In vitro Functionele analyse van regulerende T-cellen: Focus op proliferatie en differentiatie

Samenvatting

Dit protocol biedt een in vitro co-kweekstrategie om de effecten van regulerende T-cellen op de proliferatie en differentiatie van effector T-cellen te onderzoeken.

Samenvatting

Regulerende T (Treg) cellen spelen een sleutelrol bij het handhaven van de immuunhomeostase. Afwijkingen in de functie van de Treg-cel worden geassocieerd met verschillende ziekten, waaronder auto-immuunziekten, orgaantransplantatieafstoting, infecties en kanker. Het manipuleren van Trog-cellen wordt beschouwd als een mogelijke therapeutische strategie voor de behandeling van ontstekingsziekten, waaronder auto-immuunziekten, afstoting van vaste orgaantransplantaties, graft-versus-host ziekte en allergische aandoeningen. Klassieke in vitro Treg celsuppressie-assays beoordelen voornamelijk het remmende effect van Treg-cellen op de proliferatie van effector T (Teff). Naast proliferatie is differentiatie van T-cellen echter belangrijk voor T-cellen om hun immuunfuncties uit te voeren. Daarom biedt dit protocol een aangepaste in vitro Treg celsuppressietest om de effecten van Treg-cellen op de proliferatie en differentiatie van Teff-cellen te onderzoeken. In dit protocol wordt eerst de voorbereiding van muis Treg cellen en naïeve T-cellen geïntroduceerd, gevolgd door de co-kweekstrategie voor het bestuderen van de regulerende effecten van Treg cellen op de proliferatie en differentiatie van Teff-cellen, inclusief Th1- en Th17-cellen, en tenslotte de kleuringsstrategie voor flowcytometrie na co-kweek. Deze in vitro functionele analyse van Treg-cellen kan worden gebruikt om de effecten van Treg-cellen op proliferatie en polarisatie van T-cellen te onderzoeken.

Inleiding

CD4⁺CD25⁺Foxp3⁺ regulerende T (Treg) cellen zijn belangrijke mediatoren van immuunhomeostase¹. Trekcellen onderdrukken actief overmatige immuunresponsen en behouden zelf-immuuntolerantie, waardoor immuunreacties voorkomen die normale weefsels en organen beschadigen². Het manipuleren van Trog-cellen wordt beschouwd als een mogelijke therapeutische strategie voor de behandeling van ontstekingsziekten zoals auto-immuunziekten, afstoting van vaste orgaantransplantaties, graft-versus-host ziekte en allergische ziekten ^3,4,5. Tegelijkertijd wordt het remmen van de functie van Treg-cellen beschouwd als een effectieve strategie om anti-tumor immuniteit^te activeren ^6,7. Klinische studies hebben adoptieve regulatorische T-celtherapie of laag-dosis IL-2-behandeling onderzocht voor auto-immuunziekten, solide orgaantransplantatie en graft-versus-host ziekte ^8,9,10. Bovendien krijgen studies naar gemodificeerde Trog-cellen, waaronder chimerische antigeenreceptor (CAR)-Treg-cellen en T-celreceptor (TCR)-Treg-cellen, ook toenemende aandacht^11,12.

Tot op heden is Treg-celtherapie niet breed gevestigd in de routinematige klinische behandeling. Om de klinische toepassing van Treg-celtherapie te ondersteunen, zijn systematisch onderzoek en evaluatie van de functies ervan belangrijk. Een veelgebruikte strategie om de functies van regulerende T-cellen in vitro te evalueren is de in vitro Treg suppressietest¹³, die de suppressieve functie van Treg-cellen kan detecteren bij de proliferatie van effector T (Teff). De standaard in vitro Treg suppressietest evalueert echter niet de differentiatie van Teff-cellen. Als proliferatie en differentiatie van effector T-cellen gelijktijdig kunnen worden geëvalueerd, kan meer informatie worden verkregen over de functie van regulerende T-cellen.

Hier presenteren we een aangepaste in vitro Treg celsuppressie-assay, genaamd "in vitro functionele analyse van Treg-cellen" (Figuur 1). Dit protocol biedt een in vitro co-kweekstrategie om de effecten van Treg-cellen op de proliferatie en differentiatie van Teff-cellen te onderzoeken.

Protocol

Alle muizenexperimenten zijn goedgekeurd door de Animal Ethics Committee van het West China Hospital, Sichuan University (Goedkeuringsnummers 20250814006, 20211212A). Alle muizen die in dit experiment werden gebruikt, hadden een C57BL/6 genetische achtergrond.

