$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
Hoge resolutie Clear native Gel Electophoresis (hrCNE) voor mitochondriële complex In-Gel Activity Assays
Menselijke embryonale stamcellen (hESC 's) werden gehouden op een monolaag van ˠ-bestraalde of mitomycine C-behandelde muis embryonale fibroblasten (MEF), daarna overgestapt naar groei op Matrigel gedurende 5 dagen in de MEF-geconditioneerd medium met behulp van standaard voorwaarden. Voor het verwijderen van verontreiniging MEFs, werden hESC 's opnieuw uitgeplaat op Matrigel en gekweekt in MEF-geconditioneerd medium voor een extra 3 dagen. Immunofluorescentie microscopie voor pluripotentie markers Oct-4 en SSEA-4 werd gebruikt om het gebrek aan differentiatie hESC te bevestigen.
- Was de cellen met warm 1x PBS, pH 7,4, gevolgd door behandeling met trypsine (1ml van 1x per trypsine goed in een 6-wells plaat) gedurende 5 minuten.
- Voeg een gelijk volume van verse trypsine-remmer (1mg/ml in 1x PBS, pH 7,4). Oogst cellen en centrifugeer bij 200 g, 5 min, kamertemperatuur.
- Verwijder het supernatant en resuspendeer gepelleteerd cellen in 0,8 - 1.7ml (op basis van de grootte van de cel pellet) van ijskoude mitochondria isolatie buffer (83mm sacharose; 6.6mM imidazol / HCl, pH 7,0) met een vers bereide 'proteaseremmer Cocktail. Incubeer op ijs gedurende 10 minuten.
- Dounce cellen met een homogenisator (~ 40 tot 50 slagen). Vlek een hoeveelheid van de dounced cellen met trypan blauw om te controleren op volledigheid van homogenisering met behulp van een lichtmicroscoop.
- Centrifugeer bij 20.000 g gedurende 10 min bij 4 ° C om een ruwe mitochondriaal pellet dat bevat ook kernen en grotere cel fragmenten te verkrijgen. Giet Verwijder de bovenstaande vloeistof en wegen de neergeslagen ruwe mitochondriale pellet. De pellet kan worden opgeslagen bij -80 ° C volgende instant bevriezen in vloeibare stikstof of dit een stopplaats.
LET OP: Differentiële centrifugering of andere gradiënt-gebaseerde procedures kunnen worden gebruikt voor het isoleren en het verzamelen van een pure mitochondriale membraan fractie. Zie ref. 4 voor meer informatie. Deze alternatieve benadering levert het mitochondriale complex activiteit per mg van de mitochondriale eiwit in plaats van complexe activiteit per mg van de cel gewicht of aantal cellen. De concentratie van mitochondriale eiwitten zal moeten worden bepaald na zuivering om deze vergelijking te maken. Ook kan een andere isolatie buffer nodig zijn voor deze aanpak. Voor solubilisatie van de zuivere mitochondriale membraan fractie, zie de opmerking volgende stap 6 hieronder.
- Solubiliseren de ruwe mitochondriale pellet op ijs en door vortexen met ijskoud solubilisatie buffer (50 mM NaCl, 50 mM imidazol / HCl pH 7,0, 1 mM EDTA, 2mm 6-aminohexanoic zuur). 6-aminohexanoic zuur kan worden vervangen door de 1x proteaseremmer Cocktail. Het gebruik van 35μl solubilisatie buffer per 20mg van pellet gewicht. Voeg 20μl van 10% w / v digitonine per 20 mg pellet gewicht en meng door de knop de buis. Incubeer gedurende 5-10 minuten op het ijs. Dodecyl-BD-maltoside of triton X-100 kan worden vervangen voor digitonine aan de eiwitten lossen. De keuze van het wasmiddel en de hoeveelheid kan invloed hebben op de vorming van supercomplexes of multimere vormen van mitochondriale complexen. Voor meer informatie, zie ref.1.
OPMERKING: De hoeveelheid wasmiddel nodig is om een zuivere mitochondriale membraan fractie solubiliseren komt overeen met een detergent / eiwit-verhouding gewicht variërend van twee-6g / g. De optimale verhouding tot mitochondriale membranen solubiliseren is 2,5 g / g voor dodecyl-BD-maltoside, 3g / g voor triton X-100, en 6g / g voor digitonine.
- Centrifugeer de opgeloste pellet bij 100.000 g gedurende 15 min bij 4 ° C. Vang het heldere supernatant.
- Voeg laadbuffer tot een uiteindelijke 5% w / v glycerol en 0,01% w / v Ponceau S (gebruik een 50% w / v glycerol, 0,1% w / v Ponceau S laadbuffer voorraad-oplossing).
- Laad gel putten met een volume dat 20-40mg van de ruwe mitochondriale pellet per rijstrook bevat. Gebruik een acrylamide gradiënt gel (4 -13%) met een 3,5% stacking gel.
