Een Behavioral Assay aan responsiviteit van zebravis Maatregel om veranderingen in lichtintensiteit

Samenvatting

We ontwikkelden de Visual-Motor Reactie op het motorvermogen van larvale zebravis kwantificeren in reactie op licht stappen en verlaagt. We hebben ook onderzocht zebravis visie mutanten, waaronder de no optokinetische reactie (NRC) mutanten, waarvan gedacht werd dat volledig blind wanneer het wordt getest door een andere visie assay, de optokinetische reflex.

Samenvatting

De optokinetische reflex (OKR) is een eenvoudige visuele reflex tentoongesteld door de meeste gewervelde dieren en speelt een belangrijke rol bij het stabiliseren van het oog ten opzichte van de visuele scène. Echter, de OKR vereist dat een dier te detecteren bewegen strepen en het is mogelijk dat vissen die niet aan een OKR tentoonstelling niet helemaal blind. Een zebravis mutant, de no optokinetische antwoord c (NRC) heeft geen OKR onder alle lichtomstandigheden getest en was naar verluidt volledig blind. Eerder hebben we aangetoond dat de OFF-ganglion cel-activiteit kan worden opgenomen in deze mutanten. Om te bepalen of mutant vissen zonder OKR, zoals de NRC mutant kan simpel licht stappen en verlaagt ontwikkelden we de visuele motorische gedrag assay (VMR) te detecteren. In deze test, zijn enkele zebravis larven geplaatst in elke well van een 96-wells plaat waarmee de gelijktijdige controle van de larven met behulp van een geautomatiseerd video-tracking systeem. Het bewegingsapparaat reacties van elke larve tot 30 minuten licht aan en 30 minuten het licht uit werden geregistreerd en gekwantificeerd. WT vissen hebben een korte piek van de motorische activiteit bij de verlichting aan, bekend als de schrikreactie, gevolgd door een terugkeer naar een lager dan baseline activiteit, een zogenaamde bevriezen. WT vis ook sterk onmiddellijk verhogen hun locomotorische activiteit volgende lichten UIT en slechts geleidelijk (over enkele minuten) terug te keren naar de uitgangswaarde locomotorische activiteit. Het NRC mutanten dezelfde reageren op OFF licht als WT vis, maar vertonen een lichte daling van hun gemiddelde activiteit in vergelijking met WT vissen. Motorische activiteit als reactie op ON licht in NRC mutanten is vertraagd en traag. Er is een langzame stijging tijd van het NRC mutant reactie op licht ON in vergelijking met WT het licht van de respons. De resultaten geven aan dat NRC vis niet volledig blind. Omdat teleosten kunnen detecteren door middel van niet-retinale weefsel, we bevestigd dat de directe gedragsmatige reacties op licht-intensiteit verandert intact ogen nodig met behulp van de chokh (CHK) mutanten, die geheel ontbreekt ogen vanaf de vroegste stadia van ontwikkeling. In onze VMR test, de chk mutanten vertonen geen schrikreactie ofwel licht aan of uit, waaruit blijkt dat de laterale ogen dit gedrag te bemiddelen. De VMR test hier beschreven een aanvulling op de gevestigde OKR assay, die niet testen het vermogen van zebravis larven om te reageren op veranderingen in lichtintensiteit. Bovendien is de automatisering van de VMR test leent zich voor high-throughput screening voor defecten in het licht-intensiteit driven visuele reacties.

Protocol

Dit protocol beschrijft de stappen om de Visual-Motor Reactie van zebravis larven aan het licht stappen en verlaagt in je eigen lab uit te voeren. Zebravis zijn een grote modelsysteem voor gedragsstudies. Ze zijn gemakkelijk te onderhouden, ze hebben grote koppeling maten, en ontwikkelen ze snel. Bijvoorbeeld, de ogen van de zebravis larven zijn reageren op licht door drie dagen van de ontwikkeling en op welk moment ze vertonen een schrikreactie.

Deel 1: Plating individuele vissen in een 96 wells-plaat

1. WT groeien larven onder een donker / licht cyclus bij 28 ° C tot ten minste vier dagen na de bevruchting (DPF). Onze typische licht: donker cyclus is 14 uur licht aan vanaf 09u00 en 10 uur licht uit, vanaf 23u00. Voor de beste resultaten gedrag, overbevolking te voorkomen, hebben we meestal niet meer dan 50 larven te houden in een petrischaal.
2. Na 4 DPF, de zebravis zijn klaar om te worden overgebracht naar een 96-wells plaat. Om de larven meer zwemmen kamer, wij gebruiken meestal een 96-wells plaat met een grote goed-size van 650 ul, maar standaard 96-wells platen werken prima. Met behulp van een plastic overdracht pipet voorzichtig overdracht een larve per well.
3. Na het overbrengen van vis in de putten, vul elk goed met voldoende vis water zodanig dat het water oppervlak is bijna gelijk met de bovenkant van de putten. Ofwel overvulling of underfilling het goed kan leiden tot optische problemen voor de opname camera. Ook, neem zorgen dat er geen bubbels te introduceren in de putten.

