De volledige tekst protocol voor deze experimentele aanpak is beschikbaar in <a href="http://www.mrw.interscience.wiley.com/emrw/9780471143031/cp/cpcb/article/cb0101/current/abstract" target="_blank">Current Protocols in Cell Biology</a> .

De auteurs hebben niets te melden.

tellen en bepalen van de levensvatbaarheid van de gekweekte cellen

Counting and Determining the Viability of Cultured Cells

Bepalen van het aantal cellen in cultuur is belangrijk in standaardisatie van kweekomstandigheden en in het uitvoeren van nauwkeurige kwantificatie experimenten. Een hemacytometer is een dik glasplaatje met een centrale ruimte die bestemd is als een telkamer. Celsuspensie wordt toegepast op een bepaald gebied en geteld, zodat celdichtheid kan worden berekend.

Bepalen van het aantal cellen in cultuur is belangrijk in standaardisatie van kweekomstandigheden en in het uitvoeren van nauwkeurige kwantificatie experimenten. In deze video laten we zien hoe cellen worden geteld met behulp van een hemacytometer.

Tellen en bepalen van de levensvatbaarheid van de gekweekte cellen

Het bepalen van het aantal cellen in een kweek is van groot belang voor de standaardisatie van de kweekcondities en voor het uitvoeren van nauwkeurige kwantificeringsexperimenten. Een ...

Het bepalen van het aantal cellen in een kweek is belangrijk voor de standaardisatie van de kweekcondities en bij het uitvoeren van experimenten waarbij nauwkeurige celgetallen vereist zijn. Hier laten we zien hoe u cellen telt met een hemocytometer en hoe u de concentratie cellen in suspensie berekent. We laten u ook zien hoe u het aantal levensvatbare cellen in uw kweek bepaalt met de Trypan Blue Viability Assay.Hoi, ik ben Ricky hier in het laboratorium van Dr. LAN bij het Molecular Pathology Laboratories Network in Oost-Tennessee. Vandaag ga ik laten zien hoe u cellen in een suspensie telt en hoe u hun viabiliteit bepaalt. Om de hemocytometer klaar te maken voor het tellen van de cellen, reinigt u eerst het oppervlak en het bijbehorende dekglas met 70% ethanol.Het dekglas en het objectglas moeten schoon, droog en vrij zijn van pluisjes, vingerafdrukken en watervlekken. Bevochtig vervolgens de randen van de hemocytometer lichtjes met kraanwater en druk het dekglas erop aan. Het dekglas moet gelijkmatig op het zilverkleurige telveld rusten.Nu we klaar zijn met de celsuspensie, bereiden we deze voor om de cellen te tellen. Als de cellen in monoculturen zijn gekweekt, worden ze eerst met trypsine van het platoppervlak losgemaakt, zoals te zien is in de video voor het lossen van cellen. Zodra de cellen van het plaatje zijn losgekomen, worden ze naar behoefte verdund om een uniforme suspensie te verkrijgen.Zorg ervoor dat eventuele klonters in de suspensie worden verspreid bij het gebruik van de hemocytometer. Een maximaal celgetal van 20 tot 50 cellen per vierkante millimeter wordt aanbevolen. Wanneer u klaar bent om de hemocytometer met uw celmonster te vullen, gebruikt u een micropipet om de celsuspensie over te brengen naar de rand van de teltelkamer van de hemocytometer.Houd de pipetpunt onder het dekglas en breng één druppel van de suspensie aan. De suspensie zal door capillaire werking onder het dekglas worden getrokken. Nadat u de eerste telkamer heeft gevuld, vult u de tweede telkamer; u bent nu klaar om de cellen te tellen voordat u met het tellen begint.Laat de cellen enkele minuten bezinken. Het helpt ook om overtollig vloeistof weg te blottingen zodra de cellen zijn bezonken. U kunt het preparaat onder de microscoop bekijken met een vergroting van 100x.U zou het grote centrale gebied van het rooster moeten zien, dat wordt begrensd door een set van drie parallelle lijnen. Onderverdelingen binnen het grote centrale gebied worden eveneens begrensd door drie parallelle lijnen en elke onderverdeling is door enkele lijnen verdeeld in 16 kleinere vierkantjes. Cellen binnen dit gebied moeten gelijkmatig verdeeld zijn zonder klontering.Als de cellen niet gelijkmatig zijn verdeeld, spoel ze dan uit en laad ze opnieuw. Gebruik bij de hemocytometer een handteller om de cellen in elk van de vier hoekvierkanten en het centrale vierkant te tellen. Cellen die de middelste lijn van de drievoudige lijn aan de boven- en linkerkant van de vierkanten raken, worden wel geteld; cellen die de middelste lijn van de drievoudige lijnen aan de onder- of rechterkant van het vierkant raken, worden niet geteld.Herhaal de tellingen voor de andere telkamer. Zodra u de cellen heeft geteld, kunt u het aantal cellen per milliliter bepalen. Doe dit door het gemiddelde aantal cellen per vierkant te nemen en dit te vermenigvuldigen met de verdunningsfactor en met 10.000 om het aantal cellen in uw monster te verkrijgen.Vermenigvuldig het aantal cellen per milliliter met het totale volume van de celsuspensie waaruit het monster is genomen. Nu zijn we klaar om de levensvatbaarheid van onze suspensie te bepalen. Om het aantal levensvatbare cellen in uw monster te bepalen, gebruiken we Trypan blauw. Combineer eerst 0,5 milliliter 4% Trypan blauw, 0,03 milliliter HBSS en 0,1 milliliter van de celsuspensie in een klein buisje, meng dit grondig en laat het buisje vijf minuten staan voordat de hemocytometer wordt geladen.De levensvatbare cellen moeten ongekleurd blijven, terwijl dode cellen blauw zullen kleuren onder de hemocytometer. Tel het totaal aantal cellen en het totaal aantal levensvatbare (ongekleurde) cellen, en bereken het percentage levensvatbare cellen in uw monster. Wanneer u klaar bent, descontamineert u het dekglas in de hemocytometer door dit te spoelen met 70% ethanol en vervolgens met gedeïoniseerd water.Laat het aan de lucht drogen en bewaar het voor toekomstig gebruik. We hebben u zojuist laten zien hoe u het aantal en de levensvatbaarheid van uw gekweekte cellen kunt bepalen. Dat is alles.Bedankt voor het kijken en veel succes met al uw experimenten.

counting-and-determining-the-viability-of-cultured-cells

Research

JoVE Journal

Biology

Biologie

Molecular Pathology Laboratory Network, Inc.  Bepalen van het aantal cellen in cultuur is belangrijk in standaardisatie van kweekomstandigheden en in het uitvoeren van nauwkeurige kwantificatie experimenten. In deze video laten we zien hoe cellen worden geteld met behulp van een hemacytometer.

Tellen en bepalen van de levensvatbaarheid van de gekweekte cellen

In dit artikel

Samenvatting

Samenvatting

Protocol

Openbaarmakingen

Herprints en machtigingen

Tags