Een snelle techniek voor de visualisatie van Live Geïmmobiliseerd gistcellen

Samenvatting

Een snelle techniek voor de visualisatie van de groeiende geïmmobiliseerde gistcellen, hier toegepast op de TL-verslaggevers bij de stille paring loci HML en HMR

Samenvatting

We presenteren hier een eenvoudige, snelle, en uiterst flexibele techniek voor de immobilisatie en visualisatie van groeiende gist cellen door epifluorescentie microscopie. De techniek is ook geschikt voor het visualiseren van statische gist populaties, of tijd cursussen experimenten tot tien uur lang. Mijn microscopie onderzoekt epigenetische overerving bij de stille paring loci in S. cerevisiae. Er zijn twee stille paring loci, HML en HMR, die normaal niet worden weergegeven als ze zijn verpakt in heterochromatine. In de sir1 mutant achtergrond zwijgen op te leggen is verzwakt zodanig dat elke locus of kan worden in de uitdrukkelijke of zwijgen epigenetische toestand, dus in de bevolking als geheel is een mix van cellen van verschillende epigenetische staten voor zowel HML en HMR. Mijn microscopie toonde aan dat er geen verband tussen de epigenetische toestand van HML en HMR in een individuele cel. sir1 cellen stochastisch switch epigenetische staten, tot oprichting van zwijgen op een eerder uitgesproken locus of het uiten van een eerder zwijgen locus. Mijn tijd uiteraard microscopie gevolgd individuele sir1 cellen en hun nakomelingen om de frequentie van elk van de vier mogelijke epigenetische schakelaars, en daarmee de stabiliteit van elk van de epigenetische staten in sir1 cellen score. Zie ook Xu et al.., Mol. Cel 2006.

Protocol

1. Geïmmobiliseerde cellen voor tijdsverloop epifluorescentie microscopie. Houdt u er rekening mee dat dit protocol alleen zinvol is als de objectieve lenzen van je microscoop onder de microscoop podium.
   
   
2. Plaats cellen op de gewenste concentratie in vloeibare media op een lange dekglaasje (ongeveer 24x50mm)
   
   
3. Snijd een agar blok van de gewenste grootte van een synthetische media plaat (deze hebben een lagere autofluorescentie) en plaats over de cellen. Plaats de zijde van de agar blok niet afgehandeld door pincet in contact met de cellen.
   
   
4. Voor kortere cursussen (maximaal 3 uur), deze setup is voldoende. Als cellen bewegen als gevisualiseerd op de microscoop, volume verlagen van cellen of verhoging gebied van de agar te blokkeren.
   
   
5. Voor langere tijd cursussen, plaats een druppel verse vloeibare media op de top van de agar te blokkeren, en plaats een glasplaatje op de top van de agar te blokkeren. Deze dia vermindert verdamping door de bovenkant van de agar te blokkeren. Indien gewenst, kan de randen van de agar blok in contact met het dekglas worden afgedicht met vaseline om verder te verminderen vocht. Ik heb gebruik gemaakt van deze set-up voor films tot 9 uur lang, met de cellen te delen op wild-type tarieven.

Discussie

Dit is een snelle techniek die gistcellen immobiliseert terwijl nog het toestaan ​​groei. We hebben gevolgd gist groei tot tien uur, met de gist het weergeven van wild-type divisie tarieven gedurende het experiment. Merk op dat deze opstelling het objectief te zijn onder de microscoop podium nodig heeft.