1. Voorbereiding van oplossingen

1. Bereid fluorescentie-geactiveerde celsortering (FACS) buffer voor: 1× PBS bevat 0,5% runderserumalbumine (BSA).
2. Bereid magnetisch-geactiveerde celsorteerbuffer (MACS) voor: 1× PBS met 0,5% BSA en 2 mM ethyleendiamine tetraazijnzuur (EDTA).
3. Bereid celkweekmedium voor: RPMI 1640 medium met 10% foetaal rundvleesserum (FBS), 1 mM natriumpyruvat, 2 mM L-glutamine, 10 mM HEPES, 55 μM β-mercaptoethanol, 100 U/mL penicilline en 100 μg/mL streptomycine.

2. Voorbereiding van C57BL/6 muislymfocyten

1. Neem de milt en perifere lymfeklieren (LN's) van een 6–8 weken oude C57BL/6 muis (mannelijk of vrouwelijk) onder steriele omstandigheden en plaats deze in een 50 mL centrifugebuis met 5 mL FACS-buffer.
   OPMERKING: De dissectie van de milt en LN's moet worden uitgevoerd volgens standaardprocedures.
2. Plaats een 70 μm celzeef op een 50 mL centrifugebuis, plaats vervolgens de milt en LN's op de zeef en gebruik een 5 mL spuitzuiger om het weefsel voorzichtig 1 minuut lang te malen. Spoel tijdens het malen de zeef 3 keer af met FACS buffer. Zorg ervoor dat al het weefsel volledig wordt gemalen en spoel de cellen af in de centrifugebuis. Na het malen verwijder je de zef.
3. Centrifugeer op 4 °C, 350 × g gedurende 7 minuten.
4. Verwijder het supernatant, suspendeer de celpellet opnieuw in 3 mL rode bloedcel lysebuffer en laat de suspensie 3–5 minuten op kamertemperatuur staan.
5. Voeg onmiddellijk FACS-buffer toe aan de centrifugebuis tot een volume van 15–20 mL om de lyse te beëindigen, en centrifugeer bij 4 °C, 350 × g gedurende 7 minuten.
6. Verwijder het supernatant, voeg 10 mL FACS-buffer toe en suspendeer de celpellet voorzichtig opnieuw.
7. Neem 10 μL celsuspensie en gebruik trypanblauwe kleuring om het totaal aantal levende lymfocyten te tellen.
   OPMERKING: Deze cellen zijn CD45.2⁺ lymfocyten.

3. Voorbereiding van CD45.1-muislymfocyten

1. Neem de milt en LN's van een 6–8 weken oude CD45.1-muis (mannelijk of vrouwelijk) onder steriele omstandigheden en plaats ze in een 50 mL centrifugebuis met 5 mL FACS-buffer.
2. Bereid lymfocyten van de CD45.1-muis voor door dezelfde hierboven beschreven stappen te volgen.
   OPMERKING: Deze cellen zijn CD45.1⁺ lymfocyten.

4. Voorbereiding van CD45.2⁺CD4⁺CD62L⁺ naïeve T-cellen

OPMERKING: Het hele proces gebruikt de CD4⁺CD62L⁺ T Cell Isolation Kit voor MACS. De MACS-buffer wordt voorgekoeld bij 4 °C, en alle centrifugatiecondities zijn 4 °C, 350 × g gedurende 7 minuten.

