch probleem. Een grote uitdaging in onderzoek naar hersenmetastasen is het ontbreken van hoogwaardige modellen die het metastatische proces nauwkeurig reproduceren, waardoor mechanistische inzichten mogelijk worden gemaakt in hoe kankercellen zich in de hersenen koloniseren. Traditionele injectiemodellen voor intracarotisarterie-metastase vereisen vaak een permanente ligasie van de arterie carotis (CCA), wat de cerebrale hemodynamica verandert en de integriteit van de bloed-hersenbarrière (BBB) aantast. Het protocol presenteert een verfijnde methode om een high-fidelity muismodel van hersenmetastase op te zetten. De kerninnovatie omvat de Interlock Pulsatile Injection (IPI)-techniek voor tumorceltoediening, gevolgd door microchirurgische arteriële reconstructie op de punctieplaats om de fysiologische bloedstroom in de CCA te herstellen. In vergelijking met het conventionele CCA-ligatiemodel verminderde de IPI–microchirurgische reparatiemethode de perioperatieve sterfte significant (2,86% versus 25,71%) en verhoogde het de mate van vestiging van hersenmetastasen (94,12% versus 65,38%). De IPI-techniek maakt gebruik van een tandemspuitconfiguratie om celinsufficisie tijdens intracarotisinjectie te minimaliseren. Na tumorcelinfusie wordt de CCA zorgvuldig gerepareerd met microchirurgische hechtingen onder een stereomicroscoop, waardoor permanente occlusie wordt vermeden. Dit behoudt de natuurlijke cerebrale hemodynamica en de integriteit van de BBB op het moment van tumorcelinfiltratie, terwijl de operaties aanzienlijk verbeterd en de sterfte wordt verminderd. De gemetastaseerde intracraniële laesies worden gevalideerd door seriële bioluminescentiebeeldvorming en histopathologie. De methode biedt een superieur platform voor het bestuderen van de pathofysiologie van hersenmetastasen en voor preklinische therapeutische evaluatie, waarmee het metastatische proces wordt herhaald.

Inleiding

Hersenmetastasen vormen het meest voorkomende type kwaadaardige hersentumor bij volwassenen en komen ongeveer tien keer vaker voor dan primaire hersentumoren¹. Er wordt geschat dat 10%–20% van de patiënten met systemische kanker hersenmetastasen ontwikkelt tijdens de gevorderde stadia van hun ziekte, wat een van de belangrijkste doodsoorzaken^{is 1,2}. Ondanks aanzienlijke vooruitgang in de behandeling van primaire kankers blijft de prognose voor patiënten met hersenmetastasen slecht. De overlevingskans van patiënten met hersenmetastase is minder dan 20^{% na} één jaar. Het mechanisme van waarom en hoe sommige kankers zich naar de hersenen verspreiden, is onbekend. De therapeutische uitdaging wordt versterkt door de unieke biologie van hersenmetastasen, waaronder de aanwezigheid van de BBB, de specifieke micro-omgeving van het immuunsysteem van de hersenen, en complexe interacties tussen tumorcellen en neurogliale cellen ^4,5.

Zowel farmacodynamisch als pathogeneseonderzoek naar hersenmetastase is sterk afhankelijk van preklinische diermodellen die het ziekteproces bij mensen nauwkeurig weergeven. Huidige diermodellen van hersenmetastase, hoewel veel gebruikt, zijn voornamelijk gebaseerd op intracraniële orthotopische implantatie, intraveneuze of staartveninjectie, intracardiale injectie of intracarotisarterie-injectie 6,7,8,9,10. Deze modellen weerspiegelen echter onvolledig de progressie van de menselijke ziekte, waarbij ze vaak belangrijke stappen niet vastleggen, zoals tumorcelextravasatie over een intacte BBB onder fysiologische stromingscondities¹¹. Intraveneuze en intracardiale injecties leiden tot een lage efficiëntie van hersenspecifieke tumorvorming en leiden vaak tot wijdverspreide extracraniële metastasen, wat leidt tot vroegtijdige dierdood voordat er aanzienlijke hersenmetastasen zich ontwikkelen¹². De traditionele intracarotida arterie-injectiemethode verhoogt de intracraniële tumorvormingssnelle, maar vereist een permanente ligatie van de CCA. Door de cerebrale hemodynamica te veranderen, kan deze ligatie ischemie veroorzaken in ipsilaterale hersengebieden en de fysiologische bloedstroompatronen die nodig zijn voor tumorcellevering verstoren, waardoor hun ruimtelijke distributie en kolonisatieniche binnen de hersenen worden aangetast^13,14.

