Hoogdoorvoerscreening van L-melkzuur-hyperproducerende bacilluscoagulansmutanten met behulp van een geautomatiseerd druppel-microflufluïdisch platform

Samenvatting

Dit protocol biedt een standaard high-throughput screeningworkflow voor industriële micro-organismen. Het omvat het construeren van een mutantenbibliotheek via ARTP-mutagenese, het uitvoeren van positieve druppelscreening met geautomatiseerde microfluidica en vervolgens het verifiëren van de resultaten. De betrouwbaarheid van de workflow werd gevalideerd door het screenen van krachtige B. coagulans-stammen .

Samenvatting

Industriële bioproductie is afhankelijk van micro-organismen om doelproducten efficiënt te synthetiseren onder gemanipuleerde omstandigheden. Wildtype-stammen hebben echter vaak niet de capaciteit om dit te doen vanwege hun eigen metabole netwerken. Daarom is het snelle en nauwkeurige screenen van high-performance stammen uit grootschalige mutantenbibliotheken een cruciale stap in industriële microbiële veredeling. In de afgelopen jaren heeft druppelmicrofluïdische technologie veel aandacht getrokken vanwege de hoge doorvoersnelheid, lage verbruik en single-cell compartmentalisatiecapaciteiten, wat heeft geleid tot de ontwikkeling van talrijke single-cell sorteersystemen. In deze studie wordt een high-throughput screeningprotocol voor industriële microbiële stammen met behulp van een geautomatiseerd druppel-microfluïdisch platform gepresenteerd. De geïntegreerde workflow bestaat uit vier hoofdfasen: de opbouw van een mutantenbibliotheek via atmosferische en kamertemperatuurplasma (ARTP) mutagenese; hoogefficiënte eencel-inkapseling en gecontroleerde microcultivatie binnen picoliter-schaal druppels; precieze pico-injectie van een fluorescerende biosensor, gevolgd door fluorescentie-geactiveerde druppelsortering (FADS) om druppels met hoogproducerende varianten te isoleren; en validatie van de gesorteerde kandidaatstammen via microplate en shake-flask fermentatie. Een volledige en geïntegreerde screeningsworkflow is bedoeld als een gestandaardiseerd sjabloon, en de validatie ervan wordt aangetoond door de isolatie van hoogopbrengstige L-melkzuurproducerende mutanten van B. coagulans , als specifiek voorbeeld. Dit geautomatiseerde, hoogdoorvoer-screeningsplatform biedt een krachtige technische oplossing met aanzienlijk potentieel om de industriële kweek van high-performance stammen te versnellen.

Inleiding

Industriële biotechnologie gebruikt micro-organismen en enzymen als biokatalysatoren om waardevolle producten op grote schaal te produceren. Deze aanpak wordt als milieuvriendelijker en efficiënter beschouwd dan traditionele chemische productie. De natuurlijke metabole netwerken van micro-organismen zijn echter geëvolueerd om hun eigen overleving en voortplanting te prioriteren boven de efficiënte synthese van producten die mensen wensen. Daarom is microbiële veredeling met hoge doorvoer vaak noodzakelijk om te voldoen aan de eisen van industriële productieomgevingen met strikte voorwaarden ^1,2,3. Dit proces omvat het snel construeren van grootschalige microbiële mutantenbibliotheken via fysische of chemische mutagenese, gevolgd door het cultiveren en fenotypische detectie van mutanten met verschillende genotypen. Slechts een klein deel van de superieure stammen wordt dan geselecteerd. Traditionele plaat- en microplaatgebaseerde screeningstechnologieën worden echter belemmerd door omslachtige procedures, lage doorvoer en hoge kosten. Deze bottleneck, samen met het aanzienlijke verbruik van verbruiksartikelen en reagentia, resulteert in een lage algehele efficiëntie van microbiële voortplanting ^4,5.

Druppelmicrofluidica is recentelijk naar voren gekomen als een transformerende oplossing voor deze uitdaging. In tegenstelling tot fluorescentie-geactiveerde celsortering (FACS), die niet geschikt is voor het screenen van afgescheiden producten vanwege de snelle diffusie van moleculen weg van de cel, kapselt fluorescentie-geactiveerde druppelsortering (FADS) individuele cellen in picoliterschaal, gecompartimenteerde micro-reactoren ^6,7,8. Deze fysieke isolatie voorkomt stamconcurrentie, maakt lokale ophoping van afgescheiden metabolieten mogelijk en maakt hun kwantitatieve detectie mogelijk via fluorescerende biosensoren. Daarom heeft FADS zich bewezen als een ideaal platform voor high-throughput screening van diverse extracellulaire producten, waaronder aminozuren, organische zuren en enzymen. Een team ontwikkelde de genetisch gecodeerde fluorescerende biosensor GECFINDER, en in combinatie met FADS screenden ze met succes stammen met hoge fenylalanineproductie en verbeterden de screeningsefficiëntie met meer dan 1000 keer⁹. Een andere groep vestigde een fluorescentie-geactiveerd druppelsorteerplatform gekoppeld aan een genetisch gecodeerde biosensor voor high-throughput screening van 3-dehydroshikiminezuurproducerende stammen in E. coli, en het geoptimaliseerde FADS-systeem verbeterde de screeningsefficiëntie aanzienlijk en maakte de isolatie van mutante stammen mogelijk met aanzienlijk verhoogde productie¹⁰. Sommige onderzoekers pasten FADS-technologie toe bij de engineering van Bst DNA-polymerase, en de verkregen mutanten met sterk verbeterde thermostabiliteit en strengverplaatsingsactiviteit werden verder toegepast op LAMP-detectie, wat de reactietijd verkortte van 40 minuten tot 10 minuten¹¹.

Toch blijft de vertaling van deze technologische vooruitgang naar routinematige industriële stroomontwikkelingen een uitdaging. Veel commerciële druppel-microfluidische systemen, ondanks hun geavanceerde hardware, missen een volledige, intuïtieve en reproduceerbare standaardprocedure die is afgestemd op microbieel fenotypisch screening. Om deze kloof te dichten, werd een geautomatiseerd druppel-microfluidisch platform ingevoerd dat modulaire vloeistofregeling, gebruiksvriendelijke software en gestandaardiseerd chipontwerp integreert, waarmee een ideale technische basis werd gelegd voor het opzetten van een volledig geïntegreerde screeningworkflow. Deze studie gebruikt de high-throughput screening van hoogopbrengst L-melkzuurproducerende B. coagulans als validatiegeval. Gebaseerd op een druppel-microfludiïdisch platform werd de volgende workflow opgezet, bestaande uit vier belangrijke sequentiële stappen: (1) de constructie van een diverse mutantenbibliotheek via atmosferische en kamertemperatuurplasma (ARTP) mutagenese; (2) hoogefficiënte eencel-inkapseling en gecontroleerde microcultivatie binnen druppels onder omstandigheden die geoptimaliseerd zijn voor de groei van B. coagulans en productie van L-melkzuur; (3) nauwkeurige pico-injectie van een L-lactaat-specifieke fluorescerende biosensor, gevolgd door snelle sortering van druppels die superieure producenten omsluiten; en (4) rigoureuze validatie van gesorteerde kandidaten via shake-flask fermentatie om verbeterde productie en genetische stabiliteit te bevestigen. Dit protocol is bedoeld voor onderzoekers en ingenieurs die zich bezighouden met industriële microbiële veredeling en een high-throughput screening van extracellulaire producten nodig hebben. Het is bijzonder geschikt voor kweekbare bacteriën die kleine molecuulmetabolieten of enzymen afscheiden. Het screeningsplatform moet uitgerust zijn met sensoren die compatibel zijn met de druppelmicro-omgeving om specifieke detectie van de doelmetabolieten mogelijk te maken. Voor stammen met speciale kweekvereisten (bijvoorbeeld strikte anaeroben) kunnen de kweekparameters worden aangepast om te optimaliseren en een speciale kweekstrategie vast te stellen. Door deze gesloten, gestandaardiseerde screeningsworkflow op te zetten, wil deze studie een krachtige en overdraagbare oplossing bieden om de industriële kweek van stammen te versnellen.

Protocol

Ethische goedkeuring was niet vereist voor deze studie. Alle experimenten werden uitgevoerd met zuivere microbiële culturen, en er waren geen menselijke proefpersonen of proefdieren betrokken bij dit onderzoek. Zie de Materiaaltabel voor details over alle materialen die in het volgende protocol worden gebruikt.

1. Voorbereidingen

VOORZICHTIG: Volg bioveiligheidspraktijken. B. coagulans is een organisme van bioveiligheid niveau 1. Draag handschoenen en een labjas. Voer alle open manipulaties uit binnen een laminaire flow hood. Autoclaaf alle materialen die in contact komen met levende cellen bij 121 °C gedurende 20 minuten vóór verwijdering.