Deel 2: Overzicht van de opname apparatuur

Voor dit deel van het protocol, wordt verwezen naar de film om componenten te identificeren en om jezelf vertrouwd te maken met onze set-up van de opname apparaat.

1. In de opname kamer is een goed gedefinieerd plaats om de 96-well plaat positie.
2. De camera is gepositioneerd in de rug en is gericht op de plaat met behulp van spiegels uit de doos. De hoek van deze spiegels kan worden ingesteld door het draaien van de schroeven die de spiegels op zijn plaats houden.
3. De opname kamer is verlicht van de bodem door de infrarood-LED's. Hierdoor kan de camera om te zien de vissen, zelfs in het donker. De larven kunnen geen IR-licht te detecteren, zodat deze constant IR-verlichting is niet van het experiment beïnvloeden. Witte LED's branden ook de opname kamer van onderen. Ze worden afzonderlijk aangestuurd vanuit de IR lampen. Het verlichten van de kamer met wit licht van boven of van de zijkanten is zeker mogelijk, maar in die gevallen zorg moet worden genomen om te voorkomen sterke staart uit het water oppervlak dat kan interfereren met de camera.
4. Voor experimenten die langer dan een paar uur, de kamer vullen met zacht stromend water om te helpen een constante temperatuur voor de experimentele periode te behouden. Een manier om een ​​constante stroom van water te bereiken is om water te pompen uit een reservoir door een klein aquarium pomp die is tot 28 ° verwarmd met een typische onderwater aquarium verwarming.
5. Te minimaliseren afdwalen trillingen uit de kamer, dient de gehele opname-eenheid zitten boven op een zware balans tafel.

Deel 3: Aanpassing van de 96-wells plaat met de computer rooster van de video-tracking

Software

1. Plaats de 96-well plaat met de vis in de opname kamer.
2. Bij gebruik van een waterbad, langzaam plaats de plaat in het water, waardoor het waterniveau een kans aan te passen zonder te knoeien op de plaat. Als alternatief, schakel de waterstroom, voeg de plaat, en hervat dan de stroom. Ook moet u een veer of een rubberen band gebruiken om de 96-well plaat op zijn plaats houden.
3. In de Viewpoint videotrack software, controleren of alle larven van uw experiment zijn zichtbaar op het computerscherm. Met behulp van de controles van de software, lijnt u de rooster van de video-tracking-software met de bronnen van je bord zodanig dat elke vis is in een vierkant van het raster. De tracking computer wordt de berekening van de beweging voor elk van deze dozen, dus als je uitlijnt de computer net een aantal van de vis bewegingen kunnen verloren gaan. Of nog erger: twee naast elkaar liggende vissen zal bezetten hetzelfde gebied en worden geteld als een vis. Deze stap is zeer belangrijk voor al uw opnamen.
4. Na de uitlijning, het programma van de timing voor als het licht zou moeten gaan aan en uit. We meestal toe drie uur van licht of donker aanpassing in de doos zowel een baseline niveau van activiteit te verkrijgen, maar ook om de larven te geven een kans om tot rust na het pipetteren en de behandeling. Na de baseline, we dan afgewisseld met 30 minuten licht aan, gevolgd door 30 minuten licht uit, en herhaal een paar keer.
5. Vervolgens sluit de deur van de opname kamer en start de opname.
6. In de praktijk, registreren wij de activiteit van elke vis per seconde, maar de Viewpoint software in feite registreert de beeld voor beeld data (zie de filmvoor een demonstratie van de gegevensverzameling). Het instellen van de drempelwaarde voor minimale pixel verandering per frame zal enigszins afhankelijk van uw specifieke camera en licht instellingen. Voor onze opstelling, wij gebruiken meestal een drempel van 4 pixels, dat wil zeggen, als er minder dan 4 pixels zijn aan het veranderen, het wordt beschouwd als achtergrond. Als er meer dan 4 pixels bewegen, geeft de vis zich beweegt. We empirisch vastgesteld dat dit cutoff bijna detecteert alle larven zwemmen en draai bewegingen.
7. Hoewel de opname dozen te isoleren van de larven vrij goed, zet u het licht in de kamer en zorg dragen om onderbrekingen met mechanische ruis, zoals openen en sluiten deuren in de kamer, met een dansfeest, of het doen van uw oefeningen te minimaliseren.

Deel 4: Het analyseren van de gegevens

1. Na het experiment is voltooid, de overdracht van de verzamelde gegevens in een Excel-blad of in uw favoriete analyse suite.
2. De bijgevoegde excel sheet is een voorbeeld van wat de gegevens kan er zo uitzien: het bevat de tijd in seconden vanaf het begin van het experiment en de activiteit van elk larve per seconde voor alle vis in het gehele experiment (zie aanvullende bestand Voorbeeld van gegevens in de Files sectie van deze pagina).
   