Hoogwaardige diermodellen die de pathofysiologie van hersenmetastasen nauwkeuriger kunnen nabootsen, zijn cruciaal¹⁵. Een ideaal hersenmetastasemodel zou de gehele metastatische cascade moeten recapituleren, inclusief tumorcel die naar de hersenbloedvaaten gaat, extravasatie over de bloed-hersenbarrière (BBB) en dynamische interacties met de hersenmicroomgeving¹⁶. Hoge modeltrouw is cruciaal voor zowel mechanistische studies als therapeutische evaluatie⁶. Bestaande injectiemodellen binnen de karotis reproduceren echter niet volledig belangrijke fysiologische aandoeningen, met name het behoud van de normale cerebrale bloedstroom en de natuurlijke distributie van circulerende tumorcellen.

Om de beperkingen van bestaande preklinische modellen van hersenmetastase te overwinnen, werd een high-fidelity diermodel ontwikkeld dat de metastatische cascade nauwkeuriger reproduceert, gebaseerd op de IPI-techniek en microchirurgische arteriële reparatie. Deze methode omvat een tijdelijke arteriële occlusie na tumorcelinjectie, gevolgd door een nauwgezette reparatie van de arteriële punctieplaats om de fysiologische bloedtoevoer naar de ipsilaterale CCA te herstellen. Deze aanpak verbetert niet alleen de modelconsistentie en slagingspercentages, maar behoudt ook, cruciaal, de BBB door de inheemse cerebrale hemodynamica te behouden. Door verstoring van de cerebrale bloedstroom te minimaliseren, biedt het aangepaste intracarotisinjectiemodel een hooggetrouw platform dat het natuurlijke proces van hersenmetastatische kolonisatie nauwkeuriger recapituleert, waardoor een verbeterd hulpmiddel wordt geboden voor het onderzoeken van mechanismen van hersenmetastase en het evalueren van potentiële therapieën.

Protocol

Alle dierproeven zijn goedgekeurd door het Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) van het Instituut voor Biofysica, Chinese Academie van Wetenschappen (goedkeuringsnummer: SYXK2021124). Dieren die vooraf bepaalde eindpunten bereikten, werden geëuthanaseerd in overeenstemming met de Richtlijnen voor de Euthanasie van Dieren van het Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) van het Instituut voor Biofysica, Chinese Academie van Wetenschappen, en de AVMA-richtlijnen voor de Euthanasie van Dieren (2020)¹⁷.

1. Bereiding van de single cell suspension

1. Kwek B16F10- en 4T1-cellen in een volledig RPMI-1640 medium, aangevuld met 10% foetaal rundereserum (FBS) en 1% penicilline-streptomycine.
2. Houd cellen op 37 °C in een bevochtigde broedmachine met 5% CO₂.
3. Bevestig de expressie van luciferase en controleer de afwezigheid van mycoplasma-besmetting één dag voor de operatie.
4. Op de dag van de operatie oogst u cellen wanneer ze 80% confluentie bereiken door eerst te wassen met fosfaatgepufferde zoutoplossing (PBS) voordat ze trypsinisatie (0,25%) hebben voor minder dan 3 minuten bij 37 °C.
5. Voeg 10% FBS-bevattend RPMI-1640 media toe aan de cellen om de 0,25% trypsine te dempen.
6. Centrifugeer de cellen op 300 × g gedurende 3 minuten. Was cellen twee keer in PBS om restanten van serum te verwijderen, en tel ze daarna met een hemocytometer.
7. Gebruik de Trypan blauwe uitsluitingstest om te bevestigen dat de levensvatbaarheid van de cel tijdens de injectie 90%–95% blijft.
8. Sussen cellen opnieuw in PBS bij 2 × 10^{6 cellen} /mL. Houd cellen op ijs tot de injectie.
   OPMERKING: Luciferase-gelabelde B16F10- en 4T1-cellen kunnen worden gebruikt. B16F10 wordt als representatief voorbeeld gepresenteerd.