1. Bron en onderhoud van de spanning
   1. Koop B. coagulans ATCC 7050 bij een commercieel verzamelcentrum als een tweede generatie slantcultuur.
   2. Streep een lus van de schuine cultuur over de zaadmedium agar en incubeer bij 50 °C gedurende 24 uur. Kies een enkele kolonie, inoculeer deze in vloeibaar zaadmedium en kweek bij 50 °C, 200 toeren per minuut gedurende 12 uur.
   3. Meng de resulterende cultuur met steriele 40% glycerol tot een uiteindelijke concentratie van 25% (v/v) en bewaar als diepvriesvoorraad bij –80 °C. Voor elk experiment ontdooi je een verse aliquot, streep je deze op zaadmedium agar en breng je deze 24 uur uit bij 50 °C.
   4. Vervolgens kies je een enkele kolonie, inoculeer deze in vloeibaar zaadmedium en kweek je deze op 50 °C, 200 toeren per minuut gedurende 12 uur voordat je gebruikt voor mutagenese en screening (Aanvullende Figuur 1).
2. Melkzuursensor
   1. Druk de eLACCO1.1-sensor uit en zuiver deze zoals beschreven in de Aanvullende Materialen¹² (Aanvullende Figuur 2).
   2. Vul de gezuiverde sensor aan met 5% (v/v) glycerol en bewaar deze bij –80 °C. Voor elk experiment ontdooi je één aliquot op ijs en verdun deze onmiddellijk met steriele 10 mM PBS (pH 7,4) tot een uiteindelijke werkconcentratie van 0,1 mg/mL.
3. Bereiding van cultuurmedia
   1. Zaadmedium (g/L: glucose 20, gistextract 5, trypton 10, natriumacetat 2, natriumcitraat 2, K₂HPO₄ 2, MgSO_{4,7H 2}O 0,2, MnSO₄· H₂O 0,05, FeSO₄·7H₂O 0,01). Steriliseer glucose apart als een 200 g/L kolf bij 115 °C gedurende 20 minuten.
      1. Autoclave de resterende componenten bij 121 °C gedurende 15 minuten. Na afkoeling voeg je steriele glucosevoorraad toe tot een uiteindelijke concentratie van 20 g/L, waarna je de sporenelementen filter-steriliseert.
      2. Bewaar het volledige medium tot een week op 4 °C. Gebruik voor nachtelijke activatie, inoculumbereiding.
   2. Screeningsmedium (g/L: glucose 20, gistextract 6,66, NaCl 0,333, NH₄Cl 0,665, KH₂PO₄ 2, Na₂HPO₄ 4,46, MgSO₄ 0,12, CaCl₂ 0,074).
      1. Steriliseer de glucose apart op 115 °C gedurende 20 minuten. Autocaaf het zout/gistextractmengsel bij 121 °C gedurende 15 minuten.
      2. Voeg na het afkoelen de steriele glucosebouillon toe aan 20 g/L. Bewaar tot een week op 4 °C. Gebruik deze als waterige fase voor druppelvorming en als kweekmedium in druppels tijdens de 10 uur durende incubatie.
   3. Fermentatiemedium (g/L: glucose 90, trypton 13,33, gistextract 13,33, natriumacetat 0,67, NaCl 0,0133, MgSO₄·7H₂O 0,0133, MnSO₄· H₂O 0,0133, FeSO₄·7H₂O 0,0133).
      1. Steriliseer glucose als een 500 g/L kolon bij 115 °C gedurende 20 minuten. Autoclave de andere componenten op 121 °C gedurende 15 minuten.
      2. Voeg na het afkoelen de steriele glucosebouillon toe aan 90 g/L. Voeg vlak voor de inoculatie steriel CaCO_3-poeder (4% w/v) toe om de pH te bufferen. Bereid dagelijks vers voor. Gebruik voor microplate primaire screening en validatie van shake-flask.
         OPMERKING: Bereid alle media voor met gedestilleerd water tot een eindvolume van 1 L. Stel de pH aan naar 6,5 met 1 M HCl.

2. Constructie van een mutantenbibliotheek met behulp van ARTP

VOORZICHTIG: ARTP-werking omvat een hoogfrequente plasma en een UV-lamp. UV-straling kan oog- en huidschade veroorzaken. Plasma-ontlading veroorzaakt ozon en hoge temperaturen. Houd de kamerdeur altijd gesloten terwijl plasma aan staat. Draag een labjas en een UV-blokkerende bril. Gebruik slechts 99,999% zuiver helium; Zorg voor voldoende ventilatie. Na elke mutagenese-operatie veeg je de werkbank en de binnenwanden van de mutagenesekamer af met een pluisvrije doek gedoopt in 75% (v/v) ethanol. 75% ethanol is zeer brandbaar. Blijf uit de buurt van open vlammen, vonken en hete oppervlakken.

1. Stel een standaardcurve vast die OD₆₀₀ correleert met de levensvatbare celconcentratie.
   1. Inoculeer een enkele kolonie van B. coagulans in zaadmedium en broed uit bij 50 °C, 200 toeren per minuut gedurende 12 uur totdat de cultuur de midden-logaritmische fase bereikt.
   2. Bereid seriële verdunningen van de bacteriële suspensie voor bij gradiënten van 10⁴, 10⁵ en 10⁶.
   3. Pipetteer 100 μL van elke verdunning en verspreid gelijkmatig op de agarplaten van het zaadmedium in drievoud van drie.
   4. Incubeer alle geplateerde agarplaten bij 50 °C gedurende 24 uur.
   5. Tel de kolonievormende eenheden (CFU) voor elke verdunning.
      OPMERKING: Kalibratie toont aan dat OD₆₀₀ = 0,5 ongeveer overeenkomt met 1 × 10⁸ CFU/mL. Gebruik deze relatie om de initiële celdichtheid voor druppelencapsulatie te bepalen (Aanvullende Figuur 3).
2. Kweek B. coagulans tot de midden- tot laat-logaritmische fase en verdun vervolgens de verse zaadcultuur tot OD₆₀₀ = 0,05 in vers zaadmedium.
3. Binnen een laminaire flow hood bereid je acht steriele kleine metalen schijfjes en één grote metalen schijf voor. Vlam de acht kleine schijfjes 1 minuut op een alcoholbrander, plaats ze op de steriele grote schijf en laat ze 10 minuten afkoelen.
4. Met een micropipet wordt 10 μL van de verdunde bacteriële suspensie gelijkmatig verdeeld op elk van de acht gekoelde kleine schijfjes.
5. Breng de grote schijf met de ingeënte kleine schijfjes over in een steriele petrischaal.
6. Zet het ARTP-instrument aan en activeer het hoofdbedieningsscherm. Zet de UV-lamp aan in de mutagenesekamer. Start de koeler en koel het 20 minuten voor tot de temperatuur stabiel is op 20 °C.
7. Open snel de deur van de mutagenesekamer en plaats de kleine schijfjes erin.
8. Met behulp van steriele tangen wordt elke kleine schijf sequentieel overgebracht naar de ARTP-monsterfase.
   OPMERKING: Het RF-vermogen, heliumgasstroom, afstand tussen nozzle en monster en heliumzuiverheid werden respectievelijk vastgesteld op 120 W, 10 SLM, 2 mm en 99,999%. De heliumbestralingstijd was respectievelijk ingesteld op 5, 10, 15, 20, 25 en 30 seconden.
9. Onderwerp elke kleine schijf aan ARTP-mutagenese volgens de gestelde parameters. Na bestraling worden alle schijven overgebracht in een 50 mL centrifugebuis met 10 mL terugwinningsmedium. Incubeer bij 50 °C en schud op 200 rpm gedurende 4 uur om celherstel en uitgroei mogelijk te maken.
10. Bepaling van de dodelijkheidskans.
    1. Verdunn de teruggewonnen cultuur serieus tot een gradiënt van ^10-2 tot ^10-6.
    2. Verspreid 100 μL van elke verdunning op agarplaten van zaadmedium en bereid drie replica's voor elke verdunning voor.
    3. Incubeer alle platen op 50 °C gedurende 24 uur.
    4. Tel de kolonies en bereken de bijbehorende CFU/mL.
    5. Bereken de dodelijkheidsgraad met behulp van de formule:
       (1)
       OPMERKING: Voer het experiment driemaal uit voor elk tijdstip. De optimale mutagenesetijd voor ARTP in dit geval is 20 s (Aanvullende Figuur 4).

3. Samenstelling van het geautomatiseerde druppel-microfluïdische platform en verbruiksmaterialen

1. Actuatiesysteem (Figuur 1)
   OPMERKING: Het bestaat uit 3 kanalen van hoogprecisie-drukregelaars met een drukbereik van 0–1000 mbar en een drukresponstijd van < 50 ms (Figuur 1A).
2. Beeldvormingssysteem
   OPMERKING: Snelle CMOS-microscopische beeldvorming beschikt over een snelle beeldgegevensopname van ≥ 2 GB/s, een framerate van 0–20.000 fps en een maximale resolutie van 1280 x 860. Het systeem beschikt over autofocus voor realtime observatie van druppelbewegingen en ondersteunt het opnemen van beelden en video's, die in meerdere formaten kunnen worden geëxporteerd, waaronder BMP, AVI, MP4 en TIF.
3. Detectiesysteem
   OPMERKING: Het maakt fluorescentiesignaaldetectie mogelijk met 2 lasers: 488 nm en 633 nm, en 2 detectiekanalen.
4. Hostbesturingssysteem
   OPMERKING: Aangestuurd door de geautomatiseerde druppel-microfluidische platformsoftware, integreert het systeem meerdere modules, waaronder vloeistofactuatie, microscopische beeldvorming, excitatie en detectie, druppelgeneratie, pico-injectie en sortering. Het ondersteunt ook het verwerven, registreren, opslaan, weergeven en exporteren van experimentele gegevens. Gedeeltelijke bedieningsunits van het geautomatiseerde druppel-microfludiïdische platform zijn weergegeven (Figuur 1B).
5. Verbruiksartikelen
   OPMERKING: De verbruiksmaterialen die in dit protocol worden gebruikt omvatten: injectiebuis voor oliefase, monster en reagens (Figuur 2A); verzamelbuis voor druppelincubatie (Figuur 2B); druppelgeneratiechip (Figuur 2C); druppel-pico-injectiechip (Figuur 2D); en druppelsorteringschip (Figuur 2E).

