In vitro Functionele analyse van regulerende T-cellen: Focus op proliferatie en differentiatie

Samenvatting

Dit protocol biedt een in vitro co-kweekstrategie om de effecten van regulerende T-cellen op de proliferatie en differentiatie van effector T-cellen te onderzoeken.

Samenvatting

Regulerende T (Treg) cellen spelen een sleutelrol bij het handhaven van de immuunhomeostase. Afwijkingen in de functie van de Treg-cel worden geassocieerd met verschillende ziekten, waaronder auto-immuunziekten, orgaantransplantatieafstoting, infecties en kanker. Het manipuleren van Trog-cellen wordt beschouwd als een mogelijke therapeutische strategie voor de behandeling van ontstekingsziekten, waaronder auto-immuunziekten, afstoting van vaste orgaantransplantaties, graft-versus-host ziekte en allergische aandoeningen. Klassieke in vitro Treg celsuppressie-assays beoordelen voornamelijk het remmende effect van Treg-cellen op de proliferatie van effector T (Teff). Naast proliferatie is differentiatie van T-cellen echter belangrijk voor T-cellen om hun immuunfuncties uit te voeren. Daarom biedt dit protocol een aangepaste in vitro Treg celsuppressietest om de effecten van Treg-cellen op de proliferatie en differentiatie van Teff-cellen te onderzoeken. In dit protocol wordt eerst de voorbereiding van muis Treg cellen en naïeve T-cellen geïntroduceerd, gevolgd door de co-kweekstrategie voor het bestuderen van de regulerende effecten van Treg cellen op de proliferatie en differentiatie van Teff-cellen, inclusief Th1- en Th17-cellen, en tenslotte de kleuringsstrategie voor flowcytometrie na co-kweek. Deze in vitro functionele analyse van Treg-cellen kan worden gebruikt om de effecten van Treg-cellen op proliferatie en polarisatie van T-cellen te onderzoeken.

Inleiding

CD4⁺CD25⁺Foxp3⁺ regulerende T (Treg) cellen zijn belangrijke mediatoren van immuunhomeostase¹. Trekcellen onderdrukken actief overmatige immuunresponsen en behouden zelf-immuuntolerantie, waardoor immuunreacties voorkomen die normale weefsels en organen beschadigen². Het manipuleren van Trog-cellen wordt beschouwd als een mogelijke therapeutische strategie voor de behandeling van ontstekingsziekten zoals auto-immuunziekten, afstoting van vaste orgaantransplantaties, graft-versus-host ziekte en allergische ziekten ^3,4,5

Protocol

Alle muizenexperimenten zijn goedgekeurd door de Animal Ethics Committee van het West China Hospital, Sichuan University (Goedkeuringsnummers 20250814006, 20211212A). Alle muizen die in dit experiment werden gebruikt, hadden een C57BL/6 genetische achtergrond.

1. Voorbereiding van oplossingen

1. Bereid fluorescentie-geactiveerde celsortering (FACS) buffer voor: 1× PBS bevat 0,5% runderserumalbumine (BSA).
2. Bereid magnetisch-geactiveerde celsorteerbuffer (MACS) voor: 1× PBS met 0,5% BSA en 2 mM ethyleendiamine tetraazijnzuur (EDTA).
3. Bereid celkweekmedium voor: RPM....

Resultaten

In het representatieve experiment werden naïeve T-cellen gebruikt als Tresp-cellen om de effecten van met Treg verrijkte cellen op de proliferatie en differentiatie van Th1- en Th17-cellen te onderzoeken. In dit experiment werden Tresp-cellen geactiveerd door anti-muis CD3- en APC-verrijkte niet-CD4⁺ cellen, en vervolgens gedifferentieerd tot Th1-cellen onder IL-12 p70-inductie of tot Th17-cellen onder TGF-β1 en IL-6 inductie. Onder deze twee inductiecondities werden veranderingen in de proliferatie en differe.......

Discussie

In deze studie zijn de resultaten van de co-kweek onder Th1-inductiecondities consistent met eerdere rapporten dat Treg-cellen de proliferatie en differentiatie van Th1-cellen kunnen onderdrukken^17,18. Treg-verrijkte cellen remden ook de proliferatie van Tresp-cellen onder Th17-inductieomstandigheden. Echter, onder de hier gebruikte Th17-polarisatieomstandigheden nam de frequentie van IL-17A⁺ Tresp-cellen toe in aanwez.......