2. Muizenvoorbereiding en perioperatieve voorbereiding

1. Gebruik mannelijke C57BL/6 muizen van 7–8 weken oud.
2. Plaats een verwarmingskussen onder de operatieplaat om onderkoeling te voorkomen. Zet het verwarmingskussen 30 minuten voor de operatie aan.
3. Steriliseer alle chirurgische instrumenten, de chirurgische plaat en de huiskooi met een autoclaaf. Desinfecteer de stereomicroscoop en operatietafel met 75% ethanol.
4. Andere items die niet met autoclaven kunnen worden gesteriliseerd, moeten worden gedesinfecteerd met UV-bestraling en 75% ethanol (Figuur 1A).
5. Weeg de muis vóór verdoving en registreer het preoperatieve gewicht als basislijn.
6. Voeg 10 g tribromoethanol toe aan een centrifugebuis en voeg vervolgens 10 ml tertiaire amylalcohol toe. Schud de buis totdat het tribromoethanol volledig is opgelost.
   OPMERKING: Tribromoethanol kan bijwerkingen veroorzaken, waaronder sterfte; Monitor de diepte van de anesthesie zorgvuldig.
7. Filter de oplossing door een 0,22 μm filter om een 100% voorraadoplossing te bereiden.
8. Verdun de 100% voorraadoplossing met 0,9% NaCl zoutoplossing of verdunningsmiddel tot een werkoplossing van 2,5% (1:40 verdunning). De werkzaamheid van elke vers bereide werkoplossing moet worden getest op anesthesie bij muizen.
9. De muizen verdoezen door intraperitoneale (i.p.) injectie van 2,5% tribromoethanol bij 0,2 mL/10 g lichaamsgewicht. Indien nodig, verleng de anesthesie door een aanvullende dosis toe te dienen op een derde van het oorspronkelijke anesthesievolume (Figuur 1B).
   OPMERKING: Pas de dosering van het anestheticum aan op basis van het lichaamsgewicht en monitor continu de ademhaling.
10. Zorg ervoor dat de muis volledig verdoofd is door een milde prikkel toe te passen (bijvoorbeeld een knellende teen) en geen motorische reactie te observeren.
11. Scheer de vacht in het nekgebied en maak na de narcose een afknippingsmarkering van de teen.
12. Breng oogzalf aan om de ogen te beschermen tegen droogheid.
13. Plaats de muis op een chirurgische plaat en zet de 4 ledematen en bovenste snijtanden vast met lijmtape (Figuur 1C).
14. Monitor de diepte van de anesthesie door de ademhalingsfrequentie en de knijpreflex te beoordelen om ervoor te zorgen dat de muizen pijnvrij en onbeweeglijk blijven tijdens de procedure.
15. Dieren worden willekeurig toegewezen aan experimentele groepen, en beeldvormende analyses werden uitgevoerd door onderzoekers die blind waren voor groepstoewijzing.