4. Druppelgeneratie

VOORZICHTIG: Maak het geautomatiseerde druppel-microfludiïdische platform schoon. Na elk experiment veeg je het podium, de chiphouder en eventuele morsplekken met 75% ethanol met pluisvrije doekjes. Verwijder restgefluoreerde olie, celsuspensie of sensoroplossing.

1. Eencel-inkapseling. Om λ = 0,1 in 14 pL druppels te verkrijgen, verdun je de bacteriële suspensie tot OD₆₀₀ ≈ 0,04 (OD₆₀₀=0,5 komt overeen met 1 × 10⁸ CFU/mL). Volgens de Poisson-verdeling:
   (2)
   Wanneer λ = 0,1 is, is 90,5% van de druppels leeg, bevat 9,1% één enkele cel en 0,4% meerdere cellen.
   OPMERKING: In dit geval was de gemeten single-cel encapsulatie-efficiëntie 11,2% (Aanvullende Figuur 5). Het aantal cellen per druppel kan worden bepaald door DAPI-kleuring. Wanneer λ = 0,1 en de multicel-inkapselingssnelheid meer dan 1% bedraagt, moet de OD₆₀₀₀ worden verlaagd om het aandeel druppels met meerdere cellen te verlagen.
2. Pipette 300 μL gefluoreerde olie in het oliefase-inlaatflesje. Pipette 500 μL van de bacteriële suspensie in het waterige fase-inlaatflesje.
3. Haal de tape los die het oppervlak van de druppelgeneratiechip bedekt. Verbind het oliebuisje, het monsterflesje en het verzamelflesje in volgorde met de bijbehorende putten van de chip.
4. Plaats de chip op het podium en zet hem vast. Verbind de luchtslangen één voor één met de inlaatflesjes volgens de gaspadlabels.
5. Open de software voor het geautomatiseerde druppel-microfluïdische platform. Stel de draaiknop van de podiumbeweging aan volgens de pijlrichting op de chip om het gezichtsveld naar de druppelgeneratieplaats te verplaatsen.
6. Klik op "Start" in de "Droplet Generation"-interface van de geautomatiseerde droplet microfluidic platformsoftware (Figuur 3A). In de beeldinterface sleep je de "Z-as" en lichtbronhelderheidsschuifregelaars om de beeldhelderheid en helderheid aan te passen.
7. Klik op de knoppen "+" en "-" van "Druppelsnelheid" en "Druppelgrootte" om de generatiesnelheid en druppelgrootte aan te passen.
   OPMERKING: In dit geval worden de oliefasedruk en de monsterfasedruk voor druppelgeneratie automatisch ingesteld op respectievelijk 300 mbar en 400 mbar, om een opwekkingssnelheid van 1500 Hz te bereiken. Onder deze instellingen zijn de druppels 14 pL in volume, waarbij de CV van de druppeldiameter onder de 5% blijft, wat zorgt voor een consistente druppelgrootte en betrouwbare downstream-operaties.
8. Wacht 1 minuut tot de apparatuur stabiel is en de druppelgeneratie consistent blijft. Vervang snel het verzamelflesje om te beginnen met het verzamelen van druppels.
   OPMERKING: Voeg vooraf een kleine hoeveelheid gefluoreerde olie toe aan de nieuwe verzamelbuis om de onderste poort van de teflonbuis te bedekken, zodat druppels niet direct in contact komen met de buiswand en fusie veroorzaken.
9. Stop met druppelverzameling na 30 minuten gebruik. Klik op "Stop" in het pop-up venster om te bevestigen dat je de druppelgeneratie stopt.
10. Verwijder voorzichtig de verzamelbuis van de chip. Plaats de buis en het afzuigflesje verticaal en wacht tot de druppels in de buis het afzuigbuisje binnenkomen.
11. Verwijder het chipje, het oliefase-inlaatflesje en het waterige fase-inlaatflesje van het podium. Veeg het podiumoppervlak af met 75% alcohol. De druppelgeneratiefase wordt vervolgens voltooid.

5. Druppeltje cultivatie

1. Voeg 1 ml minerale olie toe aan de verzamelbuis.
   OPMERKING: De minerale olielaag bedekt de druppelsuspensie om verdamping te minimaliseren en de blootstelling aan zuurstof te verminderen, terwijl er voldoende gasuitwisseling mogelijk is voor de facultatieve anaerobe B. coagulans.
2. Plaats de verzamelbuis rechtop in een 15 mL centrifugebuis met steriel water. Houd de verzamelbuis losjes afgesloten en incubeer op 45 °C gedurende 10 uur.
   OPMERKING: Na de incubatie moet je ervoor zorgen dat de CV van de druppeldiameter <10% is en dat er geen druppelcoalescentie wordt waargenomen. Gooi batches weg als aan deze criteria niet wordt voldaan.

6. Druppelpico-injectie

VOORZICHTIG: Er wordt tijdens pico-injectie hoge spanning op de chipelektroden aangelegd via de instrumentverbinding. Het elektrische veld kan een zware elektrische schok veroorzaken. Raak de elektroden of het chipoppervlak niet aan met metalen gereedschap of blote handen terwijl de hoge spanning actief is. Schakel altijd de hoogspanningsuitgang uit voordat je de chip aanraakt. Draag geïsoleerde handschoenen en gebruik niet-geleidend gereedschap.

1. Maak het oliefase-inlaatflesje klaar. In de laminaire flowkap pipetten 300 μL gefluoreerde olie in het oliefase-inlaatbuisje.
2. Maak het monsterinlaatflesje klaar. Verwijder de inlaatbuis van de opvangbuis waarin de druppels zitten. Vervang hem door een nieuwe dop.
3. Trim de punt van het nieuwe inlaatflesje af. Snijd een klein stukje van de voorkant van het nieuwe inlaatflesje zodat de punt onder het vloeistofniveau van de druppels in het monsterflesje komt.
4. Draai de dop strakker aan. Zet de dop stevig vast om lekkage te voorkomen.
5. Maak het flesje van de reagensinlaat klaar. Pipette 500 μL van de melkzuursensor in het flesje van de reagensinlaat.
6. Voeg PBS toe aan het flesje van de reagens-inlaat. Voeg tegelijkertijd 500 μL steriele PBS-buffer toe aan hetzelfde reagensinlaatflesje.
   OPMERKING: In dit experiment wordt een PBS-buffer toegevoegd om de pH van de druppels in balans te brengen. De uiteindelijke werkconcentratie van de lactaatsensor was 0,1 mg/mL, en het laadvolume van de lactaatsensor was 500 μL.
7. Gebruik een mes om door de tape te snijden die de elektrodeholtes bedekt om de elektroden bloot te leggen. Zet de multimeter op continuïteitsmodus en test de circuitverbinding en de kortsluitingsstatus van de chip.
   OPMERKING: Als de multimeter een normale circuitverbinding van de chipelektroden aangeeft, ga dan door naar de volgende stap. Als het circuit open is, vervang dan de injectiechip en test opnieuw.
8. Na het bevestigen van de normale circuitverbinding met de multimeter, haal je de tape van het chipoppervlak af. Verbind het oliebuisje, het monsterflesje, het reagensflesje en het verzamelvatvatje in volgorde op de overeenkomstige putten van de chip.
9. Plaats de chip op het podium en zet hem vast. Verbind de luchtslangen één voor één met de inlaatflesjes volgens de gaspadlabels.
10. Open de software voor het geautomatiseerde druppel-microfluïdische platform. Stel de draaiknop van de podiumbeweging aan volgens de pijlrichtingen op de chip om het gezichtsveld naar het elektrodegebied van de druppelchip te verplaatsen.
11. Klik op "Start" in de "Droplet Pico-injectie" interface van de geautomatiseerde druppelmicrofludiïdische platformsoftware (Figuur 3B). In de beeldinterface sleep je de "Z-as" en lichtbronhelderheidsschuifregelaars om de beeldhelderheid en helderheid aan te passen.
    OPMERKING: Op dit punt past het instrument automatisch de druk van de oliefasepomp aan naar 400 mbar, de druk van de monsterfase naar 420 mbar, en de druk van de reagentia-injectiefase pomp naar 450 mbar.
12. In de beginfase van de werking wordt een stuk lucht in de katheter in de chip afgevoerd, wat een normaal fenomeen is dat enkele minuten duurt.
13. Wacht tot druppels het gezichtsveld binnenkomen. Klik op "Start Pico-injectie". Op dat moment wordt het elektrische veld van de apparatuur geactiveerd. Pas de druppelgeneratiesnelheid, druppelafstand en injectievolume aan door op de knoppen "+" en "-" van "Druppelsnelheid", "Druppelafstand" en "Injectievolume" te klikken.
    OPMERKING: Het elektrische veld is ingesteld op de standaard maximale versnelling. Als druppels breken in het elektrische veldgebied tijdens het fusieproces, schakel dan over op medium of lage versnelling. In dit geval was de druppelinjectiesnelheid 200 Hz.
14. Let op in de hogesnelheidsbeeldweergavesoftware. Als druppels stabiel in de melkzuursensor kunnen worden geïnjecteerd in een verhouding van 1:1, wacht dan 5 minuten tot de apparatuur stabiel is. Vervang snel het verzamelflesje om te beginnen met het verzamelen van druppels.
15. Na een stabiele injectie gedurende 2 uur, klik je op "Stop" om de druppelpico-injectie te beëindigen.
16. Verwijder voorzichtig de verzamelbuis van de chip. Plaats de buis en het afzuigflesje verticaal en wacht tot de druppels in de buis het afzuigbuisje binnenkomen.

