Name: Embryonale stamcellen afgeleide endotheelcellen voor de behandeling van ischemie achterbeen (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2009-01-23T00:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 11 s
Description: Leer een chirurgische methode voor het toedienen van embryonale stamcel-afgeleide endotheelcellen bij ischemie van de achterpoot. Deze techniek maakt niet-invasieve tracking mogelijk via bioluminescentiebeeldvorming.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

De auteurs danken Andrea Axtell, Satoshi Itoh, MD, Jeff Velotta, MD, Grant Hoyt, Robert C. Robbins, MD, Jin Yu, MD, Tim Doyle, PhD, en aan de Stanford Small Animal Imaging Core voor technische ondersteuning. De auteurs danken ook AM Bickford, Inc voor ondersteuning van veterinaire apparatuur. Dit onderzoek werd ondersteund door subsidies voor onderzoek van de National Institutes of Health (R01 HL-75774, R01 CA098303, R21 HL085743, 1K12 HL087746), de Californische tabak Related Disease Research Program van de University of California (15DAT-0257 en 1514RT-0169) , en het California Institute for Regeneratieve Geneeskunde (RS1-00183). NH wordt ondersteund door een beurs van de American Heart Association. kunnen Heart Association.

1. Differentiatie van muriene sociaal-economische raden in de endotheelcellen <ol><li> Het protocol voor differentiatie SER in de endotheelcellen wordt elders beschreven en is niet de focus van dit protocol 2,3. Kortom, zijn de cellen toegestaan ​​om te differentiëren, en de cellen die positief zijn voor de endotheliale merkers zoals CD31 of vasculaire endotheliale cadherine (VE-cadherine) worden vervolgens gezuiverd door fluorescentie geactiveerde cel sortering (FACS). </li></ol> 2. De bouw van de Double Fusion Reporter Gene en Lentivirale transductie <ol><li> Bioluminescentie kan worden gebruikt om cellen die zijn aangepast om reporter genen zoals vuurvlieg luciferase (schommelingen) te uiten track. Voor deze toepassing, onze cellen bevatten zowel schommelingen en verbeterde groene fluorescentie eiwit (eGFP) fusie-gen onder de controle van een interne ubiquitine promotor. Om de cellen te wijzigen, het transgen lentivirale vector met de belangrijkste geoptimaliseerd genetische elementen te voldoen aan de bio-veiligheid criteria en een toename van transductie-efficiëntie, kan PFU-FG vector ontwikkeld in ons laboratorium het dragen van de fluc-eGFP fusie reportergen worden gebruikt voor het stabiel transduceren de cellen na differentiatie. Dit fusieconstruct maakt zowel bioluminescentie en fluorescentie volgen van de getransplanteerde cellen. De procedure voor het genereren van virusdeeltjes, transductie en de productie van de gelabelde cellen die uitdrukken reporter genen wordt elders 4 beschreven. </li></ol> 3. Transplantatie van ESC-afgeleide endotheliale cellen aan de ischemische achterbeen <ol><li> Begin de procedure door het opstellen van een muis die heeft ondergaan achterbeen ischemie voor stamceltransplantatie. Om dit te doen, plaatst u de muis in de anesthesie-inductie kamer met een 1-3% isofluraan bij 100% zuurstof bij een debiet van 1L/min. </li><li> Laat de muis in de inductie kamer totdat het reageert op prikkels van buitenaf. Verwijder vervolgens het dier uit de inductie kamer. </li><li> Plaats dan het dier in rugligging op de operatietafel en verbind deze met een continue stroom van 1-3% isofluraan in 100% zuurstof bij een debiet van 1L/min. </li><li> Veeg de huid van de achterbeen met drie afwisselende Betadine en alcohol scrubs. </li><li> Nadat de huid is gereinigd, miljoen ESC-afgeleide endotheliale cellen te verkrijgen in 30 ul van fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS). Laden van deze cellen in een 28 gauge naald. </li><li> Wanneer de cellen klaar zijn, voorzichtig lift en uitbreiding van het achterbeen beter te visualiseren de locatie van de gastrocnemius spier. Terwijl het been wordt verlengd, steek de naald door de huid in de onderliggende spier. Zorg ervoor dat