3. Standaard chirurgische procedures van de IPI-techniek en microchirurgische reparatie

1. Desinfecteer het nekgebied met een povidon-jodiumoplossing en laat de huid volledig drogen voordat je verder gaat (Figuur 1D).
2. Bedek de muis aseptisch met een steriel chirurgisch doek, waarbij alleen het nekgebied wordt blootgesteld (Figuur 1E).
3. Maak een middenlijn cervicale incisie van ongeveer 0,8–1 cm lang met een steriele chirurgische schaar, met fijne pincet voor weefselterugtrekking (Figuur 2A).
4. Voer een stompe dissectie uit van de oppervlakkige fascia en onderliggende spieren met fijn hoekige tang om de rechter halsslagaderschede bloot te leggen (Figuur 2B1, Figuur 2C1).
5. Isoleer de rechter externe halsslagader (ECA) van de carotismantel en ligaer de rechter ECA om cellekkage naar de extracraniële takken te voorkomen (Figuur 2B2, Figuur 2C2).
6. Isoleer zorgvuldig de rechter CCA in de halsslagaderschede, waarbij de nervus vagus lateraal en onder het vat wordt behouden (Figuur 2C1).
7. Plaats een klein stukje rubberen handschoen en een met zoutoplossing bevochtigde wattenbal onder de geïsoleerde rechter CCA als kussen om het vat te verhogen en te stabiliseren.
   OPMERKING: Het verhogen van de CCA stabiliseert het vat en vergemakkelijkt nauwkeurige punctie en injectie. (Figuur 2B4, Figuur 2C4).
8. Plaats twee niet-aangedraaide knopen met open lussen op de CCA distaal en proximaal van de wattenbol, en bind vervolgens de proximale knoop (Figuur 2B3, Figuur 2C3).
9. Plaats een microvasculaire clip op de CCA nabij de distale niet-aangedraaide knoop om tijdelijk de bloedstroom van de CCA te blokkeren (Figuur 2B4, Figuur 2C4).
10. Kankercelimplantatie
    1. Interlock-lek
       1. Doorboor het verhoogde segment van de rechter CCA met een 32G-naald met de afschuining naar boven gericht.
       2. Trek de eerste spuit terug terwijl je de prikplek behoudt.
       3. Vortex-mix de kankercel-suspensie en zuig 100 μL in de microliterspuit, zodat er geen luchtbellen worden opgeademd.
       4. Steek de naaldpunt van de microliterspuit in de prikplaats die is gecreëerd in stap 3.10.1.1 en houd deze stevig vast zonder injectie te starten om een stabiele positie vóór celaflevering te waarborgen (Figuur 2B5, Figuur 2C5, Aanvullende Figuur 1).
          OPMERKING: Gebruik een 32G-spuit voor de punctie en een microliterspuit voor injectie om een stabiele positionering en gecontroleerde toediening te waarborgen. Aanvullende Figuur 1 toont de parameters van de twee spuiten. De buitendiameter van de 32G-spuit is 0,22 mm, terwijl de microliter-spuitnaald 0,26 mm is, wat een veilige inbreng en gecontroleerde injectie vergemakkelijkt.
    2. Pulsatiele injectie (Figuur 2C5)
       1. Verwijder de microvasculaire clip die in stap 3.9 is aangebracht.
       2. Begin met injectie van de tumorcelsuspensie in de ICA via de microliterspuit.
       3. Geef de suspensie met een pulserende injectiebeweging, waarbij de spuitplunjer zachtjes wordt verstuwd in kleine pulsen in plaats van continue druk.
       4. Geef de suspensie volgens een van de volgende criteria: het criterium van de hartcyclus, waarbij elke 8 hartcycli ~1 μL celsuspensie wordt geïnjecteerd, geleid door pulserende retrograde bloedstroom bij de distale interne halsslagader; of het injectiesnelheidscriterium, waarbij ~1 μL/s wordt geïnjecteerd terwijl de snelheid niet hoger is dan 60 μL/min.
       5. Houd het vat tijdens de injectie in de gaten. Succesvolle levering wordt aangegeven wanneer het rode vat tijdelijk transparant wordt terwijl de suspensie door het lumen gaat, zonder zichtbare extravasatie rond de prikplaats.
       6. Na voltooiing van de injectie trek je de microliterspuit voorzichtig terug.
       7. Trek de distale knoop onmiddellijk gecontroleerd aan om het vat af te sluiten en terugvloeien te minimaliseren (Figuur 2B6, Figuur 2C6).
          OPMERKING: Pulsatiele injectie vermindert overperfusie en minimaliseert het risico op intracraniële drukverhoging.
11. Microchirurgische reparatie (Figuur 2B6, Figuur 2C6)
    1. Gebruik een 10-0 nylon microchirurgische hechting om de prikplek waterdicht te sluiten, waarbij de naaldin- en uitgangspunten direct naast de defectmarge liggen om vasculaire lekkage te minimaliseren en de luminale openheid te behouden.
    2. Steek de microchirurgische hechtnaald onder hoge vergroting door het prikgat in de vatwand en laat de hechting tijdelijk los.
    3. Spoel het operatieveld door met hepariniseerde zoutoplossing.
    4. Zet de hechting vast met twee tot drie vierkante knopen.
    5. Knip de vrije uiteinden van de hechting af tot ongeveer 1–2 mm om loskomen te voorkomen en tegelijkertijd de belasting van het vreemde voorwerp te minimaliseren.
       OPMERKING: Standaard chirurgische procedures van de IPI-techniek en microchirurgische reparatie worden beschreven in aanvullende video 1.