7. Druppelsortering

VOORZICHTIG: De demulsator is een irriterend middel en kan huid- en oogirritatie veroorzaken. Het is ook schadelijk als het wordt ingeademd of doorgeslikt. Draag altijd geschikte persoonlijke beschermingsmiddelen (handschoenen, labjas, veiligheidsbril). Hanteer de demulsor in een goed geventileerde ruimte of een afzuigkap. Verzamel afvaldemulgator in een aparte, duidelijk gelabelde container. Giet niet door de gootsteen.

1. In de laminaire flow hood pipeteert u 300 μL gefluoreerde olie en voegt dit toe aan het oliefase-inlaatflesje. Vervang de inlaatbuis van de verzamelbuis met micro-geïnjecteerde druppels door een nieuwe dop.
   OPMERKING: Neem vóór het uitvoeren van druppelsorteerexperimenten 5 μL druppels en observeer deze onder een fluorescentiemicroscoop. Meet de diameter van minstens 200 druppels; Ga alleen door als het cv 10% <.
2. Gebruik een mes om door de tape te snijden die de elektrodeholtes bedekt om de elektroden bloot te leggen. Zet de multimeter op continuïteitsmodus en test de circuitverbinding en de kortsluitingsstatus van de chip.
3. Na het bevestigen van de normale circuitverbinding met de multimeter, haal je de tape van het chipoppervlak af. Verbind het oliebuisje, het monsterflesje en het sorteerverzamelingsflesje in volgorde met de bijbehorende putten van de chip.
4. Plaats de chip op het podium en zet hem vast. Verbind de luchtslangen één voor één met de inlaatflesjes volgens de gaspadlabels.
5. Open de hogesnelheidsbeeldsoftware. Stel de draaiknop van de podiumbeweging aan volgens de pijlrichtingen op de chip om het gezichtsveld naar het elektrodegebied van de druppelchip te verplaatsen.
6. Klik op "Start" in de "Droplet Sorting"-interface van de geautomatiseerde droplet microfluidic platformsoftware. In de beeldinterface sleep je de "Z-as" en lichtbronhelderheidsschuifregelaars om de beeldhelderheid en helderheid aan te passen.
   OPMERKING: Na het klikken op "Start" past het instrument automatisch de druk van de oliepomp aan naar 300 mbar en de druk van de monsterpomp naar 190 mbar, wat resulteert in een druppeldoorvoer van 100 Hz.
7. In de beginfase van de werking wordt een stuk lucht in de katheter in de chip afgevoerd, wat enkele minuten duurt en een normaal fenomeen is.
8. Klik om de "Laser" te selecteren en selecteer het 488 nm detectiekanaal.
   OPMERKING: Het experimentele personeel kan een 488 nm laser, een 633 nm laser of een combinatie van beide kiezen, afhankelijk van het experimentele detectieontwerp. Laservermogen: 20 mW.
9. Klik op "Data Recording". Het instrument zal druppelfluorescentiesignalen beginnen te ontvangen (Figuur 3C).
   OPMERKING: Verzamel fluorescentiesignalen van 50.000 tot 100.000 druppels; Het instrument sorteert automatisch de signaalwaarden en genereert een fluorescentie-signaalhistogram.
10. Op basis van het gegenereerde fluorescentiesignaalhistogram wordt de sorteerdrempel ingesteld op de bovenste 0,1% van de totale fluorescentiesignalen en druppels verzameld met fluorescentiesignaalwaarden boven deze drempel.
    OPMERKING: In dit geval was de sorteerpoort ingesteld om druppels met fluorescentieintensiteit > 2750 (a.u.) te verzamelen, wat overeenkwam met de top 0,1% van de druppels.
11. Klik opnieuw op "Data Recording". Het instrument zal de fluorescentiesignalen van de resterende druppels opnieuw opnemen en de doeldruppels sorteren op basis van de drempel die in sectie 7.10 is ingesteld.
    OPMERKING: De overige druppelsignalen worden ook automatisch gesorteerd en uitgezet als een fluorescentiehistogram.
12. Na het selecteren van het doeldruppelgebied zet u de "Sorteerschakelaar" in en stelt u de waarde "Afbuigkracht" in. De apparatuur begint met het sorteren van druppels.
    OPMERKING: Het instrument biedt drie selecteerbare niveaus van elektrische veldsterkte (Hoog, Middel, Laag). Voor druppels groter dan 30 μm, selecteer Hoog; voor druppels kleiner dan 25 μm, selecteer Medium of Laag. Dit zorgt voor stabiele doorbuiging en optimale sorteerefficiëntie.
13. Nadat de apparatuur 5 minuten stabiel is, plaats je het verzamelflesje terug om positieve druppels op te vangen.
    OPMERKING: Tijdens het sorteren meet het instrument continu de fluorescentieintensiteit van elke druppel in realtime en vergelijkt deze met de vooraf ingestelde drempel. Alleen druppels met fluorescentieintensiteit boven de drempel worden afgebogen en opgevangen in de positieve verzamelbuis. Een druppel wordt als positief beschouwd als het instrument een fluorescentiesignaal vertoont dat de sorteerdrempel overschrijdt en tegelijkertijd druppelafbuiging wordt waargenomen in de beeldvormingsinterface, waarmee wordt bevestigd dat de druppel succesvol in het positieve verzamelkanaal is geleid.
14. Stop met druppelsortering na 4 uur stabiele werking. Klik op "Stop" in de interface "Droplet Sorting".
15. Verwijder voorzichtig de verzamelbuis van de chip. Plaats de buis en het afzuigflesje verticaal om ervoor te zorgen dat de druppels in de buis het afzuigbuisje binnenkomen.
16. Nadat de druppelverzameling is voltooid, klik je op de verstrooiingsgrafiek om de verstrooiingsgrafiek van het experiment op te slaan, de fluorescentiesignaalwaarden van de gesorteerde positieve druppels en de fluorescentiesignaalwaarden van alle druppels.
17. Verwijder het chipje, het oliefase-inlaatflesje, het monsterflesje en het reagensflesje van het podium. Sluit de software.
18. Druppeldemulsificatie. Voeg 500 μL van 1H, 1H, 2H, 2H-perfluorooctanol toe aan de druppelverzamelbuis. Wacht 5 minuten, voeg dan 500 μL vers screeningmedium toe voor herstel.
    OPMERKING: Schud de verzamelbuis niet krachtig na het toevoegen van de demulsifier; Meng voorzichtig. Na druppeldemulsificatie zal er een heldere grens ontstaan tussen de waterige en oliefase.
19. Neem 20 μL van de gedemmulgiseerde bacteriële suspensie, verdun deze 10 keer en verspreid het over twee agarplaten. Incubeer 2 dagen op 50 °C.
    OPMERKING: De verdunningsfactor kan worden aangepast aan het aantal verzamelde druppels. In dit geval werden ongeveer 400 afzonderlijke kolonies verkregen van de twee platen.

8. Data-export

1. Klik op de fluorescentiesignaalplot in het lege gebied van de software-sorteerinterface. Selecteer om de druppelfluorescentiesignaalverstrooiingsplot, het fluorescentiesignaalhistogram en de fluorescentiesignaal Excel-spreadsheet op te slaan, die de geregistreerde fluorescentieintensiteitswaarden van het totale aantal druppels bevatten, evenals de fluorescentieintensiteitswaarden van de gescreende positieve druppels.

9. Microplate primaire screening

1. Kies willekeurig losse kolonies.
2. Inoculeer de 24-put diepe put plaat voor expansiecultuur. Kies elke geselecteerde kolonie en inoculeer deze in een put van een 24-put diepe put plaat met 2 mL fermentatiemedium. Gebruik een inoculatielus.
3. Sluit de 24-put diepe put plaat af met een niet-ademend membraan.
   OPMERKING: Gebruik geen ademend membraan. Het veroorzaakt verdamping van het kweekmedium.
4. Kweek de expansiecultuur. Plaats de afgesloten 24-put diepe put plaat in een schudincubator bij 50 °C, 200 tpm gedurende 24 uur.
5. Subcultuur voor fermentatievalidatie. Na 24 uur wordt 200 μL cultuur uit elke put overgebracht naar een verse diepputplaat met 24 putten die 1,8 mL fermentatiemedium bevat (10% v/v inoculum). Voeg steriel CaCO₃ toe aan een uiteindelijke concentratie van 4% (w/v) aan elke put vóór de inoculatie om de pH te bufferen.
6. Voeg de bedieningselementen toe. In elke verse 24-put diepe put plaat vul je drie willekeurig geselecteerde putten met de ouderlijke stam ATCC 7050 als negatieve controles. Verwerk ze identiek aan de kandidaatstammen.
7. Sluit de 24-put diepe put plaat af met een niet-ademend membraan.
8. Incubeer de 24-put diepe putplaat. Plaats de afgesloten plaat in een schudincubator bij 50 °C, 200 toeren per minuut gedurende 24 uur.
9. Bereid monsters voor voor lactaatdetectie. Centrifugeer de plaat op 5.842 × g gedurende 10 minuten. Breng 10 μL van het supernatant over naar een 96-put zwarte microplaat en verdun met 990 μL ultrazuiver water. Meng goed.
10. Voeg de lactaatsensor toe. Voeg 100 μL van het verdunde monster toe aan elke put van een verse 96-put zwarte plaat. Voeg dan 100 μL van de melkzuursensor toe. Meng voorzichtig.
11. Meet fluorescentie. Incubeer de plaat 5 minuten op kamertemperatuur (beschermd tegen licht). Meet fluorescentie met een microplaatlezer met excitatie bij 485 nm en emissie bij 515 nm.
12. Stel de drempel voor trefferselectie in. Bereken de gemiddelde fluorescentie van de drie ouderlijke controleputten (ouder) en de standaardafwijking (SD_parent). Definieer de drempel als F_parent + 3 × SD_parent.
13. Identificeer primaire treffers. Een kandidaat-strain wordt als een primaire treffer beschouwd als het fluorescentiesignaal de drempel overschrijdt. Noteer het aantal primaire hits voor downstream validatie.