niet tot op het bot aanpak. Voorzichtig en langzaam injecteren van de 30 pi cel mengsel in de gastrocnemius. Voor intramusculaire injectie, 30 pL ligt dicht bij de grens van het volume dat kan worden geïnjecteerd. Daarom zijn 28-gauge insulinespuiten voorkeur, omdat, in onze ervaring, zij elimineren het verlies van volume in de spuit naalden. </li><li> Na de injectie is voltooid, gaat u terug met de muis om het herstel kooi en het doorlopend volgen totdat wakker. Laat het dier te laten bekomen voor enkele uren en dan met de in vivo bioluminescentie beeldvorming van de getransplanteerde cellen gaan. </li></ol> 4. Bioluminescentie beeldvorming van ESC-afgeleide endotheelcellen in vivo <ol><li> De getransplanteerde ESC afgeleide endothelials cellen werden aangepast om zowel de schommelingen en de eGFP fusiegen onder de controle van een interne ubiquitine-promoter uit te drukken. Daarom kan bioluminescentie worden gebruikt om de cellen binnen de ischemische achterbeen track. </li><li> Om te beginnen deze stap zet op de bioluminescentie imaging-systeem en Living Image acquisitie software. Dan initialiseren van de acquisitie systeem en de afmetingen van het gezichtsveld. </li><li> Plaats vervolgens zwart mat papier op de beeldvorming vak achtergrond-uitstoot te absorberen. </li><li> Zodra de beeldvorming doos klaar is, plaatst u de muis in de anesthesie-inductie kamer met een 1-3% isofluraan bij zuurstof aan de uitgang van 1L/min. Laat de muis in de inductie kamer totdat het reageert op prikkels van buitenaf. Verwijder vervolgens het dier uit de inductie kamer. </li><li> Verwijder het haar van beide achterpoten met behulp van een elektrisch scheerapparaat als nodig is. </li><li> Injecteer 10 pi van de D-luciferine per gram lichaamsgewicht in het buikvlies. De D-luciferine is voorbereid in gefilterd voorraad oplossingen van 15 mg / ml in PBS. </li><li> Zodra de luciferine wordt geïnjecteerd, plaats het dier in de beeldvorming vak over het zwarte papier in rugligging, aangesloten op een continue stroom van isofluraan. </li><li> Het plaatsen van dieren in beeldvorming box en verbinding maken met isofluraan. </li><li> Start om beelden voor 10 tot 60 seconden te verwerven met het oog op een optimale belichting tijd waarin het beeld niet verzadigd is vast te stellen. Als het beeld verzadigd raakt, vermindering van de belichtingstijd. Als de bioluminescentie signaal is erg zwak, verhoging van de belichtingstijd. </li><li> Using de optimale belichtingstijd, blijven het verwerven van foto&#39;s om de 1-3 minuten totdat het signaal bereikt de maximum en dan vervaagt. Wanneer acquisitie is voltooid, sla het bestand op. </li><li> Het analyseren van de gegevens, selecteert u de regio&#39;s van belang (ROI) dat de injectieplaats te dekken. Als een negatieve controle, kan een soortgelijke ROI geselecteerd worden voor de niet-geopereerde been. Met behulp van de software, meet de totale uitstraling, die wordt uitgedrukt in eenheden van fotonen / seconden / cm 2 / steradiaal (p / s / cm 2 / sr), voor de ROI voor elk tijdpunt. De maximale waarde moet worden gebruikt in de definitieve gegevens. De gegevens kunnen ook worden geëxporteerd naar Excel-spreadsheet voor toekomstig gebruik. </li><li> Zodra alle gegevens zijn verkregen, terug het dier om het herstel kooi en bewaken continu totdat het dier ontwaakt. </li><li> Herhaal deze procedure om de cellen te volgen in de tijd. </li><li> Op een gewenst tijdstip, kan het dier worden gedood voor de beoordeling van weefsel functie. </li></ol> 5. Representatieve resultaten <img src="/files/ftp_upload/old/1034_2009_1_22_4/figure 1.png" alt="Figuur 1" width="600" height="600" /> Een vertegenwoordiger bioluminescentie beeld van de getransplanteerde cellen in het linker achterbeen ischemische is weergegeven in figuur 1. Tijdens de overname van bioluminescentie, zal de intensiteit toenemen met de tijd, en de maximale waarde die tijdens het tijdsverloop dient te worden gerapporteerd als de uiteindelijke waarde.