1. Verzamel de celsuspensie van C57BL/6 muizen, centrifugeer en gooi het supernatant af, voeg 400 μL MACS-buffer en 100 μL CD4⁺ T-cel Biotine-Antibody Cocktail toe aan de centrifugebuis per 1 × 10^{à 8} initiële cellen. Meng voorzichtig en laat het 5 minuten in het donker incuberen op 4 °C.
2. Voeg 300 μL MACS-buffer en 200 μL antibiotine-microkorrels toe aan de centrifugebuis vanaf stap 4.1 per 1 × 10^{8 initiële} totale cellen. Meng voorzichtig en laat het 10 minuten in het donker incuberen op 4 °C.
3. Voeg 10 mL MACS-buffer toe, centrifugeer en gooi het supernatant weg. Suspendeer de celpellet opnieuw in 2 mL MACS-buffer.
4. Plaats de LS-kolom op de juiste MACS sorteermagnetische scheider. Gebruik 3 ml MACS-buffer om de kolom te spoelen. Wacht tot de buffer in de kolom volledig leeg is voordat je doorgaat naar de volgende stap.
   OPMERKING: De maximale laadcapaciteit van de LS-kolom is 2 × 10⁹ cellen, inclusief zowel positieve als negatieve cellen, en het maximale aantal positieve cellen dat deze kan vangen is 1 × 10⁸. Meestal heeft één muis hier maar één LS-kolom nodig.
5. Laad de celophanging vanaf stap 4.3 op de LS-kolom. Wanneer de celsuspensie volledig in de kolom stroomt, gebruik dan 3 mL MACS-buffer om de kolom te wassen. Verzamel alle doorstroomvloeistof in een nieuwe 15 mL centrifugebuis.
   OPMERKING: Dit zijn het totaal aantal cellen CD4⁺CD25^– T.
6. Centrifugeer het totaal aantal CD4⁺CD25^{– T-cellen} die in stap 4.5 zijn verkregen, verwijder het supernatant en verkrijg de celpellet.
7. Voeg 800 μL MACS-buffer en 200 μL CD62L-microkorrels toe aan de celpellet per 1 × 10^{à 8} initiële cellen. Meng voorzichtig en laat het 10 minuten in het donker incuberen op 4 °C.
8. Voeg 10 mL MACS-buffer toe aan de centrifugebuis, centrifugeer en verwijder het supernatant, en suspendeer de celpellet opnieuw in 500 μL MACS-buffer.
9. Plaats de MS-kolom op de juiste MACS-sorteermagnetische scheider en gebruik 1 mL MACS-buffer om de kolom te spoelen.
10. Laad de celophanging op de MS-kolom. Wanneer de suspensie volledig in de kolom stroomt, gebruik dan 1 ml MACS-buffer om de kolom 2x te wassen.
11. Verwijder de MS-kolom van de magnetische scheider en plaats deze op een nieuwe 15 mL centrifugebuis. Voeg 1 ml MACS-buffer toe aan de kolom en druk onmiddellijk stevig op de zuiger om de cellen met magnetische kralen te elueren.
12. Tel de cellen, centrifugeer en gooi het supernatant weg, suspendeer de cellen opnieuw in een passend volume kweekmedium en houd de buis op ijs.
    OPMERKING: Deze cellen zijn CD45.2⁺CD4⁺CD62L⁺ naïeve T-cellen. Gewoonlijk kunnen ongeveer 8 × 10⁶ tot 1 × 10⁷ CD4⁺CD25^–CD62L⁺ naïeve T-cellen worden gezuiverd met één muis; Opname van perifere lymfeklieren kan de opbrengst verhogen.
13. Bepaal de zuiverheid van de geïsoleerde cellen: Neem 5 × 10⁴ geïsoleerde CD4⁺CD62L^{+ T-cellen} en susseer ze opnieuw in 50 μL antistofoplossing in een 1,5 mL centrifugebuis.
    OPMERKING: Bereid de antilichaamoplossing voor door het anti-muis CD4 PerCP-Cy5.5 antilichaam, anti-muis CD62L FITC-antilichaam en anti-muis CD25 PE-antilichaam toe te voegen aan de FACS-buffer in een verhouding van 1:100.
14. Na de 20 minuten incubatie bij 4 °C in het donker, voeg je 1 mL FACS-buffer toe om de cellen te wassen. Centrifugeer de cellen, verwijder het supernatant en suspendeer de pellet opnieuw in 200 μL FACS-buffer.
15. Detecteer de zuiverheid van de monsters met flowcytometrie.
    OPMERKING: Voor details over flowcytometeranalyse, raadpleeg de gebruikershandleiding van het instrument of het eerder gerapporteerde protocol¹⁴. De zuiverheid van CD4⁺CD25^–CD62L⁺ naïeve T-cellen moet groter zijn dan 95% in het geïsoleerde T-celmonster (Figuur 2).

5. Voorbereiding van CD45.1⁺CD4⁺CD25⁺ Treg-verrijkte cellen en antigeen-presenterende celverrijkte niet-CD4⁺ cellen

OPMERKING: Het hele proces gebruikt de CD4⁺CD25⁺ Regulatory T Cell Isolation Kit voor MACS, en de instructies in de kit zijn geoptimaliseerd om tegelijkertijd antigeen-presenterende cel (APC)-verrijkte niet-CD4⁺ cellen en CD4⁺CD25⁺ Treg-verrijkte cellen te verkrijgen. De MACS-buffer wordt voorgekoeld bij 4 °C, en alle centrifugatiecondities zijn 4 °C, 350 × g gedurende 7 minuten.