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
1.5 mL centrifuge tube	Thermo Fisher Scientific	3457IW	of equivalent
12.5 μL Filtered Pipette Tips	Thermo Fisher Scientific	94420043	of equivalent
1250 μL Filtered Pipette Tips	Thermo Fisher Scientific	94420813	of equivalent
15 mL Conical Centrifuge Tubes	Thermo Fisher Scientific	339650	of equivalent
200 μL Filtered Pipette Tips	Thermo Fisher Scientific	94420318	of equivalent
48-well plates	Corning Incorporated	3548	of equivalent
5 mL syringe piston	Shifeng Medical	SB2-061(A)	of equivalent
50 mL Conical Centrifuge Tubes	Thermo Fisher Scientific	339652	of equivalent
50 μL Filtered Pipette Tips	Thermo Fisher Scientific	94420258	of equivalent
70 μm cell strainer	Biosharp Life Sciences	BS-70-CS	of equivalent
Anti-mouse CD28 antibody	BioXcell	BE0015-1	of equivalent
Anti-mouse CD3 antibody	BioXcell	BE0001-1	of equivalent
Anti-mouse CD4 PerCP-Cy5.5 (RM4-5)	Thermo Fisher Scientific	45-0042-82	of equivalent
Anti-mouse Foxp3 PB (FJK-16s)	Thermo Fisher Scientific	48-5773-82	of equivalent
Anti-mouse IFN-gamma PE (XMG1.2)	BioLegend	505808	of equivalent
Anti-mouse IL-17A PE-Cy7 (eBio17B7)	Thermo Fisher Scientific	25-7177-82	of equivalent
Beckman CytoFLEX S Flow Cytometer	Beckman Coulter	N/A	voor flow cytometrische data-acquisitie van immuuncelbeurtelingen
Bovine Serum Albumin (BSA)	Sigma-Aldrich	B2064	of equivalent
C57BL/6 mice	Shanghai Model Organisms Center, Inc	SM-001	voor isolatie van primaire lymfocyten en T-celsubsets
CD25 Monoclonal Antibody (PC61.5), PE	Thermo Fisher Scientific	12-0251-83	of equivalent
CD4+CD25+ Regulatory T Cell Isolation Kit, mouse	Miltenyi Biotec	130-091-041	voor celsortering
CD4+CD62L+ T Cell Isolation Kit, mouse	Miltenyi Biotec	130-106-643	voor celsortering
CD45.1 mice	Shanghai Model Organisms Center, Inc	NM-KI-210226	voor isolatie van primaire lymfocyten en T-celsubsets
CD45.1 Monoclonal Antibody (A20), FITC	Thermo Fisher Scientific	11-0453-85	of equivalent
CD45.2 Monoclonal Antibody (104), APC-eFluor 780	Thermo Fisher Scientific	47-0454-82	of equivalent
CD62L (L-Selectin) Monoclonal Antibody (MEL-14), FITC	Thermo Fisher Scientific	11-0621-85	of equivalent
Cytofix/Cytoperm Fixation/Permeabilization Solution Kit	BD Biosciences	554714	of equivalent
eBioscience Cell Proliferation Dye eFluor 450	Thermo Fisher Scientific	65-0842-90	of equivalent
ethylenediamine tetraacetic acid (EDTA)	Solarbio Life Sciences	E1170	of equivalent
Fetal Bovine Serum	Thermo Fisher Scientific	A5669701	of equivalent
FlowJo 10.6.2	BD Biosciences	N/A	software voor flowcytometrie data-analyse
Golgi-Plug Protein Transport Inhibitor	BD Biosciences	555029	of equivalent
HEPES (1 M)	Thermo Fisher Scientific	15630080	of equivalent
Human TGF-beta1	PEPROTECH	100-21C	of equivalent
Ionomycin calcium salt	Millipore Sigma	I3909	of equivalent
LD Columns	Miltenyi Biotec	130-042-901	voor celsortering
L-Glutamine (200 mM)	Thermo Fisher Scientific	25030081	of equivalent
LS Columns	Miltenyi Biotec	130-042-401	voor celsortering
MACS MultiStand	Miltenyi Biotec	130-042-303	voor celsortering
MS Columns	Miltenyi Biotec	130-042-201	voor celsortering
OctoMACS Separators	Miltenyi Biotec	130-042-109	voor celsortering
PBS, pH 7.4	Thermo Fisher Scientific	10010049	of equivalent
PE Rat IgG1, κ Isotype Ctrl Antibody	BioLegend	400408	of equivalent
PE/Cyanine7 Rat IgG2a kappa Isotype Control Antibody	Thermo Fisher Scientific	25-4321-82	of equivalent
Penicillin-Streptomycin	Thermo Fisher Scientific	15140122	of equivalent
PMA	Millipore Sigma	P8139	of equivalent
Purified anti-mouse CD16/32 Antibody	BioLegend	101302	of equivalent
QuadroMACS Separator	Miltenyi Biotec	130-090-976	voor celsortering
Recombinant mouse IL-12 p70	PEPROTECH	210-12	of equivalent
Recombinant Mouse IL-6	R&D Systems	406-ML	of equivalent
Red Blood Cell Lysis Buffer (ACK Lysing Buffer)	Thermo Fisher Scientific	A1049201	of equivalent
RPMI 1640 medium	Thermo Fisher Scientific	11875093	of equivalent
Sodium Pyruvate (100 mM)	Thermo Fisher Scientific	11360070	of equivalent
Trypan Blue Solution, 0.4%	Thermo Fisher Scientific	15250061	of equivalent
UltraComp eBeads Compensation Beads	Thermo Fisher Scientific	01-2222-42	of equivalent
Zombie Yellow Fixable Viability Kit	BioLegend	423104	of equivalent
β-Mercaptoethanol	Sigma-Aldrich	M3148	of equivalent