10. Secundaire validatie van hoogrenderende stammen

VOORZICHTIG: De mobiele fase bevat verdund zwavelzuur (5 mM), dat corrosief is. Vermijd huidcontact en inademing. Draag geschikte persoonlijke beschermingsmiddelen (handschoenen, labjas, veiligheidsbril). Bereid de mobiele fase voor en behandel deze in een goed geventileerde ruimte of met een dampkap. Verzamel al het zuurhoudende afval in een speciale zuurafvalcontainer voor correcte verwijdering. Giet niet door de gootsteen.

1. Bereid de zaadcultuur voor. Streep de primaire slagen op de zaadmedium agarplaten. Incubeer bij 50 °C gedurende 24 uur. Kies een enkele kolonie van elke plaat en inoculeer die in 30 mL vloeibaar zaadmedium in een 250 mL shake-fles. Incubeer op 50 °C, 200 toeren per minuut gedurende 12 uur.
2. Zet de fermentatie op. Bereid het fermentatiemedium voor en voeg steriel CaCO3-poeder toe tot een uiteindelijke concentratie van 4% (w/v) als pH-neutralisator. Breng 5 mL van de zaadcultuur over in 45 mL van dit medium in een 250 mL Erlenmeyer-kolf (10% v/v inoculum; eindwerkvolume 50 mL).
   OPMERKING: Gebruik drie onafhankelijke kolven voor elke kandidaatstam en voor de ouderlijke stam ATCC 7050 als controle.
3. Bred de flessen uit. Plaats de flesjes in een schudderincubator op 50 °C, 200 toeren. Fermenteer 24 uur.
4. Verzamel monsters. Na 24 uur neem je 1 ml kweek uit elke fles. Centrifugeer op 13.800 × g gedurende 2 minuten. Verdun het supernatant 100 keer met ultrazuiver water en filter via een 0,22 μm spuitfilter.
5. Stel HPLC-voorwaarden in. Gebruik een Aminex HPX-87H kolom. Bereid mobiele fase voor: 5 mM H₂SO₄ in ultrazuiver water, filter door een membraan van 0,22 μm en ontgassing door sonicatie. Stel de kolomtemperatuur in op 40 °C, de debiet op 0,6 mL/min, het injectievolume op 20 μL en de gebruikstijd op 20 minuten per monster (melkzuur elueert bij ~12,600 minuten). Gebruik een brekingsindexdetector (RID).
6. Bereid de standaardcurve voor. Los calcium L-lactaat op in ultrazuiver water om standaardoplossingen van 0, 0,4, 0,8, 1,2 en 1,6 g/L (uitgedrukt als calcium L-lactaat) te bereiden. Injecteer elke standaard in drievoud uit.
   OPMERKING: Plot het piekoppervlak tegen concentratie en verkrijg de lineaire regressievergelijking (R² > 0,999). Voer standaarden uit aan het begin en einde van elke sample batch om drift te corrigeren.
7. Injecteer de monsters. Injecteer de gefilterde fermentatiesupernatanten (20 μL) in het HPLC-systeem. Noteer het piekgebied voor de calcium L-lactaat piek.
   OPMERKING: Injecteer elke 10 monsters een kwaliteitscontrolemonster (1 g/L calcium L-lactaat) om de stabiliteit van het systeem te monitoren. De acceptabele verschuiving in de retentietijd is <0,2 minuten en piekvariatie <5% vergeleken met de initiële kalibratiestandaard.
8. Bereken de opbrengst van het L-melkzuur. Interpoleer het piekoppervlak van elk monster in de standaardcurve om de calcium L-lactaatconcentratie (g/L) te verkrijgen.
   OPMERKING: Zet de L-melkzuurconcentratie om met behulp van de molecuulgewichtverhouding:
   (3)
   Bereken het verbeteringspercentage:
   (4)
9. Identificeer de uiteindelijke hoogrenderende stammen. Selecteer de stammen die consequent een hogere L-melkzuuropbrengst vertonen dan de ouderstam als gevalideerde mutanten. Kies de beste acteur voor verdere karakterisering.

11. Genetische stabiliteitsbeoordeling van hoogopbrengststammen

1. Streep de geselecteerde mutantstam op zaadmedium agarplaten. Incubeer bij 50 °C gedurende 24 uur. Dit is generatie 1.
2. Kies een enkele kolonie van de generatie 1-plaat en inoculeer die in 5 ml vloeibaar zaadmedium in een buisje van 50 mL. Incubeer bij 50 °C, 200 rpm gedurende 12 uur om de F1-zaadcultuur te verkrijgen.
3. Overbreng 10% (v/v) van de zaadcultuur van generatie 1 naar 50 mL fermentatiemedium (met 4% w/v steriel CaCO₃) in een 250 mL shake-fles. Incubeer bij 50 °C, 200 toeren per minuut gedurende 24 uur.
4. Verzamel 1 ml kweek na de fermentatie. Centrifugeer op 13.800 × g gedurende 2 minuten, verdun het supernatant 100 keer met ultrazuiver water en meet de concentratie L-melkzuur met HPLC. Gebruik drie onafhankelijke flessen per generatie.
5. Om de volgende generatie te verkrijgen, streep je een lus van de generatie 1-cultuur over een verse zaadmedium agarplaat. Incubeer bij 50 °C gedurende 24 uur. Herhaal stappen 11.2 en 11.3 voor generatie 2.
6. Herhaal het subcultureringsproces om generatie 3 en generatie 4 te verkrijgen. Bereid voor elke generatie drie shake-flesjes voor en meet de melkzuurproductie door HPLC.
7. Vergelijk de opbrengsten van de vier generaties (1–4) met behulp van een eenrichtings-ANOVA of Student's t-test. De stam wordt als genetisch stabiel beschouwd als er geen significant verschil (p > 0,05) in melkzuurproductie tussen generaties wordt waargenomen.

Resultaten

Gebaseerd op het geautomatiseerde druppel-microfluïdische platform werd een high-throughput screeningmodel opgezet. Een mutantenbibliotheek van B. coagulans werd geconstrueerd door ARTP-mutagenese met een optimale bestralingstijd van 20 seconden, wat een dodelijkheidsgraad van ongeveer 90% gaf (Figuur 4A). De mutante cellen werden vervolgens ingekapseld in druppels van 14 pL, ongeveer 30 μm in diameter, met een generatiesnelheid van 1500 Hz (Figuur 4B). Na incubatie bij 45 °C gedurende 10 uur werd de sensor met pico in elke druppel geïnjecteerd met een snelheid van 200 Hz (Figuur 4C). Fluorescentie-geactiveerde druppelsortering werd uitgevoerd bij 100 Hz met een laser van 488 nm (Figuur 4D). De gesorteerde positieve druppels werden gedeemulgeerd en losse kolonies werden geselecteerd voor validatie. De geplukte kolonies werden eerst gecultiveerd in 24-put diep-put platen met fermentatiemedium bij 50 °C en 200 rpm gedurende 24 uur. De fluorescentie van elke put werd gemeten met een microplaatlezer bij excitatie- en emissiegolflengtes van respectievelijk 485 nm en 515 nm. Klonen die fluorescentie vertoonden boven het gemiddelde van de ouderstam plus drie standaardafwijkingen werden geselecteerd. Deze kandidaten werden verder overgebracht naar 250 mL shake-flasks met een inoculum van 10% en onder dezelfde omstandigheden nog eens 24 uur gefermenteerd. De concentratie L-melkzuur werd uiteindelijk bepaald door hoogpresterende vloeistofchromatografie (Figuur 4E).

Om de haalbaarheid te valideren van het gebruik van een melkzuursensor voor het screenen van stammen met hoog L-melkzuur, werd de sensor eerst gekarakteriseerd. Om de haalbaarheid van de melkzuursensor voor detectie in microplaten te valideren, werden L-melkzuurstandaarden (1, 10, 100, 1000, 10000, 10000, 100000 μM) toegevoegd aan microtiterplaten, waarbij 100 μL van het melkzuursensormengsel aan elke put werd toegevoegd. De resultaten toonden aan dat de fluorescentieintensiteit toenam met een toename van de melkzuurconcentratie van 100 μM naar 10 mM. De sensor vertoonde sterke fluorescentieresponsen op zowel L-melkzuur (Figuur 5A). Desalniettemin blijft het om twee redenen volledig geschikt voor de huidige studie. Ten eerste is B. coagulans ATCC 7050 een goed gekarakteriseerde producent van L-melkzuur met verwaarloosbare vorming van D-melkzuur, zoals bevestigd door het door L-LDH gedomineerde metabole profiel. Ten tweede werd de nauwkeurigheid van de sensor voor de kwantificatie van L-melkzuur in daadwerkelijke fermentatiemonsters gevalideerd door vergelijking met HPLC (Figuur 5B). Daarom rapporteert de sensor, ondanks de in vitro kruisreactiviteit met D-melkzuur, betrouwbaar L-melkzuurniveaus in onze screeningsworkflow. Om de haalbaarheid van kwantitatieve melkzuurdetectie met de melkzuursensor te valideren, werden de herstelsnelheden van de sensor in zowel de waterige oplossing als het screeningsmedium gemeten. De resultaten toonden een hoog herstelpercentage van respectievelijk 108,81% in screeningsmedium en 98,39% in waterige oplossing, met relatieve standaarddeviaties < 5% (Figuur 5C). De lichte elevatie in medium ligt binnen het acceptabele bereik van 90–110%, wat wijst op geen significante matrixinterferentie. In microplaat-assays werd de sensor 1:1 gemengd met L-melkzuurstandaarden, 5 minuten geïncubeerd en vertoonde uitstekende lineariteit in het bereik van 0–0,6 g/L (Figuur 5D). Bovendien maakte de fluorescentiemethode het mogelijk om 96 monsters in 5 minuten te detecteren, wat een 384-voudige vermindering van de totale detectietijd vertegenwoordigt ten opzichte van HPLC. Om de haalbaarheid van de melkzuursensor in druppelgebaseerde screening verder te valideren, werden druppels met L-melkzuur in verschillende concentraties vervaardigd, en werd een gelijk volume van de melkzuursensor in elke druppel pico-geïnjecteerd. De fluorescentieintensiteit van de druppels werd gedetecteerd met behulp van het geautomatiseerde druppel-microfludiïdische platform. De resultaten toonden een significante verschuiving naar rechts van het fluorescentiesignaal met toenemende concentratie van L-melkzuur (Figuur 5E). Voor opslag werd de lactaatsensor aangevuld met 5% glycerol en opgeslagen bij -80 °C, wat de detectiestabiliteit minstens een maand behield (Aanvullende Figuur 6).