1. Verzamel de celsuspensie van CD45.1-muizen, centrifugeer en verwijder het supernatant, voeg 400 μL voorgekoelde MACS-buffer en 100 μL CD4⁺CD25⁺ Regulatory T Cell Biotine-Antibody Cocktail toe aan de centrifugebuis per 1 × 10^{à 8} initiële totale cellen. Meng voorzichtig en laat het 10 minuten in het donker incuberen op 4 °C.
2. Zonder wassen voeg direct 380 μL voorgekoelde MACS-buffer, 200 μL Anti-Biotine-microkorrels en 20 μL CD25-PE-antilichaam per 1 × 10 à⁸ initiële totale cellen toe aan de centrifugebuis vanaf stap 5.1. Meng voorzichtig en laat het 15 minuten in het donker incuberen op 4 °C.
3. Voeg 10 mL MACS-buffer toe aan de centrifugebuis, centrifuge, en gooi het supernatant weg, en suspendeer vervolgens de celpellet opnieuw in 500 μL MACS-buffer per 1 × 10^{à 8} initiële cellen.
4. Plaats de LD-kolom op de juiste MACS-sorteermagnetische scheider en spoel de kolom met 2 ml MACS-buffer. Wacht tot de buffer in de kolom volledig leeg is voordat je doorgaat naar de volgende stap.
5. Laad langzaam de celophanging vanaf stap 5.3 op de LD-kolom. Wanneer de celsuspensie volledig in de kolom stroomt, was je de kolom 2x met 2 mL MACS-buffer. Verzamel alle doorstroomvloeistof in een nieuwe 15 mL centrifugebuis.
6. Verwijder de LD-kolom van de magnetische scheider en plaats deze op een nieuwe 15 mL centrifugebuis. Voeg 3 mL MACS-buffer toe aan de LD-kolom, druk direct de zuiger stevig om de Microbeads-gelabelde niet-CD4⁺ cellen uit te stoten. Tel de cellen, centrifugeer, suspendeer de cellen opnieuw in een passend volume celkweekmedium om een celconcentratie van 1 × 10^{7 cellen} /ml te bereiken, en houd de buis op ijs.
   OPMERKING: Deze niet-CD4⁺ cellen bestaan voornamelijk uit APC's zoals macrofagen, dendritische cellen en B-cellen. In dit protocol worden deze cellen gebruikt als een APC-verrijkte niet-CD4⁺ fractie.
7. Centrifugeer het totaal aantal CD4⁺ T-cellen die in stap 5.5 zijn verzameld, verwijder het supernatant en verkrijg de celpellet.
8. Voeg 900 μL MACS-buffer en 100 μL Anti-PE Microkorrels toe aan de celpellet per 1 × 10^{à 8} initiële totale cellen. Meng voorzichtig en laat het 15 minuten in het donker incuberen op 4 °C.
9. Plaats de MS-kolom op de juiste MACS-sorteermagnetische scheider en spoel de kolom af met 500 μL voorgekoelde MACS-buffer. Wacht tot de buffer in de kolom volledig leeg is voordat je doorgaat naar de volgende stap.
10. Laad langzaam de celophanging vanaf stap 5.8 op de MS-kolom. Wanneer de celsuspensie volledig in de kolom stroomt, was je de kolom 2x met 1 mL MACS-buffer. Verzamel de doorstroomvloeistof in een nieuwe 15 mL centrifugebuis.
    OPMERKING: De cellen in de doorstroomvloeistof zijn op dit moment CD4⁺CD25^– T-cellen.
11. Koppel de MS-kolom los van de magnetische scheider en plaats deze boven een verse 15 mL centrifugebuis. Voeg 1 mL MACS-buffer toe aan de kolom en druk vervolgens direct de zuiger in om de magnetisch bead-gelabelde CD4⁺CD25⁺ Treg-verrijkte cellen terug te halen.
12. Na het tellen van de cellen, centrifugeer je de suspensie en verwijder je het supernatant. Suspendeer de pellet opnieuw in voldoende kweekmedium om een uiteindelijke concentratie van 2 × 10 cellen van⁶ ml te verkrijgen, en houd de buis op ijs.
    OPMERKING: Deze cellen zijn CD45.1⁺CD4⁺CD25⁺ Treg-verrijkte cellen. Gewoonlijk kunnen ongeveer 8 × 10⁵ tot 1 × 10⁶ CD4⁺CD25⁺ cellen worden gezuiverd met één muis; Opname van perifere lymfeklieren kan de opbrengst verhogen.
13. Bepaal de zuiverheid van de geïsoleerde CD4⁺CD25⁺ Treg-verrijkte cellen: Neem respectievelijk 5 × 10⁴ geïsoleerde CD4⁺CD25⁺ Treg-verrijkte cellen en 5 × 10⁴ geïsoleerde APC-verrijkte niet-CD4⁺ cellen, en susseer ze opnieuw in 50 μL antistofoplossing.
    OPMERKING: Bereid de antilichaamoplossing voor door het anti-muis CD4 PerCP-Cy5.5 antilichaam en het anti-muis CD25 PE-antilichaam toe te voegen aan de FACS-buffer in een verhouding van 1:100. Gebruik hier hetzelfde anti-muis CD25 PE-antilichaam om te bevestigen dat de CD4⁺CD25⁺ -cellen adequaat gelabeld zijn en dat er geen CD4⁺CD25⁺ T-cellen in de niet-CD4⁺ fractie aanwezig zijn. Voor een strengere identificatie van Trog-cellen kan intracellulaire kleuring met een anti-muis Foxp3 PB-antilichaam ook worden uitgevoerd.
14. Na de 20 minuten incubatie bij 4 °C in het donker, voeg je 2 mL FACS-buffer toe om de cellen te wassen. Centrifugeer de cellen, verwijder het supernatant en suspendeer de pellet opnieuw in 200 μL FACS-buffer.
15. Detecteer de zuiverheid van de monsters met flowcytometrie.
    OPMERKING: De frequentie van CD4⁺CD25^+- cellen moet ≥ 95% zijn om te waarborgen dat de zuiverheid van de Treg-verrijkte celpopulatie voldoet aan de experimentele eisen (Figuur 2). Niet-CD4⁺ cellen die als APC-verrijkte fractie worden gebruikt, mogen niet meer dan 5% CD4⁺ T-cellen bevatten (Figuur 2).