<ol><li>Niiyama, H., Huang, N. F., Rollins, M., Cooke, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Murine+model+of+hindlimb+ischemia%5BTitle%5D)+AND+%22JoVE%22%5BJournal%5D)">Murine model of hindlimb ischemia.</a> JoVE. , (2008).</li>
<li>Levenberg, S., Golub, J. S., Amit, M., Itsakovitz-Eldor, J., Langer, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endothelial+cells+derived+from+human+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Endothelial cells derived from human embryonic stem cells.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 99, 4391-4396 (2002).</li>
<li>Yamashita, J., Itoh, H., Hirashima, M., Ogawa, M., Nishikawa, S., Yurugi, T., Naito, M., Nakao, K., Nishikawa, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Flk1-positive+cells+derived+from+embryonic+stem+cells+serve+as+vascular+progenitors%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Flk1-positive cells derived from embryonic stem cells serve as vascular progenitors.</a> Nature. 408, 926-926 (2000).</li>
<li>De, A., Yaghoubi, S. S., Gambhir, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Applications+of+lentiviral+vectors+in+noninvasive+molecular+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Applications of lentiviral vectors in noninvasive molecular imaging.</a> Methods Mol Biol. 433, 177-202 (2008).</li>
<li>Niiyama, H., Kai, H., Yamamoto, T., Shimada, T., Sasaki, K., Murohara, T., Egashira, K., Imaizumi, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Roles+of+endogenous+monocyte+chemoattractant+protein-1+in+ischemia-induced+neovascularization%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Am.+Coll.+Cardiol%22%5BJournal%5D)">Roles of endogenous monocyte chemoattractant protein-1 in ischemia-induced neovascularization.</a> J. Am. Coll. Cardiol. 44, 661-666 (2004).</li>
<li>Cook, M. J. The anatomy of the laboratory mouse. , Academic Press. New York. (1976).</li>
<li>Contag, P. R., Olomu, I. N., Stevenson, D. K., Contag, C. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bioluminescent+indicators+in+living+mammals%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Med%22%5BJournal%5D)">Bioluminescent indicators in living mammals.</a> Nature Med. 4, 245-247 (1998).</li>
<li>Ray, P., De, A., Min, J. J., Tsien, R. Y., Gambhir, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+tri-fusion+multimodality+reporter+gene+expression+in+living+subjects%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Imaging tri-fusion multimodality reporter gene expression in living subjects.</a> Cancer Res. 64, 1323-1330 (2004).</li>
<li>Huang, N. F., Lee, R. J., Li, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemical+and+physical+regulation+of+stem+cells+and+progenitor+cells%3A+potential+for+cardiovascular+tissue+engineering%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Eng%22%5BJournal%5D)">Chemical and physical regulation of stem cells and progenitor cells: potential for cardiovascular tissue engineering.</a> Tissue Eng. 13, 1809-1823 (2007).</li>
<li>Cao, F., Lin, S., Xie, X., Ray, P., Patel, M., Zhang, X., Drukker, M., Dylla, S. J., Connolly, A. J., Chen, X., Weissman, I. L., Gambhir, S. S., Wu, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+visualization+of+embryonic+stem+cell+survival%2C+proliferation%2C+and+migration+after+cardiac+delivery%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation%22%5BJournal%5D)">In vivo visualization of embryonic stem cell survival, proliferation, and migration after cardiac delivery.</a> Circulation. 113, 1005-1114 (2006).</li>
<li>Wilson, K., Yu, J., Lee, A., Wu, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+and+in+vivo+bioluminescence+reporter+gene+imaging+of+human+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">In vitro and in vivo bioluminescence reporter gene imaging of human embryonic stem cells.</a> J Vis Exp. , (2008).</li>
</ol>