Naast het selecteren van een geschikte sensor voor fokkerij met FADS-technologie, is het bepalen van de optimale kweekduur van stammen in druppels cruciaal. Onvoldoende kweektijd kan leiden tot onvoldoende L-melkzuursecretie, wat resulteert in signalen met lage fluorescentie die geen onderscheid maken tussen hoge en lage opbrengst stammen. Omgekeerd kan een te lange kweektijd leiden tot overmatige L-melkzuurophoping, die het detectiebereik van de melkzuursensor overschrijdt. Om dit probleem aan te pakken, werd de kweekduur van stammen in druppels geoptimaliseerd door hun groeistatus dynamisch te monitoren. De stammen gingen de logaritmische groeifase in na 6 uur kweek in druppels, en de bacteriële biomassa in de druppels nam aanzienlijk toe na 10 uur (Figuur 6A). Daarentegen, wanneer de kweekduur meer dan 12 uur bedroeg, vertoonden de druppels duidelijke krimp. Dit fenomeen wordt toegeschreven aan osmotische drukveranderingen in de druppels tijdens het late stadium van de spanningsgroei, die druppelkrimp veroorzaken. Dergelijke krimp kan leiden tot inconsistente pico-injectievolumes tussen verschillende druppels in latere experimenten. Om de optimale kweektijd te bepalen, werd een gelijk volume van de melkzuursensor geïnjecteerd in druppels die voor verschillende duurheden werden gekweekt. Er werd vastgesteld dat het fluorescentiesignaal van de druppels na 10 uur kweek significant werd versterkt; daarom werd 10 uur gekozen als de optimale kweekduur voor spanningen in druppels (Figuur 6B).

In een enkele screeningsronde werden de druppels vervolgens gesorteerd met een sorteerchip met een snelheid van 100 Hz gedurende 4 uur, en de bovenste 0,1% druppels met de hoogste fluorescentieintensiteit werden verzameld (Figuur 6C). De positieve druppels werden verzameld in een steriele verzamelbuis en behandeld met 500 μL demulgator en 500 μL vers zaadmedium. Na zacht schudden gedurende 5 minuten werd 20 μL van de bovenste waterige fase genomen, tien keer verdund en verspreid over twee massieve agarplaten. Na incubatie bij 50 °C gedurende 2 dagen werden 200 afzonderlijke kolonies willekeurig geplukt en geïnënt in 24 diepe putplaten voor expansiecultuur. Van de 200 gekweekte klonen vertoonden 78 gemuteerde stammen hogere L-melkzuuropbrengsten dan de ouderstam (aanvullende figuur 7). Deze 78 mutanten werden vervolgens onderworpen aan shake-flask validatie, en uiteindelijk werden 17 stammen met verbeterde opbrengsten ten opzichte van de ouderstam verkregen. Van hen vertoonde mutant ADC-17 de grootste stijging, van 57,2 g/L naar 67,04 g/L, wat een verbetering van 17,2% vertegenwoordigt (Figuur 6D). De genetische stabiliteit van ADC-17 werd geëvalueerd over vier opeenvolgende generaties. Er werd geen significant verschil waargenomen tussen de vier generaties (p > 0,05), wat aangeeft dat de high-yield eigenschap van ADC-17 stabiel bleef over vier opeenvolgende subculturen (Figuur 6E). Deze resultaten tonen de efficiëntie en betrouwbaarheid van het FADS-platform aan, dat een melkzuursensor gebruikt om hoogopbrengststammen uit willekeurige mutantenbibliotheken in één screeningsronde te verrijken.

Figuur 1: Samenstelling van het geautomatiseerde druppel-microfluidische platform. (A) Interne structuur van het platform. Het bestaat uit vier kernmodules: drukgestuurde vloeistofregeling, hogesnelheids CMOS-beeldvorming, 488 nm/633 nm dual-laser fluorescentiedetectie en een hostbesturingssysteem voor druppelmanipulatie en data-uitvoer. (B) Het geautomatiseerde druppel-microfluïdische platform voor de bedieningsplatform. Gelabelde componenten zijn onder andere a. Plaatsingsplatform, b. Snelle camera, c. Chipelektroden, d. Chip Fixing Clamp, e. Chip Placement Groove, f. Metal Bath, g. Luchtpomp 1: Regelt de oliefase, h. Luchtpomp 2: Regelt het monster. Luchtpomp 3: Regelt de injectie van reagentia. Figuur 1A is gemaakt met behulp van Biorender, en er wordt een auteursrechtlicentie verstrekt. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 2: Experimentele verbruiksartikelen. (A) Injectiebuis: voor het injecteren van de oliefase, het monster van bacteriële suspensie en de reagensoplossing. (B) Verzamelbuis: voor het verzamelen van druppels en daaropvolgende teelt. (C) Druppelvoorbereidingschip: genereert 14 pL druppels. (D) Druppel-microinjectiechip: microinjecteert reagentia in druppels. (E) Druppelsorteringschip: sorteert positieve stammen via elektroden. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 3: Belangrijke software-interfaces van het geautomatiseerde druppel-microfluidische platform. (A) Introductie van de druppelgeneratie software-interface. A. Start: Klik om druppelgeneratie te starten. B. Snelheid: Pas de druppelgeneratiesnelheid aan. C. Grootte: Pas het volume van de druppel aan. D. Stop: Klik om druppelgeneratie te stoppen. (B) Druppelpico-injectie-interface. E. Injectievolume: Stel het volume van de reagensinjectie aan. F. Fusiekracht: Drie spanningsniveaus (Hoog/Middel/Laag). (C) Introductie van druppelsorteerinterface. G. Laser. Kies lasertype (488 nm of 633 nm). H. Data-opname. I. Afbuigkracht: Drie spanningsniveaus (hoog/middel/laag). J. Sorteerschakelaar: Klik om druppelsortering te starten. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 4: Screeningsworkflow met hoge doorvoer gebaseerd op het geautomatiseerde druppel-microfluidische platform. (A) Mutantenbibliotheekconstructie via ARTP-mutagenese. (B) Druppelgeneratie en incubatie. Enkele cellen zijn gecompartimenteerd in picolitredruppels. (C). Druppelpico-injectie. Een fluorescerende sensor wordt in elke druppel pico-geïnjecteerd. (D) Druppels sorteren. Druppels met hoge fluorescentie (wat wijst op een hoge productie van L-melkzuur) worden verrijkt met FADS. (E) Positieve kloonvalidatie in microplaten en schudkolven. Afkorting; FADS = Fluorescentie-geactiveerde druppelsortering. Figuur 4 is gemaakt met Biorender en er wordt een auteursrechtlicentie verstrekt. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 5: Karakterisering van de melkzuursensor in vitro. (A) Responsbereik van de melkzuursensor op L-melkzuur. Excitatie/emissie = 485/515 nm. Gemiddelde ± SD uit drie onafhankelijke experimenten (n = 3, elk met drievoudige technische replica's). (B) Correlatie met HPLC. Zes fermentatiemonsters (verschillende tijdstippen) werden elk één keer geanalyseerd door zowel de lactaatsensor als de HPLC. De lineaire regressie gaf R² = 0,9927. Excitatie/emissie = 485/515 nm. (C) Melkzuurherstelexperiment. L-melkzuur werd met 0,5 g/L in ultrazuiver water en screeningsmedium gespiked. De gegevens zijn gemiddelde ± SD (n = 3 onafhankelijke experimenten). Herstelcijfers waren 98,39% (water) en 108,81% (screeningsmedium), met SOA < 5%. Excitatie/emissie = 485/515 nm. (D) Optimalisatie van detectietijd. De sensor werd gemengd met L-melkzuurstandaarden (0–0,6 g/L) en geïncubeerd voor 0, 5, 10, 15, 20, 25 en 30 minuten. De hoogste R² = 0,990 werd behaald na 5 minuten mengen. De gegevens zijn afkomstig van drie onafhankelijke experimenten (n = 3). Excitatie/emissie = 485/515 nm. (E) Druppelfluorescentiehistogram. Er werden minstens 2000 druppels per L-melkzuurconcentratie geanalyseerd. Detectiekanaal: 488 nm, DC (V) = het spanningssignaal dat de fluorescentieintensiteit van een druppel vertegenwoordigt. Afkorting; STD = Standaarddeviatie. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 6: Hoogdoorvoerscreening van B. coagulans met een hoge productie van L-melkzuur. (A) Rekmorfologie binnen druppels werd waargenomen bij 0, 2, 4, 6, 8 en 10 uur. Schaalbalk: 20 μm. Blootstellingstijd: 100 ms. (B) Veranderingen in fluorescentieintensiteit van druppels met B. coagulans na incubatie voor verschillende duur, met injectie van de melkzuursensor. Beelden werden gemaakt met een belichtingstijd van 2000 ms en 1500% versterking. Schaalbalk: 50 μm. (C) Fluorescentie-intensiteitsverdeling van druppels. Screeningsdrempel: Intensiteit van de Vlucht > 2750 (a.u.). Detectiekanaal: 488 nm (D) L-melkzuur levert (g/L) van de ouderstam (ATCC 7050) en representatieve positieve mutanten. De gegevens zijn gemiddelde ± SD (n = 3 onafhankelijke shake-flasks per rek). p < 0,0001 vergeleken met de ouderlijke stam. De best presterende mutant, ADC-17, laat een stijging van 17,2% zien. (E) Genetische stabiliteit van de best presterende B. coagulans ADC-17 over vier opeenvolgende generaties (1–4). De opbrengsten van L-melkzuur werden bepaald door HPLC na 24 uur shake-flesfermentatie. De gegevens zijn gemiddeld ± SD (n = 3 flessen per generatie). Eenrichtings-ANOVA toonde geen significant verschil tussen generaties (p > 0,05, ns). Afkorting; HPLC = Hoogpresterende vloeistofchromatografie; SD = Standaarddeviatie. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Aanvullende Figuur 1: De zuivering van de lactaatsensor eLACCO1.1. Het eiwit werd geëlueerd met 500 mM imidazol en opgeslagen bij -80 °C met 5% glycerol. De werkconcentratie is 0,1 mg/mL, en de detectielimiet is 2 mg/L. Aanvullende Figuur 1 is volledig nagemaakt door de auteurs met alleen de native tekentools in Microsoft PowerPoint (inclusief basisvormen, lijnen en tekstvakken). Er werden geen pictogrammen, sjablonen of externe afbeeldingsbronnen van derden gebruikt. Alle elementen zijn originele creaties van de auteurs. Daarom vereist dit cijfer geen extra publicatielicentie. Klik hier om dit bestand te downloaden.