6. Labeling van naïeve CD4⁺ T-cellen met celproliferatiekleurstof

OPMERKING: Alle centrifugatiecondities zijn 4 °C, 350 × g gedurende 7 minuten. De PBS-buffer is vooraf in kamertemperatuur geïnvestibreerd vóór gebruik. Het labelproces wordt uitgevoerd onder lichtbescherming om afkoeling van de kleurstof te voorkomen.

1. Neem de naïeve CD4⁺ T-celsuspensie, centrifugeer, gooi het supernatant weg en verkrijg de celpellet.
2. Verdun de celproliferatiekleurstof eFluor 450 in PBS om een concentratie van 20 μM bij kamertemperatuur te verkrijgen.
3. Voeg 0,5 mL PBS toe per 1 × 10^cellen. Houd de buis ongeveer 45° gekanteld en laat de cellen voorzichtig opnieuw suspenderen door 50 keer omhoog en omlaag te pipetten.
4. Voeg snel een gelijke hoeveelheid celproliferatiekleurstofoplossing toe aan de celsuspensie, zodat de uiteindelijke concentratie van de celproliferatiekleurstof 10 μM is. Houd de buis ongeveer 45° gekanteld en meng de cellen door 50x op en neer te pipetteren om volledig contact tussen de cellen en de celproliferatiekleurstof te garanderen.
5. Wikkel de centrifugebuis onmiddellijk in aluminiumfolie om lichtblootstelling te voorkomen. Broed 20 minuten op kamertemperatuur. Draai de cellen voorzichtig elke 5 minuten in vortex om celaggregatie te voorkomen.
6. Voeg 10 ml voorgekoeld celkweekmedium toe aan de centrifugebuis, vortex voorzichtig om de kleuring te beëindigen, centrifugeer dan en gooi het supernatant weg.
7. Voeg 5 ml voorgekoeld celkweekmedium toe aan de celpellet, centrifugeer en gooi het supernatant weg om de cellen te wassen.
8. Voeg opnieuw 5 ml voorgekoeld celkweekmedium toe aan de celpellet en laat de cellen opnieuw ophangen.
9. Tel de cellen, centrifugeer en gooi het supernatant weg, suspendeer de cellen opnieuw in een geschikt volume kweekmedium om een celconcentratie van 2 × 10⁶ cellen/mL te bereiken, en houd de buis op ijs.