Sociaal-economische raden zijn een veelbelovende bron cel voor de behandeling van weefsel ischemie vanwege hun plasticiteit van differentiatie en hun vermogen om aanleiding te geven tot cellijnen die alle drie kiembladen, inclusief endotheelcellen. Te overwinnen de ethische bezorgdheid in verband met sociaal-economische raden, kan geïnduceerde pluripotente stamcellen (iPSCs) een alternatief zijn pluripotente stamcellen bron dat de ethische bezwaren overwint. Naast de sociaal-economische raden, kunnen volwassen stamcellen, zoals endotheliale...

<table><tbody><tr><td>Chirurgische instrumenten</td><td>Instrument</td><td>Fine Science Tools</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Injectienaald</td><td>Instrument</td><td>BD Biosciences</td><td></td><td>Een 28G insulinespuit heeft de voorkeur</td></tr><tr><td>Fosfaatgebufferde zoutoplossing</td><td>Reagens</td><td>Invitrogen</td><td></td><td></td></tr><tr><td>D-luciferine</td><td>Reagens</td><td>Biosynth International, Inc</td><td></td><td>Bereid D-luciferine vooraf als gefilterde voorraadoplossingen van 15 mg/mL in PBS</td></tr><tr><td>IVIS 200 Bioluminescentie-beeldvormingssysteem en acquisitiesoftware</td><td>Apparatuur</td><td><a href="http://www.perkinelmer.com/Catalog/Category/ID/IVIS%20Series" target="_blank"><img src="/img/new_window.png"> Xenogen Corporation</a></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

embryonale stamcellen afgeleide endotheelcellen voor de behandeling van ischemie achterbeen

Embryonic Stem Cell-Derived Endothelial Cells for Treatment of Hindlimb Ischemia

Perifeer arterieel vaatlijden (PAD) het gevolg van vernauwing van de perifere slagaders die zuurstofrijk bloed en voedingsstoffen leveren aan de benen en voeten, Dit pathologie veroorzaakt symptomen zoals claudicatio intermittens (pijn bij het lopen), pijnlijke ischemische zweren, of zelfs ledematen bedreigend gangreen. Het wordt algemeen aangenomen dat de vasculaire endotheel, een monolaag van endotheelcellen die de luminale oppervlak van alle bloed-en lymfevaten investeert, een dominante rol speelt in vasculaire homeostase en vasculaire regeneratie. Als gevolg hiervan, op basis van stamcellen regeneratie van het endotheel kan een veelbelovende benadering voor de behandeling van PAD worden. In deze video, tonen we de transplantatie van embryonale stamcellen (ESC) afkomstige endotheel-cellen voor de behandeling van eenzijdige hindimb ischemie als een model van de PAD, gevolgd door de niet-invasieve volgen van cel homing en overleving van bioluminescentie imaging. De specifieke materialen en procedures voor de levering en cell imaging zal worden beschreven. Dit protocol volgt nog een publicatie in het beschrijven van de inductie van ischemie achterbeen door Niiyama et al. 1.

De chirurgische procedure voor de levering van embryonale stamcel-afgeleide endotheelcellen van de ischemische achterbeen is aangetoond, met niet-invasieve tracking door bioluminescentie imaging.

Embryonale stamcellen afgeleide endotheelcellen voor de behandeling van ischemie achterbeen

Perifeer arterieel vaatlijden (PAV) is het gevolg van een vernauwing van de perifere slagaders die zuurstofrijk bloed en voedingsstoffen naar de benen en voeten transporteren. Dit ...