Aanvullende Figuur 2: Groeicurve van B. coagulans ATCC 7050. De stam werd gekweekt in zaadmedium bij 50 °C met schudden bij 200 rpm. De gegevens worden gepresenteerd als gemiddelde ± SD (n = 3 onafhankelijke kweeken). De cultuur bereikte de laat-logaritmische fase rond ongeveer 12 uur, en dit tijdstip werd gebruikt voor inoculumvoorbereiding in latere experimenten. Klik hier om dit bestand te downloaden.

Aanvullende Figuur 3: Kalibratiecurve van OD₆₀₀ versus levensvatbare celconcentratie voor B. coagulans ATCC 7050. Seriële verdunningen van een mid-log fasecultuur werden voorbereid en de OD₆₀₀ werd gemeten. Overeenkomstige kolonievormende eenheden (CFU/mL) werden bepaald door 100 μL geschikte verdunning te verspreiden op zaadmedium agarplaten en te incuberen bij 50 °C gedurende 24 uur. De gegevens worden gepresenteerd als gemiddelde ± SD (n = 3 onafhankelijke experimenten). Volgens deze curve komt OD₆₀₀ = 0,5 overeen met ongeveer 1 × 10⁸ CFU/mL. Deze kalibratie werd gebruikt om de initiële celdichtheid voor druppelencapsulatie te bepalen. Klik hier om dit bestand te downloaden.

Aanvullende Figuur 4: Dodelijkheidscurve van B. coagulans ATCC 7050 onder ARTP-mutagenese. Cellen werden gedurende verschillende periodes blootgesteld aan heliumplasma (5, 10, 15, 20, 25, 30 s). Na bestraling werden cellen op zaadmedium agar geplateerd, en CFU werden geteld na 24 uur incubatie bij 50 °C. Dodelijkheid (%) werd berekend volgens Vergelijking (2). De gegevens worden gepresenteerd als gemiddelde ± SD (n = 3 onafhankelijke replicata). De pijl geeft de geselecteerde mutagenesetijd (20 s) aan met een dodelijkheidsgraad van ongeveer 90%. Klik hier om dit bestand te downloaden.

Aanvullende Figuur 5: Bepaling van de efficiëntie van single-cel encapsulatie door DAPI-kleuring. B. coagulans ATCC 7050-cellen werden gekleurd met DAPI en ingekapseld in druppels bij λ = 0,1. In totaal werden 2000 druppels onderzocht met fluorescentiemicroscopie en werden het aantal druppels met 0, 1 of ≥2 cellen geteld. De waargenomen efficiëntie van single-cel encapsulatie was 11,2%, wat iets hoger is dan de theoretische Poisson-verwachting (9,0% voor λ = 0,1). Deze afwijking is toe te schrijven aan factoren zoals actieve celverspreiding, niet-specifieke DAPI-kleuring van gecompromitteerde cellen en door schuif veroorzaakte afbraak van kleine aggregaten tijdens druppelvorming. Schaalbalk: 30 μm. Er werden minstens 2000 microdruppels geanalyseerd. Beelden werden gemaakt met een belichtingstijd van 2000 ms en 1500% versterking. Afkorting; DAPI = 4′,6-diamidino-2-fenylindol. Klik hier om dit bestand te downloaden.

Aanvullende figuur 6: Stabiliteit van sensoropslag.  Toont de fluorescentierespons van de sensor opgeslagen bij -80 °C met 5% glycerol over vier weken. Er werd geen significant signaalverlies waargenomen, wat een goede opslagstabiliteit bevestigt (p > 0,05). Klik hier om dit bestand te downloaden.

Aanvullende Figuur 7: Primaire screeningsresultaten van 78 stammen die een hogere melkzuurproductie vertonen dan de controle in deep-well platen. In deze primaire screening werden in totaal 78 mutante stammen geïdentificeerd met L-melkzuuropbrengsten die hoger waren dan die van de ouderstam. Alle mutantenstamgegevens zijn single-point screeningresultaten zonder biologische replica's. De ouderstam (controle) werd willekeurig verdeeld over 24 diepe-putplaten als referentie, en de gegevens worden gepresenteerd als het gemiddelde ± standaarddeviatie over drie onafhankelijke 24-diep-putplaatreplicaten (n = 3). De y-as toont het L-melkzuuropbrengst (g/L) voor elke rek op de x-as; Foutbalken worden alleen weergegeven voor de ouderlijke rekcontrole. Klik hier om dit bestand te downloaden.

Discussie

Dit protocol biedt een gestandaardiseerde workflow voor industriële microbiële screening gebaseerd op een geautomatiseerd druppel-microfludiïdisch platform. De geïntegreerde workflow omvat de bouw van mutantenbibliotheken, druppelgeneratie en single-cel encapsulatie, microreactorcultivatie, biosensorinjectie, fluorescentie-geactiveerde druppelsortering en de uiteindelijke validatie van doelstammen. Met behulp van high-throughput screening van een hoogproductieve L-melkzuurproducerende B. coagulans als validatiegeval toonde deze workflow meerdere voordelen ten opzichte van conventionele microplaat- en agarplaatmethoden in de context van verbetering van de B. coagulans-stammen. Wat betreft screeningdoorvoer en efficiëntie maakt het platform gebruik van microfluïdische chips om duizenden tot tienduizenden druppels per seconde parallel te genereren en te verwerken, wat een ongeveer^10-4 keer toename van de screeningdoorvoer per enkele ronde behaalt vergeleken met traditionele microplaat-gebaseerde methoden¹². Voor B. coagulans kan de workflow binnen 4 uur 10 druppels van⁶ druppels screenen, waardoor de stamontwikkelingscyclus wordt verkort van enkele weken tot slechts enkele dagen en het voortplantingsproces aanzienlijk wordt versneld. De screeningsefficiëntie van het FADS-systeem is ongeveer 3 × 10^{3 keer zo} hoog als die van het plaatgebaseerde screeningsysteem, terwijl de kosten van infrastructuur, arbeid en verbruiksartikelen aanzienlijk worden^verlaagd. Echter, vanwege de inherente eigenschappen van verschillende micro-organismen is gerichte optimalisatie van deze standaardworkflow vereist. Zo leiden veranderingen in de osmotische druk na 36 uur gistteelt tot een vermindering van het druppelvolume, waardoor aanpassingen aan de incubatieduur nodig zijn om de stabiliteit van injectie- en sorteeroperaties^te waarborgen. Voor filamenteuze schimmels is het meestal nodig het druppelvolume te vergroten om te voorkomen dat het druppelinterface breekt of versmelt door myceliale groei^15,16.

Daarnaast is het, vanwege het ultrakleine volume van picoliter-druppels op schaal, essentieel om voor elk doelproduct op maat gemaakte fluorescerende biosensoren te ontwikkelen. Verschillende klassieke fluorescentiedetectiereagentia voor proteasen en kleine molecuulmetabolieten zijn al commercieel beschikbaar, zoals die voor waterstofperoxide¹⁷, glycosidase¹⁸, ethanol¹⁹ en glucose²⁰. Desalniettemin hebben chemisch gesynthetiseerde fluorescerende probes beperkte types en lekken ze vaak uit druppels in aangrenzende lege druppels, wat leidt tot verhoogde achtergrondfluorescentie. Dit wordt vooral toegeschreven aan het feit dat hydrofobe fluorescerende moleculen gemakkelijk de olie-watergrens²¹ kunnen doordringen.

