Deze video laat zien hoe het handhaven van de groei van menselijke embryonale stamcellen (hESC 's) in de feeder cel-vrije omstandigheden en hoe je continu passage hESC' s in de feeder cel-vrije omstandigheden. Bevestiging van hESC pluripotentie gegroeid in feeder celvrije voorwaarden door immunofluorescentie microscopie is ook aangetoond. Deel 3 van 3.
Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.
Methodenartikel
Van MEF tot Matrigel 3: passage uit hESC 's Matrigel op Matrigel
In dit artikel
Samenvatting
Samenvatting
Deze video laat zien hoe het handhaven van de groei van menselijke embryonale stamcellen (hESC 's) in de feeder cel-vrije omstandigheden en hoe je continu passage hESC' s in de feeder cel-vrije omstandigheden. Bevestiging van hESC pluripotentie gegroeid in feeder celvrije voorwaarden door immunofluorescentie microscopie is ook aangetoond.
Protocol
Splitsen van hESC 's van Matrigel naar Matrigel
Meestal een confluente 6-well plaat van hESC 's op de Matrigel kunnen worden gesplitst 1u03-01u05 naar een andere Matrigel plaat, met de putten worden samenvloeiing weer 4-5 dagen na het splitsen.
- CM en Matrigel platen zijn bereid zoals hierboven beschreven voor de splitsing.
- Op de dag van splitsing, wast elk goed voor het splitsen met 1 x PBS, pH 7,4, voeg 1 ml 1mg/ml Dispase (verdunnen 5mg/ml voorraad oplossing met DMEM/F12 media) aan elk putje en incubeer bij 37 ° C gedurende 3 minuten.
- Was elke well drie keer met 1 x PBS, pH 7,4, 1 ml van ES media t....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Discussie
Deze reeks van drie video's laat zien hoe menselijke embryonale stamcellen (hESC 's) groeien op muis embryonale fibroblasten (MEF) feeder-cellen (video 1), hoe passage ze feeder cel-vrije platen (video 2) Matrigel, en hoe te onderhouden hESC 's door de passage in Matrigel feeder cel-vrije omstandigheden (video 3). Tal van eerdere studies toonden aan dat instandhouding van levensvatbare, ongedifferentieerde hESC 's vereist cultuur op geïnactiveerde MEF feeder-cellen. Echter, voor veel experimenten, is een zuivere populatie va.......
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Dankbetuigingen
Menselijke embryonale stamcellen studies in de Teitell lab worden ondersteund door een Californische Instituut voor Regeneratieve Geneeskunde (CIRM) Seed Grant RS1-00313. Wij danken de leden van de globale Centrum voor Regeneratieve Geneeskunde en Stamcelonderzoek aan de UCLA, in het bijzonder Dr Amander Clark, Dr Jerome Zack, en leden van de UCLA Broad Institute Stem Cell Core Facility voor hun steun aan onze studies.
....Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Materialen
| Naam | Bedrijf | Catalogusnummer | Opmerkingen | |
|---|---|---|---|---|
| Knockout Serum Replacer (KSR) | Reagens | GIBCO, by Life Technologies | 10828-028 | |
| DMEM/F12 | Reagens | GIBCO, by Life Technologies | 11330-057 | |
| Niet-essentiële aminozuren | Reagens | GIBCO, by Life Technologies | 11140-050 | |
| GlutaMax | Reagens | GIBCO, by Life Technologies | 35050-061 | |
| DMEM | Reagens | GIBCO, by Life Technologies | 11995-065 | |
| FBS | Reagens | Clontech Laboratories | 631107 | |
| L-glutamine | Reagens | GIBCO, by Life Technologies | 25030-081 | |
| BME | Reagens | Fisher Scientific | BP176-100 | |
| bFGF | Reagens | R&D Systems | 233-FB-025 | |
| Collagenase IV | Reagens | GIBCO, by Life Technologies | 17104-019 | |
| Dispase | Reagens | Stem Cell Technologies | 17105-041 | |
| Penicilline / Streptomycine | Reagens | GIBCO, by Life Technologies | 15140-122 | |
| Gelatine | Reagens | Chemicon International | ES-006-B | |
| Matrigel | Reagens | BD Biosciences | 354277 | |
| Oct-4 antilichaam | Reagens | Santa Cruz Biotechnology, Inc. | SC-9081 | |
| anti-h/mSSEA-4 Phyc–rythrine-geconjugeerde muis IgG3 | Reagens | R&D Systems | FAB1435P | |
| FITC-geconjugeerd antirabbit IgG | Reagens | Jackson ImmunoResearch | 715-095-152 |
Referenties
- Thomson, J. amesA., Itskovitz-Eldor, J. oseph, Shapiro, S. anderS., Waknitz, M. ichelleA., Swiergiel, J. enniferJ., Marshall, V. ivienneS., Jones, J. effreyM. Embryonic Stem Cell Lines Derived from Human Blastocysts . Science. 282, 1145-1147 (1998).
- Xu, C. hunhui, Inokuma, M. argaretS., Denham, J. errod, Golds, K. athaleen, Kundu, P. ratima, Gold, J. osephD., Carpenter, M. elissaK.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Herprints en machtigingen
