Een techniek voor seriële verzamelen van hersenvocht uit de Cisterna Magna in de muis

Samenvatting

Transgene (Tg) muismodellen van AD bieden een uitstekende gelegenheid om te onderzoeken hoe en waarom Aß of tau niveaus in CSF veranderen naarmate de ziekte vordert in menselijke patiënten. Hier tonen we een verfijnd cisterna magna prikken techniek voor serie-CSF bemonstering van de muis.

Samenvatting

De ziekte van Alzheimer (AD) is een progressieve neurodegeneratieve ziekte die pathologisch wordt gekenmerkt door extracellulaire afzetting van β-amyloïd peptide (Aß) en intraneuronale accumulatie van hypergefosforyleerde tau-eiwit. Omdat de cerebrospinale vloeistof (CSF) is in direct contact met de extracellulaire ruimte van de hersenen, het biedt een weerspiegeling van de biochemische veranderingen in de hersenen als reactie op pathologische processen. CSF van AD patiënten vertoont een daling van de 42 amino-acid vorm van Aß (Aβ42), en een toename van totaal tau en tau hypergefosforyleerde, hoewel de mechanismen die verantwoordelijk zijn voor deze veranderingen zijn nog niet volledig begrepen. Transgene (Tg) muismodellen van AD bieden een uitstekende gelegenheid om te onderzoeken hoe en waarom Aß of tau niveaus in CSF veranderen naarmate de ziekte vordert. Hier tonen we een verfijnd cisterna magna prikken techniek voor CSF bemonstering van de muis. Deze uiterst zachte sampling techniek maakt het mogelijk seriële CSF monsters die worden verkregen uit dezelfde muis van 2-3 maanden met tussenpozen die sterk minimaliseert het verstorende effect van de tussen-muis variabiliteit in Aß of tau niveaus, waardoor het mogelijk is om subtiele veranderingen te detecteren in de tijd. In combinatie met Aß en tau ELISA, zal deze techniek nuttig zijn voor studies die opgezet naar de relatie tussen de niveaus van de CSF Aβ42 en tau, en hun metabolisme te onderzoeken in de hersenen in AD muismodellen. Studies in Tg muizen zou kunnen bieden belangrijke validatie met betrekking tot het potentieel van CSF Aß of tau niveaus om te worden gebruikt als biologische markers voor monitoring progressie van de ziekte, en het effect van therapeutische interventies te controleren. Omdat de muizen kunnen worden opgeofferd en de hersenen kunnen worden onderzocht voor biochemische of histologische veranderingen kan de onderliggende mechanismen van het CSF veranderingen beter worden beoordeeld. Deze gegevens zijn waarschijnlijk informatief voor de interpretatie van de menselijke AD CSF veranderingen.

Protocol

Het trekken van de glazen capillair

1. De glazen capillair is gekocht van De Sutter Instrument Inc (borosilicaat glas, B100-75-10).
2. Trek de capillaire buisjes op een Sutter P-87 Flaming micropipet trekker, met de hitte-index vastgesteld op 300 en de druk-index vastgesteld op 330.
3. Trim het uiteinde van de glazen capillaire buis met een schaar, zodat de taps toelopende een inwendige diameter van ongeveer 0,5 mm heeft.

Cisterna magna punctie techniek voor CSF

CSF monsters worden genomen van de cisterna magna (figuur 1) met behulp van een methode die voorheen ^een gepubliceerd.



Figuur 1

1. De muizen zijn anesthesized door ketamine (100mg/kg) en xylazine (10mg/kg), toegediend intraperitoneaal. Gedurende de tijd van de anesthesie-inductie, worden de muizen bewaard in een 37 ^° C incubator.

2. De huid van de hals is geschoren, en de muis wordt dan geplaatst op het onderhevig stereotaxische instrument met een direct contact van een verwarmings-pad. Een rectale temperatuur sonde wordt ingebracht in het rectum, zodat de warmte geproduceerd door de verwarmingselement wordt aangepast in reactie op de veranderingen van de lichaamstemperatuur. De kop is beveiligd met het hoofd adapters. De chirurgische site is gereinigd met 10% povidon-jood, gevolgd door 7 0% ethanol (herhaal 3 keer), en een sagittale incisie van de huid wordt gemaakt inferieur aan de achterhoofdsknobbel.

3. Onder de microscoop dissectie, het onderhuidse weefsel en de spieren (m. biventer cervicis en m. rectus capitis dorsalis grote) worden gescheiden door stompe dissectie met een pincet. Een paar microretractors wordt gebruikt om uit elkaar te houden van de spieren.