7. Opzetten van de in vitro functionele analyse van Treg-cellen

1. Bereken het aantal monsters dat nodig is voor de celkweek, bereid een geschikte hoeveelheid celkweekmedium voor met 2,5 μg/mL antimuis CD3-antilichaam of de aangegeven inductiecytokines, en vortex voorzichtig de voorbereide CD45.2⁺CD4⁺CD62L⁺ naïeve T-cellen, CD45.1⁺CD4⁺CD25⁺ Treg-verrijkte cellen en APC-verrijkte niet-CD4⁺ cellen.
   OPMERKING: Gebruik CD45.2⁺CD4⁺CD62L⁺ naïeve T-cellen als responder T (Tresp) cellen. Dit voorbeeldexperiment bestudeert het effect van Treg-cellen op de differentiatie en proliferatie van Th1- en Th17-cellen. Daarom zijn er in totaal vier monsters voor de celkweek: Tresp-cellen gekweekt onder Th1- of Th17-inductiecondities, in afwezigheid of aanwezigheid van Treg-verrijkte cellen.
2. Voeg 100 μL CD45.2⁺CD4⁺ naïeve T-cellen toe (2 × 10 5-cellen per put) aan de 48-wellplaat.
3. Voeg 100 μL CD45.1⁺ APC-verrijkte niet-CD4⁺ cellen toe (1 × 10^{6 cellen} per put) aan de 48-put plaat.
4. Voeg 100 μL CD45.1⁺CD4⁺CD25⁺ Treg-verrijkte cellen (2 × 105^cellen per put) toe aan de experimentele putten, en voeg 100 μL celkweekmedium toe aan de controleputten. De Treg-verrijkte cel:Tresp-verhouding in de experimentele monsters is 1:1.
   OPMERKING: De verhouding van Treg cellen tot Tresp cellen kan naar behoefte worden ingesteld, of een paneel met meerdere verhoudingen kan worden ontworpen. Het aantal Tresp-cellen wordt vastgelegd in de co-kweek, terwijl het aantal Treis-cellen indien nodig kan worden aangepast. Typisch zijn de verhoudingen van Treg tot Tresp in de experimentele monsters 1:1, 1:2, 1:4, 1:8, 1:16 en 0:1. Bovendien kan elke experimentele voorwaarde in drievoud worden voorbereid om willekeurige experimentele fouten te minimaliseren. Hier, voor de duidelijkheid, wordt op basis van eerdere onderzoekservaringen ^15,16 een 1:1-verhouding als voorbeeld gebruikt.
5. Voeg 100 μL celkweekmedium toe met 2,5 μg/mL anti-muis CD3-antilichaam aan elke put.
   OPMERKING: De uiteindelijke concentratie van het anti-muis CD3-antilichaam is 0,5 μg/mL. Naast de experimentele monsters wordt een blanco controlemonster geplaatst zonder anti-muis CD3-antilichaam. Voeg in dit monster 100 μL T-celkweekmedium toe zonder antimuis CD3-antilichaam om de fluorescentieintensiteit van de niet-geprolifereerde T-cellen te bepalen, of de intensiteit van piek 0. Dit maakt nauwkeurige kalibratie van de proliferatieverdeling mogelijk.
6. Voeg 100 μL celkweekmedium met de aangegeven cytokines toe aan elke put om het uiteindelijke volume van elke put 500 μL te maken.
   OPMERKING: In dit experiment wordt recombinante muis IL-12 p70 met een eindconcentratie van 10 ng/mL gebruikt om Th1-cellen te induceren, en recombinante menselijke TGF-β1 bij een eindconcentratie van 2 ng/mL en recombinante muis IL-6 bij 50 ng/mL om Th17-cellen te induceren.
7. Voeg PBS toe aan de resterende lege putten (500 μL/put) om de luchtvochtigheid van de plaat te behouden en de randeffecten te verminderen.
8. Incubeer de plaat met 48 putten in een 5% CO2-incubator bij 37 °C gedurende 3 dagen.
   OPMERKING: In dit co-kweeksysteem levert oplosbare anti-muis CD3-antilichaam het primaire T-celreceptor (TCR)-signaal voor T-celactivatie, en APC-verrijkte niet-CD4⁺ cellen geven costimulerende signalen om T-cellen volledig te activeren. TCR en costimulerende signalen kunnen ook worden getriggerd door plaatbedekte anti-muis CD3-antilichamen en oplosbare anti-muis CD28-antistoffen. Onderzoekers kunnen indien nodig de stimulatiemethode kiezen.

8. In vitro functionele analyse van Trog-cellen

OPMERKING: Alle centrifugatiecondities zijn 4 °C, 350 × g gedurende 7 minuten.