4. Herstel van de bloedtoevoer van de CCA

1. Maak geleidelijk de proximale knoop los.
2. Spoel het lumen door om eventueel microscopisch stolsel te verwijderen. Plaats een droge wattenbol in het operatieveld om te letten op overmatig bloedverlies.
3. Zodra geen actieve effusie van de punctieplaats is bevestigd, maak je voorzichtig de distale knoop los om de carotisbloedstroom te herstellen (Figuur 2B7, Figuur 2C7).

5. Bevestig succesvolle reparatie

1. Herstel van de pulsatie
   1. Observeer de CCA op robuuste pulsaties, wat wijst op succesvolle reperfusie.
2. Controleer de openheid en integriteit van het vaartuig
   1. Inspecteer de herstelplaats om te controleren of deze vrij is van stenose en dat het lumen open blijft en continu met het proximale vatsegment.

6. Wondspoeling en sluiting

1. Spoel het operatieveld grondig met niet-hepariniseerde zoutoplossing om vuil en bloedstolsels te verwijderen.
2. Sluit de huidincisie met een continue hechting.
   OPMERKING: Houd een vochtig operatieveld en voer alle manipulaties voorzichtig uit om weefselschade te minimaliseren.

7. Postoperatieve zorg

1. Vloeistofondersteuning: Geef 0,5–1 ml warme, steriele zoutoplossing subcutaan direct na de operatie om perioperatief vochtverlies te compenseren.
2. Infectieprofylaxe: Als de operatieduur langer dan 40 minuten duurt, dien dan 3 opeenvolgende dagen enrofloxacine toe (5 mg/kg, eenmaal daags). Antibiotica zijn niet nodig als de ingreep minder dan 40 minuten duurt.
3. Voeding en hydratatie: Geef hydrogel of zacht voedsel minstens 1 week na de operatie om voldoende hydratatie en voeding te garanderen.
4. Dagelijkse monitoring: Voer dagelijkse gezondheidsbeoordelingen uit, waarbij je kijkt op cirkelgedrag, neurologische tekorten, wondinfectie en gewichtsverlies.
5. Verwacht postoperatief verloop: Tijdens de eerste 48 uur kunnen muizen verminderde activiteit, milde pilo-erectie en gewichtsverlies tot 15% van de preoperatieve basislijn vertonen, gevolgd door geleidelijk herstel.
6. Analgesie: Dien meloxicam (5 mg/kg, subcutaan) eenmaal per dag toe gedurende 2–3 dagen om pijn te verlichten en herstel te bevorderen.