In de afgelopen jaren bestaan biosensoren voornamelijk uit twee typen: genetisch gecodeerde biosensoren en op transcriptiefactor (TF)-gebaseerde biosensoren. Genetisch gecodeerde fluorescerende biosensoren verwijzen naar chimere eiwitten die intracellulair tot expressie kunnen komen en zo kunnen worden gemodificeerd dat ze dienen als sensoren voor het monitoren van in vivo signaaltransductie. Vanwege hun uitstekende stabiliteit, snelle fluorescentierespons en hoge specificiteit zijn genetisch gecodeerde fluorescentiebiosensoren in meerdere scenario's toegepast²². Een team gebruikte de intensiteitsgebaseerde glutamaatsensor-fluorescerende reporter (iGluSnFR) binnen een microflufludiïsch druppelsorteringssysteem, waarmee een high-throughput workflow werd opgezet voor het screenen van Bacillus amyloliquefaciens-mutanten met verbeterde glutaminaseproductie. Dit op biosensoren gebaseerde platform maakte een verrijkingsverhouding van 56 keer mogelijk en isoleerde uiteindelijk een variant met meer dan 47% toename in glutaminaseproductie uit een 10^5-lid volledige genoommutantenbibliotheek²³.

Transcriptiefactor (TF)-gebaseerde whole-cell biosensoren zijn een belangrijke klasse van whole-cell biosensoren, opgebouwd rond transcriptiefactoren. Transcriptiefactoren zijn een klasse van eiwitten die genexpressie reguleren door te binden aan specifieke DNA-sequenties¹⁴. Sommige transcriptiefactoren worden geactiveerd bij binding aan metabolieten of exogene verbindingen; deze worden allosterische transcriptiefactoren (aTF's) genoemd. Eenmaal geactiveerd, ondergaan aTF's conformationele veranderingen die op hun beurt leiden tot hun dissociatie van of binding aan de DNA-sequentie stroomopwaarts van doelgenen, waardoor de expressie van die genen wordt geactiveerd of geremd. Transcriptiefactoren kunnen worden gecombineerd met andere DNA-elementen die vaak in synthetische biologie worden gebruikt (zoals promotoren, ribosoombindingsplaatsen, terminatoren en reportergenen) om TF-gebaseerde biosensor-genetische circuits te construeren. Deze genetische elementen kunnen de concentratie van verschillende liganden in de cel of de omgeving waarnemen en reageren dienovereenkomstig²⁴. De detectie van erythritol is succesvol geïmplementeerd met behulp van een op transcriptiefactoren gebaseerde biosensor geïntegreerd met een FADS-platform, waardoor de isolatie van een mutantenstam met aanzienlijk verbeterde erythritolproductie^{mogelijk is 14}. De ontwikkeling van deze twee typen biosensoren biedt groot potentieel om de toepassing van FADS-platforms in microbiële veredeling te bevorderen, waarbij de beperkingen van traditionele chemische probes worden overwonnen en het bereik van doelproducten die gescreend kunnen worden worden uitgebreid.

Samenvattend is een standaard high-throughput screeningworkflow voor industriële micro-organismen gepresenteerd. De betrouwbaarheid van deze workflow werd aangetoond door de succesvolle toepassing bij het screenen van hoogopbrengstgevende L-melkzuurproducerende B. coagulans-stammen . Deze workflow biedt een waardevolle referentie voor toekomstige onderzoekers die screening met hoge doorvoersnelheid uitvoeren.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
Agar	Becton, Dickinson and Company	214030	Voor bereiding van vaste platen
Anhydrous Ethanol	Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd.	10009218	Laboratoriumbanken en apparatuur afvegen en desinfecteren
Atmospheric and Room Temperature Plasma (ARTP)	Jiangsu TMAXTREE Biotechnology Co., Ltd.	CP-002	ARTP  werd gebruikt om de mutantenbibliotheek voor stammutagenese te construeren.
B. coagulans	Beijing Microbial Culture Collection Center, BMCC	1511C0004000002355	B. coagulans ATCC 7050 werd gebruikt als uitgangsstam voor mutagenese en het doelwit van hoogdoorvoerige druppelscreening.
Black microplate (96 well)	Corning	3925	De zwarte 96-wells microplate werd gebruikt voor lactaatsensortesten en bepaling van melkzuurconcentratie.
Calcium carbonate	Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd.	20011062	Om hyperproducenten van L-melkzuur te isoleren.
Calcium chloride	Sinopharm	10005819	Calciumchloride wordt gebruikt voor de bereiding van microbieel kweekmedium, wat essentiële voedingsstoffen biedt voor microbieel groei.
Calcium L-lactate	Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd.	69027528	Gebruikt als monsters voor de bereiding van standaardcurven in het detectieproces.
Centrifuge tube (15 mL)	Beijing Xinhengyan Technology Co., Ltd	HB53397	Gebruikt voor verdunning van bacterieel vocht
Collection tube	Jiangsu TMAXTREE Biotechnology Co., Ltd.	DREMcell-CL	Voor het verzamelen van druppels en daaropvolgende cultivatie
Computer	Lenovo	E450	Installatie van software en DREM Cell controle.
DAPI	Solarbio	c0065	Voor celkleuring.
Deep-well plate (24-well)	BKMAMLAB	110424008	Voor de initiële opbrengstverificatie van B. coagulans mutanten met behulp van deep-well platen
Demulsifier (1H,1H,2H,2H-Perfluorooctanol)	MACKLIN	H817022	De druppeldemulsifier wordt gebruikt om de water-in-olie microdruppels te breken en de interne cellen, stammen of supernatant vrij te geven voor verdere detectie en analyse.
D-Glucose	Solarbio	G8150-1000	D-Glucose wordt gebruikt voor de bereiding van microbieel kweekmedium, wat essentiële voedingsstoffen biedt voor microbieel groei.
Diammonium hydrogen citrate	Solarbio	D9950	Diammonium hydrogen citrate wordt gebruikt voor de bereiding van microbieel kweekmedium, wat essentiële voedingsstoffen biedt voor microbieel groei.
Dipotassium hydrogen phosphate anhydrous	Sigma-Aldrich	P8281	Dipotassium hydrogen phosphate anhydrous wordt gebruikt voor de bereiding van microbieel kweekmedium, wat essentiële voedingsstoffen biedt voor microbieel groei.
DREM Software version	Jiangsu TMAXTREE Biotechnology Co., Ltd.	DREMcell v02.01.18	Voor het regelen van DREM cell instrument. De DREM Software is een gepatenteerd commercieel programma exclusief voor het DREM Cell instrument door Jiangsu TMAXTREE Biotechnology Co., Ltd. Het heeft geen publieke officiële toegang of download URL en wordt alleen gedistribueerd met het instrument onder autorisatie.
Droplet Entrapping Microfluidic Cell-sorter (DREM Cell)	Jiangsu TMAXTREE Biotechnology Co., Ltd.	CP-027	Het werd gebruikt voor hoogdoorvoerige encapsulatie en sorteer van enkel-cellen om snel hoge opbrengst stammen uit de mutantenbibliotheek te screenen.
Droplet generation chip	Jiangsu TMAXTREE Biotechnology Co., Ltd.	HC-03-009	De druppelgeneratie chip wordt gebruikt om monodisperse picolite (pL)-schaal druppels te produceren voor enkel-cel encapsulatie.
Droplet injection chip	Jiangsu TMAXTREE Biotechnology Co., Ltd.	HC-03-003	De druppel micro-injectie chip wordt gebruikt om nauwkeurige en trace reagent injectie in vooraf gevormde druppels te bereiken voor daaropvolgende biochemische reacties.
Droplet sorting chip	Jiangsu TMAXTREE Biotechnology Co., Ltd.	HC-03-002	De druppel sorteer chip wordt gebruikt om doelwittendruppels te sorteren die hoge opbrengst cellen bevatten op basis van fluorescentie signalen.
Erlenmeyer shake flask (250 mL)	Sichuan Shuniu Glass Instrument Co., Ltd.	B-001006	Gebruikt voor de schaalvergroting van de kweekverificatie van B. coagulans mutanten na primaire screening met deep-well platen, om de stabiliteit en reproduceerbaarheid van hoge opbrengst stammen te bevestigen.
Filter Membranes (0.22 μm)	Merck	SLGPR33RB	Gebruikt voor filtratie van fermentatiebouillon.
Fluorescence inverted microscope	Olympus	IX73	Olympus IX73 fluorescentie omgekeerde microscoop werd gebruikt om de bacterie morfologie binnen druppels te observeren
Fluorinated Oil	Bio-Rad	1864006	Gefluorineerde olie dient als de continue fase in druppel microfluidiek om stabiele, monodisperse, en niet-interfererende water-in-olie microdruppels te genereren, ondersteunend enkel-cel kweek en screening.
High Performance Liquid Chromatography column	Bio-Rad	Bio-Rad Aminex HPX-87	Het wordt gebruikt om melkzuur te scheiden van andere componenten in de fermentatiebouillon volgens hun verschillende retentie-eigenschappen, om zo de nauwkeurige kwantitatieve detectie van melkzuur te realiseren.
High-Performance Liquid Chromatography	Shimadzu	228-34001-02	HPLC wordt gebruikt voor de kwantitatieve detectie en analyse van L-melkzuur in fermentatiemonsters.
Injection tube	Jiangsu TMAXTREE Biotechnology Co., Ltd.	DREMcell-1N	Voor het injecteren van de olie fase, monster bacteriële suspensie, en reagens oplossing
Iron(III) sulfate heptahydrate	Iron(III) sulfate heptahydrate	Iron(III) sulfate heptahydrate	Iron(III) sulfate heptahydrate
Laminar flow hood	Shanghai SHP Instrument Equipment Co., Ltd	SP20230501	Gebruikt