   
3. Figuur 1 toont een voorbeeld van de activiteit van een enkele larve. Figuur 2 is een vertegenwoordiger spoor van het gemiddelde van de 40 WT zebravis larven. De gemiddelde ON en OFF reacties zijn prominent en consistent.
   
   
   
   Figuur 1: Activiteit van een enkele vis De activiteit van een enkele WT vis op 5 DPF in reactie op afwisselende periodes van 30 minuten het licht aan en uit.. De ON reacties zijn aangegeven met zwarte pijlen en de UIT reacties met rode pijlen.
   
   
   
   Figuur 2: Gemiddelde activiteit van 40 vissen De gemiddelde activiteit van 40 WT vis op 5 DPF in reactie op afwisselende periodes van 30 minuten het licht aan en uit.. De gemiddelde ON (zwarte pijlen) en OFF (rode pijlen) reacties zijn opvallend en consistent.

5. Representatieve resultaten

Figuur 3 is een schematisch overzicht van de experimentele outline wordt gebruikt in al onze experimenten.



Figuur 3. Experimentele opzet van de Visual Motor Response (VMR) te testen. A) Individuele vissen worden geplaatst in een 96-wells plaat in een opname kamer. De activiteit van elke vis wordt gemeten per seconde. B) vis krijgen een periode van donkere of lichte aanpassing om ze te vestigen en om een ​​basis activiteit te verkrijgen. Periodes van 30 minuten Lights ON en Lights OFF zijn achtereenvolgens ingevoerd voor een totaal van 3 uur. Dit schema is aangepast van prober et al.., 2006.

Wat doen de Visual-Motor Response grafieken eruit?

We maten de AAN en UIT reacties van WT vis aan het licht stappen en verlaagt. Om te bevestigen dat deze antwoorden is afhankelijk van de oogfunctie, we meten de activiteit van de CHK mutanten, die niet ontwikkelen geen ogen. Figuur 4 toont de gemiddelde activiteit verkregen van WT dieren en de CHK mutanten.



Figuur 4: WT vissen hebben een duidelijke aan en uit antwoorden die worden bemiddeld door de laterale ogen De locomotorisch gedrag van de zebravis larven op 5 DPF in reactie op 30 minuten van het licht op en 30 minuten van het licht uit is opgenomen per seconde.. Elk spoor vertegenwoordigt een gemiddelde van 480 reacties van 120 individuele WT (blauw trace) of CHK mutant larven (oranje spoor) opgenomen over 3 experimenten. De CHK mutanten niet aanzienlijk verhogen hun activiteit aan het licht verhoogt of verlaagt en hebben een laag basisniveau van activiteit. Dit cijfer is aangepast van Emran et al.., 2007.

Visual-Motor Reacties van de NRC mutant vis.

Het NRC mutant werd gedacht dat volledig blind op basis van de OKR test. In het NRC mutant, doe de fotoreceptor terminals niet op de juiste vorm en de op visuele route is ernstig aangetast ^1. Retinale ganglion cel opnames van deze mutant vis bleek dat zij overwegend vertonen OFF-type ganglion cel responsen, een aantal abnormale ON-OFF, maar geen pure On-type reacties ^2.

Met behulp van de VMR-test lieten we zien dat de NRC-mutant een normale OFF-respons en een vertraagde en trage ON-respons is (see Figuur 5). Zo is de NRC mutant is niet helemaal blind zoals eerder gedacht ^2.


Figuur 5: NRC mutats hun activiteit te verhogen als reactie op veranderingen in lichtintensiteit Behavioral reacties op licht aan en uit van WT en NRC mutant larven op 5 DPF.. Elk spoor vertegenwoordigt een gemiddelde van 480 reacties van 120 individuele vis uit elk genotype. De gemiddelde locomotorisch gedrag van NRC mutanten (roze sporen) is iets verminderd in vergelijking met WT vis (blauw sporen), maar blijft krachtig na het licht uit stimulus. Let op de langzame stijging van de tijd in het NRC mutant reactie op licht ON in vergelijking met het licht van de respons van de WT vis.

Discussie

De experimentele procedures die we zien in de film zijn alle representatieve van WT vis. Echter, deze experimenten analoog worden gedaan op mutant vis maar ook (zie de vertegenwoordiger resultaat sectie). We stellen voor om plaat WT vis en mutant vis op dezelfde plaat in een dambord schets voor een optimale controle doeleinden.

Bij het gebruik van gemuteerde vis op dezelfde plaat als WT vis zorgen ervoor dat u opschrijven wat voor soort vis werd uitgeplaat in elk putje. Hier is een suggestie over hoe te houden van de vis uitgeplaat ...

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
Microplate-apparaten	Instrument	Whatman, GE Healthcare	7701-1651
Transferpipetten	Instrument	VWR international	202205
Viswater	Reagens			zie referentie #4
Registratiekamers (Zebrabox)	Instrument	Viewpoint Lifesciences
Videotrack-software	Instrument	Viewpoint Lifesciences