LET OP: Gel elektroforese voorbereiding en voorwaarden:
Voor de gel bereiding, gebruik maken van een acrylamide / bis-acrylamide (AA / bisAA) 3 mix als volgt: 48 g van acrylamide en 1,5 g van bisacrylamide (49,5% T, 3% C. Waar T is totale concentratie van AA en bisAA en C is het percentage van de crosslinker (bisAA) om de totale monomeer).
Gel buffer (3 '): 1.5M 6-aminohexanoic zuur; 75mm imidazool, pH 7,0
| Gradiënt gel: | 4% | 13% | Stapelen gel: | 3,5% |
| AA / bisAA 3 mix | 2 ml | 6,5 ml | | 0,6 ml |
| Gel buffer 3 ' | 8,3 ml | 8,3 ml | | 2,7 ml |
| Glycerol | | 5 g | | |
| H 2 O | 14,7 ml | 5 ml | | 4,7 ml |
| Totale volume | 25 ml | 25 ml | | 8 ml |
| 10% APS | 139 ul | 125 ul | | 67 pl |
| TEMED | 14 pl | 12,5 ul | | 6,7 pl |
Anode buffer: 25mm imidazol / HCl, pH 7,0
Kathode buffer: 50mm Tricine, 7.5mm imidazol / HCl, 0,02% w / v dodecyl-BD-maltoside, 0,05% w / v deoxycholaat, pH 7,0
Giet en uitvoeren gels in een koude kamer (4-7 ° C). De gebruikte aanvankelijke voltage is 100V. Wanneer het monster heeft de stacking gel ingevoerd, wordt de spanning verhoogd tot 500 V met de huidige beperkte tot 15 mA (voor 0.15 "14" 14-cm gels). Elektroforese is gestopt na 3-4 uur als de scherpe lijn van de rode kleurstof Ponceau S de gel front nadert. Als alternatief kan een gel 's nachts worden uitgevoerd met een constante spanning bij 70-100V.
- In-gel-activiteit assays. De tijd van incubatie voor elke assay afhankelijk van de efficiëntie van eiwitten oplosbaar en de hoeveelheid van het materiaal geladen per putje. Complexen I, IV en V meestal opbrengst sterkere signalen dan de complexen II en III.
Complex I (CI)
Incubeer de gel plak met CI buffer (5mm Tris-HCl, pH 7,4; 0.1mg/ml NADH, 2.5mg/ml NBT) bij kamertemperatuur gedurende enkele uren.
CI buffer: Voeg per 100 ml van 5 mm Tris-HCl, pH 7,4:
0.01g NADH
0,25 g NBT
Bevestig de gel in 50% methanol en 10% azijnzuur voor 15-45 minuten. De vaste gel wordt bewaard in 10% azijnzuur.
Complex II (CII)
Incubeer de gel plak met CII buffer (20mm natrium-succinaat, 0.2mm fenazine methasulfate; 2.5mg/ml NBT, 5mM Tris-HCl pH 7,4) bij kamertemperatuur gedurende enkele uren.
CII buffer: Voeg per 100 ml van 5 mm Tris-HCl, pH 7,4:
200μl 1M natrium-succinaat
80μl fenazine methasulfate (250mm PMS opgelost in DMSO)
0,25 g NBT
Bevestig de gel als beschreven voor het Complex I
Complex III (CIII)
Incubeer de gel plak met CIII buffer (50 mM natriumfosfaat, pH 7,2; 0,05% 3,3 '-diaminobenzidine tetrahydrochloride (DAB)) bij kamertemperatuur gedurende enkele uren.
CIII buffer: Voeg per 100 ml van 50 mM natrium-fosfaat, pH 7.2:
50mg diaminobenzidine tetrahydrochloride
Bevestig de gel als beschreven voor het Complex I
Complex IV (CIV)
Incubeer de gel plak met CIV buffer (50 mM natriumfosfaat, pH 7,2; 0,05% 3,3 '-diaminobenzidine tetrahydrochloride (DAB), 50μM paard hart cytochroom c) bij kamertemperatuur gedurende enkele uren.
CIV buffer: Voeg per 100 ml van 50 mM natrium-fosfaat, pH 7.2:
50mg diaminobenzidine tetrahydrochloride
0.1g paard hart cytochroom c
Bevestig de gel als beschreven voor het Complex I
Complex V (CV)
Incubeer de gel plak met CV buffer (35mm Tris-base, 270mm glycine, pH 8,3 bij 25 ° C, 14mm MgSO 4, 0,2% w / v Pb (NO 3) 2, 8mm ATP) bij kamertemperatuur gedurende enkele uren.
CV-buffer: Per 100 ml van de oplossing toe te voegen:
| Tris-base | 0.424g |
| Glycine | 2.026g |
| MgSO 4 | 0.345g |
| Pb (NO 3) 2 | 0.29g |
Geen behoefte om pH (moet 8,3) aan te passen - gebruik geen zuur of base. Filter, en voeg
Bevestig de gel in 50% methanol gedurende 30 minuten en transfer naar het water.