8. Evaluatiecriteria voor het succesvol opzetten van diermodellen

1. Lichaamsgewichtmonitoring
   1. Weeg de muizen dagelijks en registreer het lichaamsgewicht.
2. Klinische beoordeling
   1. Beoordeel dagelijks klinische tekenen, waaronder houding en cirkelgedrag.
3. Bioluminescentiebeeldvorming
   1. Zet de aan/uit-schakelaars van het beeldvormingsapparaat en de computer aan.
   2. Start de bioluminescentie-beeldvormingsanalysesoftware (Versie 4.7.2) en klik op "Initialiseren" om het bioluminescentiebeeldvormingssysteem te initialiseren.
   3. Tijdens de initialisatie zal het temperatuurstatuslampje op het bedieningspaneel van het beeldvormingssysteem rood verschijnen. Voer beeldvorming pas uit nadat het temperatuurstatuslampje groen wordt.
   4. Onthoud muizen gedurende 6 uur voedsel en water voorafgaand aan de beeldvorming om aspiratie tijdens de narcose te voorkomen.
   5. Bereid het beeldvormingssubstraat voor op een concentratie van 10 mg/mL, beschermd tegen licht gedurende de hele procedure. Bereken het injectievolume op 10 μL/g lichaamsgewicht.
   6. Beperk de muis voor beeldvorming. Maak de injectieplaats in de linkeronderbuik schoon met 75% medische alcohol.
   7. Gebruik een wattenstaafje om de buikwand op de injectieplaats voorzichtig te stimuleren om het risico te minimaliseren dat de naald in de darm komt.
   8. Na het doorprikken van de buikwand, aspireer voorzichtig om de afwezigheid van bloed te bevestigen en injecteer vervolgens langzaam het in vivo beeldvormingssubstraat.
   9. Na 4 minuten en 30 seconden na substraatinjectie breng je de muis over in een anesthesie-inductiekamer.
   10. Induceer anesthesie met 3% isofluran. Zodra de rechtstaande en knijpreflexen verloren zijn, verlaag je de isofluranconcentratie tot 2% voor onderhoud.
   11. Plaats de verdoofde muis in de beeldvormingskamer, waarbij de neuskegel de mond en neus volledig bedekt. Sluit de deur van de beeldkamerkamer stevig.
   12. Selecteer in het configuratiescherm van het imaging system "Luminescent" als beeldvormmodus. Stel de belichtingstijd handmatig in op 60 seconden. Selecteer "Fotografie", "Overlay" en "Uitlijningsraster".
   13. Stel het gezichtsveld in op D voor het beelden van drie muizen. Stel de beeldhoogte aan op 1,5 cm. Selecteer "Block" voor het excitatiefilter en "Open" voor het emissiefilter.
   14. Na 10 minuten na substraatinjectie klik je op "Verkrijgen" om de afbeelding vast te leggen.
   15. Na het verkrijgen van afbeeldingen navigeer je naar het Gereedschapspalet en selecteer je "ROI Tools". Gebruik de "Cirkel"-tool om het interessegebied (ROI) af te bakenen en klik vervolgens op "Measure ROIs" om kwantitatieve gegevens te verkrijgen.
4. Histologische analyse
   1. Oogst hersenweefsel op het experimentele eindpunt en onderwerp deze aan histologische analyse.
   2. Identificeren en bevestigen gemetastaseerde laesies door middel van hematoxylin- en eosinekleuring (H&E).