1. Pipetteer voorzichtig de gekweekte cellen om ze opnieuw te suspenderen en breng de suspensie over in een 1,5 mL centrifugebuis. Centrifugeer de cellen en verwijder het supernatant.
2. Voeg 500 μL celkweekmedium toe met 5 ng/mL PMA, 1 μg/mL ionomycine en 1:1.000 verdunde GolgiPlug Protein Transport Inhibitor aan elke buis, vortex de cellen voorzichtig te laten ophangen, en incubeer ze in een 5% CO2-incubator bij 37 °C gedurende 3 uur.
3. Centrifuge, gooi het supernatant weg, voeg 50 μL PBS toe met één test van Zombie Yellow kleurstof en 1:100 verdund anti-muis CD16/32 antilichaam aan elk monster, vortex, en incubeer op kamertemperatuur in het donker gedurende 15 minuten om dode cellen te labelen en Fc-receptoren te blokkeren.
4. Centrifugeer, verwijder het supernatant, voeg 50 μL oppervlakte-antistofcocktail toe, vortex, en incubeer bij 4 °C in het donker gedurende 20 minuten.
   OPMERKING: Voeg anti-CD4 PerCP-Cy5.5 antilichaam, anti-CD45.1 FITC antilichaam en anti-CD45.2 APC-eFluor 780 antilichaam toe aan de FACS buffer in een verhouding van 1:200 om de oppervlakte-antilichaamcocktail te bereiden.
5. Voeg 1 ml FACS-buffer toe aan elke centrifugebuis, centrifuge en verwijder het supernatant.
6. Voeg 300 μL fixatie- en permeabilisatieoplossing toe aan elke centrifugebuis, vortex, en incubeer bij 4 °C in het donker gedurende 20 minuten.
7. Voeg 1 mL van 1× Permeabilisatie/Wash (Perm/Wash) buffer toe aan elke centrifugebuis, centrifuge en verwijder het supernatant; Herhaal deze wasstap vervolgens één keer om volledige verwijdering van het resterende fixatiemiddel te garanderen.
8. Voeg 50 μL cytokine-antilichaamcocktail toe, vortex, en incubeer 40 minuten in het donker bij 4 °C.
   OPMERKING: Voeg anti-IFN-γ PE-antilichaam en anti-IL-17A PE-Cy7-antilichaam toe aan de Perm/Wash Buffer in een verhouding van 1:100 om de cytokine-antistofcocktail te bereiden.
9. Was elk monster met 1 mL Perm/Wash-buffer, centrifugeer de cellen en verwijder het supernatant. Zet de pellet opnieuw in 300 μL FACS-buffer.
10. Meet de proliferatie en differentiatie van Tresp-cellen met behulp van flowcytometrie. Gebruik de volgende gatingstrategie (Figuur 3): eerst gate-de lymfocytenpopulatie onder het totale aantal cellen en sluit celresten en onzuiverheden uit; ten tweede, de eencellige populatie onder de lymfocyten te gateren op basis van verstrooiingssignalen; ten derde, de levende celpopulatie onder de enkele cellen te gaten; ten vierde, de CD4⁺ T-celpopulatie onder de levende cellen te gaten; ten vijfde, de CD45.1⁺ Treg-verrijkte celpopulatie en CD45.2⁺ Teff-celpopulatie onder de CD4⁺ T-cellen; zesde, gate CD45.2⁺CD4⁺IFN-γ⁺ Th1-cellen, CD45.2⁺CD4⁺IL-17A⁺ Th17-cellen, en niet-geprolifereerde CD45.2⁺CD4⁺ T-cellen onder de CD45.2⁺ T-cellen.
11. Voer flowcytometriegegevens uit en analyseer de flowcytometriegegevens.
    1. Gebruik gekweekte T-cellen gelabeld met celproliferatiekleurstof eFluor 450 als celproliferatiekleurstof voor enkelgekleurde controle. Bereid de Zombie Yellow kleurstof voor als enkelgekleurde controle met gekweekte T-cellen die niet zijn gelabeld met celproliferatiekleurstof. Bereid de andere enkelgekleurde controles voor met compensatiekralen voor elke gebruikte fluorofor.
    2. Gebruik T-cellen die zijn gelabeld met celproliferatiekleurstof eFluor 450 en gekweekt zonder anti-muis CD3-antilichaam om de poort van niet-geproliferateerde cellen te definiëren.
    3. Gebruik gekweekte T-cellen gelabeld met celproliferatiekleurstof en gekleurd met Zombie Yellow kleurstof, alle celoppervlakteantilichamen en isotypecontroles van anti-muis IFN-γ PE-antilichamen en anti-muis IL-17A PE-Cy7 antilichamen om poorten van IFN-γ⁺CD4⁺ en IL-17A⁺CD4⁺ T-cellen te definiëren.

Resultaten

In het representatieve experiment werden naïeve T-cellen gebruikt als Tresp-cellen om de effecten van met Treg verrijkte cellen op de proliferatie en differentiatie van Th1- en Th17-cellen te onderzoeken. In dit experiment werden Tresp-cellen geactiveerd door anti-muis CD3- en APC-verrijkte niet-CD4⁺ cellen, en vervolgens gedifferentieerd tot Th1-cellen onder IL-12 p70-inductie of tot Th17-cellen onder TGF-β1 en IL-6 inductie. Onder deze twee inductiecondities werden veranderingen in de proliferatie en differe...

Discussie

In deze studie zijn de resultaten van de co-kweek onder Th1-inductiecondities consistent met eerdere rapporten dat Treg-cellen de proliferatie en differentiatie van Th1-cellen kunnen onderdrukken^17,18. Treg-verrijkte cellen remden ook de proliferatie van Tresp-cellen onder Th17-inductieomstandigheden. Echter, onder de hier gebruikte Th17-polarisatieomstandigheden nam de frequentie van IL-17A⁺ Tresp-cellen toe in aanwez...