4. De muis is vastgelegd, zodat de kop een bijna 135 ^o hoek met het lichaam vormen.

5. Onder de microscoop dissectie, de dura mater van het cisterna magna verschijnt als een glinsterende en heldere omgekeerde driehoek waardoor de medulla oblongata en een groot bloedvat (arteria dorsalis spinalis), en de CSF ruimte zichtbaar zijn (figuur 2).



Figuur 2

6. De dura mater is drooggedept met een steriele wattenstaafje. Doordringen in de capillaire buis in de Citerna magna door de dura mater, lateraal van de arteria dorsalis spinalis (figuur 2). Na een merkbare verandering in de weerstand van de capillaire buis inbrengen, de CSF stroomt in de capillair.

7. Verwijder voorzichtig de capillaire buis, en sluit het aan op een 3 ml spuit met een polyethyleen buis dat een 1 mm inwendige diameter heeft. Injecteer de CSF in een pre-gemarkeerde 0,5 ml Eppendorf buis, en onmiddellijk te bevriezen de buis op droog ijs en vervolgens over het in een -80 ° C vriezer.

8. Na CSF bemonstering, de spieren opnieuw worden uitgelijnd, en de huid wordt gehecht (4-0, Ethicon, Johnson & Johnson). Ongeveer 1 ml 0,9% NaCl wordt subcutaan geïnjecteerd om de-hydratie te voorkomen. De muis wordt bewaard in de couveuse om lichaamstemperatuur te handhaven tot het hersteld, het gewicht van de muis wordt bewaakt 1 dag en 1 week na de operatie.

Resultaten en discussie

Beschreven wij een zeer betrouwbare protocol voor seriële bemonstering van CSF van muizen zonder detecteerbare plasma besmetting.

1. De gehele procedure neemt gewoonlijk 10 minuten per muis (inclusief verdoving). Het volume van CSF verkregen is afhankelijk van de muizenstammen. In de PS / APP dubbele Tg muizen gebruikten we ^2, het gemiddelde volume is ongeveer 5 pi (3 tot 7 pl), terwijl de P301L (JNPL3) muizen ³ geven een opbrengst van ongeveer 10 ul-15 pl. Voor seriële sampling, kan een maximum van 7-8 ul veilig worden genomen telkens met een interval van 2-3 maanden.

2. Tijdens de operatie, is het belangrijk om het hoofd en het lichaam van de muis goed positie op de stereotaxisch frame zodat de dura mater van het cisterna magna voldoende kan worden blootgesteld. Zorg ervoor, de bloedvaten bij het ​​betreden van de dura mater met de capillaire buis om besmetting te voorkomen uit het plasma-eiwitten, die in het CSF monster worden gecontroleerd door immunoblotting voor ApoB ^4.

3. Het minimaliseren van de weefselschade tijdens elke operatie is belangrijk, omdat weefsel samenkleving kan de moeilijkheid door predisponerende bloeden voor de volgende bemonstering.

4. De lichaamstemperatuur moet goed worden gehandhaafd tijdens de operatie, omdat onderkoeling veroorzaakt door de anesthesie kan een aanzienlijke invloed hebben op de gefosforyleerd tau niveaus in de hersenen zeer snel ^5.

5. De Ab ELISA-protocol en de antilichamen die we gebruikten waren in detail beschreven in Refolo et al.. ^6. Twee pi van CSF van de PS / APP muizen geeft bevredigende resultaten bij het verdund 1:50-1:60. Voor het tau-ELISA, zal 4-5 ul CSF uit P301L (JNPL3) muizen voldoende zijn voor dedetectie van het totaal tau, of tau fosfor ylated op threonine 231 (Kits zijn gekocht van Bio-Source).

6. Deze techniek kan worden toegepast op andere muismodellen van neurologische aandoeningen, waarvoor een kleine hoeveelheid van de CSF is bevredigend voor de gewenste assays.

Discussie

Beschreven wij een zeer betrouwbare protocol voor seriële bemonstering van CSF van muizen zonder detecteerbare plasma besmetting.

1. De gehele procedure neemt gewoonlijk 10 minuten per muis (inclusief verdoving). Het volume van CSF verkregen is afhankelijk van de muizenstammen. In de PS / APP dubbele Tg muizen we used2, het gemiddelde volume is ongeveer 5 pi (3 tot 7 pl), terwijl de P301L (JNPL3) muizen 3 geven een opbrengst van ongeveer 10 ul-15 pl. Voor seriële sampling, kan een maximum van 7-8 ul veilig worden genomen telkens met...