9. Humane eindpunten

1. Om dierenwelzijn en naleving van ethische normen te waarborgen, zijn vooraf gedefinieerde humane eindpunten vastgesteld als criteria voor onmiddellijke euthanasie.
2. Muizen worden geëuthanaseerd door inademing van kooldioxide (CO₂), gevolgd door cervicale dislocatie als secundaire fysieke methode om de dood te bevestigen.
3. Onmiddellijk moet euthanasie worden uitgevoerd als een van de volgende aandoeningen zich voordoet.
   1. Neurologische tekorten
      1. Motorische disfunctie: ataxie (onstabiele gang, wiegen), cirkelen, verlamming, hemiparese of tremoren.
      2. Gedrags- of bewustzijnsveranderingen: lethargie, roes of coma.
      3. Tekenen van verhoogde intracraniële druk: abnormale houding (bijv. gebogen rug die op stress duidt) of hoofdkanteling.
      4. Aanvallen: gegeneraliseerde of focale convulsie.
   2. Veranderingen in lichaamsgewicht en fysiologische functie
      1. Een gewichtsverlies van meer dan 20% of het onvermogen om zelfstandig te eten of drinken door tumorlast of ernstige zwakte.
      2. Dyspneu (hijgen of hijgen) of urine-/fecale incontinentie.
   3. Tumorstatus
      1. Beëindig het experiment onmiddellijk als tumorgeassocieerde ulceratie, infectie of necrose wordt vastgesteld.
   4. Maximaal tolerante tumorlast
      1. Muizen ondergaan twee keer per week bioluminescentiebeeldvorming.
      2. Zodra het intracraniële tumorsignaal een exponentiële groeifase ingaat (bijvoorbeeld verdubbeling tussen twee opeenvolgende beeldvormingssessies), wordt neurologische monitoring verhoogd naar twee keer per dag.
      3. Euthanasie werd onmiddellijk uitgevoerd bij het begin van ataxie of aanvallen, ongeacht de waarde van het bioluminescentiesignaal.

Resultaten

Bioluminescente beeldvorming en kwantitatieve analyse
Volgens het gestandaardiseerde chirurgische protocol toonde het geoptimaliseerde muismodel van hersenmetastase stabiele intracraniële bioluminescente signalen aan op seriële in vivo beeldvorming postoperatief. Continue bioluminescente beeldvorming in vivo (Figuur 3A) en kwantitatieve analyse (Figuur 3B) gedurende 4 weken na intracarotid-i...

Discussie

Robuuste preklinische modellen die hersenmetastasen nauwkeurig recapituleren zijn essentieel voor het ontrafelen van pathofysiologische mechanismen en het evalueren van therapeutische effectiviteit. Het traditionele intracarotisinjectiemodel vereist ligatie van de arterie common carotis (CCA), wat de cerebrale bloedstroom op niet-fysiologische wijze verandert, wat mogelijk ipsilaterale ischemische schade kan veroorzaken en de bloed-hersenbarrière (^...