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
1.5 mL centrifuge tube	Thermo Fisher Scientific	3457IW	of equivalent
12.5 μL Filtered Pipette Tips	Thermo Fisher Scientific	94420043	of equivalent
1250 μL Filtered Pipette Tips	Thermo Fisher Scientific	94420813	of equivalent
15 mL Conical Centrifuge Tubes	Thermo Fisher Scientific	339650	of equivalent
200 μL Filtered Pipette Tips	Thermo Fisher Scientific	94420318	of equivalent
48-well plates	Corning Incorporated	3548	of equivalent
5 mL syringe piston	Shifeng Medical	SB2-061(A)	of equivalent
50 mL Conical Centrifuge Tubes	Thermo Fisher Scientific	339652	of equivalent
50 μL Filtered Pipette Tips	Thermo Fisher Scientific	94420258	of equivalent
70 μm cell strainer	Biosharp Life Sciences	BS-70-CS	of equivalent
Anti-mouse CD28 antibody	BioXcell	BE0015-1	of equivalent
Anti-mouse CD3 antibody	BioXcell	BE0001-1	of equivalent
Anti-mouse CD4 PerCP-Cy5.5 (RM4-5)	Thermo Fisher Scientific	45-0042-82	of equivalent
Anti-mouse Foxp3 PB (FJK-16s)	Thermo Fisher Scientific	48-5773-82	of equivalent
Anti-mouse IFN-gamma PE (XMG1.2)	BioLegend	505808	of equivalent
Anti-mouse IL-17A PE-Cy7 (eBio17B7)	Thermo Fisher Scientific	25-7177-82	of equivalent
Beckman CytoFLEX S Flow Cytometer	Beckman Coulter	N/A	voor flow cytometrische data-acquisitie van immuuncelbeurtelingen
Bovine Serum Albumin (BSA)	Sigma-Aldrich	B2064	of equivalent
C57BL/6 mice	Shanghai Model Organisms Center, Inc	SM-001	voor isolatie van primaire lymfocyten en T-celsubsets
CD25 Monoclonal Antibody (PC61.5), PE	Thermo Fisher Scientific	12-0251-83	of equivalent
CD4+CD25+ Regulatory T Cell Isolation Kit, mouse	Miltenyi Biotec	130-091-041	voor celsortering
CD4+CD62L+ T Cell Isolation Kit, mouse	Miltenyi Biotec	130-106-643	voor celsortering
CD45.1 mice	Shanghai Model Organisms Center, Inc	NM-KI-210226	voor isolatie van primaire lymfocyten en T-celsubsets
CD45.1 Monoclonal Antibody (A20), FITC	Thermo Fisher Scientific	11-0453-85	of equivalent
CD45.2 Monoclonal Antibody (104), APC-eFluor 780	Thermo Fisher Scientific	47-0454-82	of equivalent
CD62L (L-Selectin) Monoclonal Antibody (MEL-14), FITC	Thermo Fisher Scientific	11-0621-85	of equivalent
Cytofix/Cytoperm Fixation/Permeabilization Solution Kit	BD Biosciences	554714	of equivalent
eBioscience Cell Proliferation Dye eFluor 450	Thermo Fisher Scientific	65-0842-90	of equivalent
ethylenediamine tetraacetic acid (EDTA)	Solarbio Life Sciences	E1170	of equivalent
Fetal Bovine Serum	Thermo Fisher Scientific	A5669701	of equivalent
FlowJo 10.6.2	BD Biosciences	N/A	software voor flowcytometrie data-analyse
Golgi-Plug Protein Transport Inhibitor	BD Biosciences	555029	of equivalent
HEPES (1 M)	Thermo Fisher Scientific	15630080	of equivalent
Human TGF-beta1	PEPROTECH	100-21C	of equivalent
Ionomycin calcium salt	Millipore Sigma	I3909	of equivalent
LD Columns	Miltenyi Biotec	130-042-901	voor celsortering
L-Glutamine (200 mM)	Thermo Fisher Scientific	25030081	of equivalent
LS Columns	Miltenyi Biotec	130-042-401	voor celsortering
MACS MultiStand	Miltenyi Biotec	130-042-303	voor celsortering
MS Columns	Miltenyi Biotec	130-042-201	voor celsortering
OctoMACS Separators	Miltenyi Biotec	130-042-109	voor celsortering
PBS, pH 7.4	Thermo Fisher Scientific	10010049	of equivalent
PE Rat IgG1, κ Isotype Ctrl Antibody	BioLegend	400408	of equivalent
PE/Cyanine7 Rat IgG2a kappa Isotype Control Antibody	Thermo Fisher Scientific	25-4321-82	of equivalent
Penicillin-Streptomycin	Thermo Fisher Scientific	15140122	of equivalent
PMA	Millipore Sigma	P8139	of equivalent
Purified anti-mouse CD16/32 Antibody	BioLegend	101302	of equivalent
QuadroMACS Separator	Miltenyi Biotec	130-090-976	voor celsortering
Recombinant mouse IL-12 p70	PEPROTECH	210-12	of equivalent
Recombinant Mouse IL-6	R&D Systems	406-ML	of equivalent
Red Blood Cell Lysis Buffer (ACK Lysing Buffer)	Thermo Fisher Scientific	A1049201	of equivalent
RPMI 1640 medium	Thermo Fisher Scientific	11875093	of equivalent
Sodium Pyruvate (100 mM)	Thermo Fisher Scientific	11360070	of equivalent
Trypan Blue Solution, 0.4%	Thermo Fisher Scientific	15250061	of equivalent
UltraComp eBeads Compensation Beads	Thermo Fisher Scientific	01-2222-42	of equivalent
Zombie Yellow Fixable Viability Kit	BioLegend	423104	of equivalent
β-Mercaptoethanol	Sigma-Aldrich	M3148	of equivalent