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
10-0 microsurgical suture with needle	Lingqiao	2650798	Microsurgical suture voor reparatie van de punctieplaats van de gemeenschappelijke halsslagader
100 µL microliter syringe	Bolige Tools	100UL	Microliter spuit voor tumorcelbezorging tijdens interlokkende pulsatiele injectie
100 µL pipette	Eppendorf	3123-000250	Pipet voor zoutoplossing irrigatie van het chirurgische veld
32G 1 mL insuline spuit	Kindly	YY0497	Insulinespuit gebruikt om de initiële arteriële punctieplaats te creëren
4-0 zijdesutuur	Ethicon	W501	Sutuurmateriaal voor het sluiten van de huid incisie
4T1 borstkankercellijn	Verkregen uit het laboratorium Shengdian Wang, Instituut voor Biofysica, Chinese Academie van Wetenschappen	CRL-2539	Tumorcellijn gebruikt voor intracarotide hersenmetastase modellering
75% Ethanol	Annjet	Q/371402AAJ008	Ontsmettingsmiddel voor het reinigen van de injectieplaats
7–8-week-oude mannelijke C57BL/6J muizen	Charles River Laboratories	1.10011E+17	Experimentele dieren gebruikt voor het B16F10 hersenmetastase model
8-week-oude vrouwelijke BALB/c muizen	Charles River Laboratories	1.10011E+17	Experimentele dieren gebruikt voor het 4T1 hersenmetastase model
Klinkende punttang	Kewo Tools	—	Microchirurgische tang voor weefseldassectie en vatmanipulatie
B16F10 melanoomcellijn	Verkregen uit het laboratorium Shengdian Wang, Instituut voor Biofysica, Chinese Academie van Wetenschappen	CRL-6475	Melanoomcellijn gebruikt voor intracarotide hersenmetastase modellering
Bioluminescentie beeldvorming analyse software	Living Image (versie 4.7.2)	—	Software voor analyse van bioluminescentie beeldvormingsgegevens
DMEM	Xigong Bio Tech	M1805	Celcultuurmedium voor tumorcelonderhoud
Enrofloxacine (antibioticum)	MCE	HY-B0502	Antibioticum gebruikt voor postoperatieve infectieprofylaxe
Eosine Y oplossing	Beyotime	E301879	Histologisch kleurreagens voor eosine kleuring
Oogzalf	Baiyunshan	H44023089	Oogzalf voor bescherming van de ogen tijdens anesthesie
Fetaal bovien serum (FBS)	Pan Sera Tech	ST30-3302	Serumsupplement voor celcultuurmedium
GraphPad Prism	Versie 4.7.2	—	Statistische analysesoftware voor overlevingscurven en kwantitatieve gegevensanalyse
Hematoxyline oplossing	Beyotime	C0105S	Histologisch kleurreagens voor hematoxyline kleuring
Isofluraan	H.F.Q. Biotechnology	101357015	Inhalatieanestheticum gebruikt tijdens beeldvormingsprocedures
IVIS Spectrum in vivo beeldvormingssysteem	Lumina Series III	—	Beeldvormingssysteem voor in vivo bioluminescentie beeldvorming
Meloxicam (pijnstiller)	Qilu Animal Health	150252467	Niet-steroïdale anti-inflammatoire drug gebruikt voor postoperatieve pijnstilling
Microchirurgische schaar	Kewo Tools	—	Microchirurgische schaar voor weefseldassectie
Mini vaatclip	Zheyong Tools	200521	Microvasculaire clip voor tijdelijke occlusie van de gemeenschappelijke halsslagader
Naaldhouder	Jiangxin Tools	1420 20Cr13	Chirurgisch instrument voor het hanteren van microchirurgische suturen
Paraformaldehyde (4%)	Zhongsheng Wanda Tech	20240411	Fixatief voor hersenweefselbewaring voorafgaand aan histologische analyse
Penicilline	Gibco	1758-9324	Antibioticum voor celcultuur
Povidon-jood oplossing	Sihuanpai	Q/PGSHW0009	Antiseptische oplossing voor chirurgische huiddesinfectie
RPMI-1640 medium	Xigong Bio Tech	12-115F	Celcultuurmedium voor tumorcelgroei
Scilogex mixers	Scilogex	MX-S	Vortexmixer voor het homogeniseren van tumorcelsuspensies
Stoomindicatortape	3M-Comply	1322-24MM	Sterilisatieindicator voor geautoclaveerde chirurgische instrumenten
Stereomicroscoop	Olympus	SZ61	Microscoop gebruikt voor visualisatie tijdens microchirurgische procedures
Zeiss Stemi 508 stereomicroscoop	Zeiss	Stemi 508	Stereomicroscoop gebruikt voor hoogvergroting chirurgische visualisatie
Steriele zoutoplossing (0,9%)	Kelun	25M14D07	Steriele irrigatieoplossing gebruikt om de vochtinhoud van het chirurgische veld te behouden
Streptomycine	Gibco	1758-9319	Antibioticum voor celcultuur
Chirurgisch scherm	Dafang	001-2016	Steriele scherm gebruikt om het chirurgische veld te isoleren
Chirurgische handschoenen	Ansell Medi-grip	210-64005	Steriele handschoenen gebruikt tijdens chirurgische procedures
Tribromoethanol	Sigma-Aldrich	MKBH0634V	Injecteerbaar anestheticum voor chirurgische procedures
Ultrasound Doppler	Mindray S7 SCI	—	Hoog-resolutie echografiesysteem voor beoordeling van halsslagader bloedstroom