Perifeer arterieel levyziekten. PAD is het gevolg van een vernauwing van de perifere slagaders die bloed en zuurstof naar de benen en voeten transporteren, wat leidt tot vasculaire dysfunctie. Om vast te stellen of stamcellen kunnen worden gebruikt voor de behandeling van PAD, injecteren we uit embryonale stamcellen afgeleide endotheelcellen in het achterste ledemaat na het induceren van ischemie.Aangezien deze cellen zijn gemodificeerd om vuurvlieg-luciferase tot expressie te brengen, kunnen ze via bioluminescentie-imaging worden gevolgd om vast te stellen of ze naar de plek van de beschadiging migreren en een therapeutisch effect hebben. Hallo, ik ben John Cook. Ik ben hoogleraar geneeskunde hier bij de afdeling Cardiovasculaire Geneeskunde aan de Stanford University.Ons laboratorium is geïnteresseerd in angiogenese en vasculaire regeneratie. In deze video zullen twee van mijn postdoctorale onderzoekers, Dr. Nan Wong en Hir Niyama, u kennis laten maken met procedurele stappen voor therapeutische celtransplantatie bij ischemie van de achterpoot en niet-invasieve beeldvorming van celoverleving. Deze procedures omvatten de volgende stappen: de toediening van embryonale stamcellen di

embryonic-stem-cell-derived-endothelial-cells-for-treatment-hindlimb

Research

JoVE Journal

Biology

Biologie

De chirurgische procedure voor het induceren van eenzijdige achterbeen ischemie is aangetoond, met bevestiging van ischemie door een laser Doppler perfusie beeldvorming.

Muizenmodel van achterbeen ischemie

Een methode voor het zaaien titanium bloed-contact biomaterialen met autologe cellen en het testen van biocompatibiliteit wordt beschreven. Deze methode maakt gebruik van endotheliale progenitor cellen en titanium buizen, zonder zaadjes binnen enkele minuten van de chirurgische implantatie in varkens venae cavae. Deze techniek is aan te passen aan vele andere implanteerbare biomedische apparaten.

Autologe endotheliale voorlopercellen-zaaien Technologie en biocompatibiliteitstests voor cardiovasculaire apparaten in grote Animal Model

Endotheliale kolonievormende cellen (ECFCs) in omloop zijn endotheelcellen met robuuste klonale proliferatie potentieel dat intrinsieke weer te...

Fenotypische en functionele karakterisering van endotheliale Colony Forming Cellen uit menselijk navelstrengbloed

We beschrijven de manier van programmeren stamcellen therapeutische angiogenese factoren overexpressie bioafbreekbare polymere nanodeeltjes. Beschreven processen omvatten polymeersynthese, transfecteren vet-afgeleide stamcellen in vitro, en valideren van de werkzaamheid van geprogrammeerde stamcellen om angiogenese te bevorderen in een muizen achterbeen ischemie model.

Programmeren stamcellen voor therapeutische angiogenese gebruik van biologisch afbreekbare polymere nanodeeltjes

Hier presenteren we een protocol om tissue engineered vaartuig enten die functioneel zijn voor het enten in muizen door dubbel zaaien gedeeltelijk geïnduceerde pluripotente stamcellen genereren (PiPSC) - afgeleide gladde spiercellen en PiPSC - afgeleide endotheelcellen op een gedecellulariseerde schip steiger bioreactor.

Generatie en enten van-Weefselmanipulatieproducten Schepen in een muismodel

We presenteren drie nieuwe en efficiëntere protocollen voor differentiatie humane geïnduceerde pluripotente stamcellen in cardiomyocyten, endotheelcellen en gladde spiercellen en bezorg- de engraftment van getransplanteerde cellen verbetert door het combineren celinjectie met patch-gemedieerde cytokine.

Pluripotente stamcellen afkomstig van hartcellen voor myocard reparatie

Het doel van dit protocol is te isoleren van endotheliale voorlopercellen van bloed van de navelstreng. Enkele van de toepassingen zijn het gebruik van deze cellen als een biomarker voor het identificeren van patiënten met cardiovasculaire risico, behandeling van ischemische ziekten, en creëren weefsel-engineered vasculaire en hart ventiel construeert.

Isolatie van endotheliale voorlopercellen van menselijke navelstrengbloed

Wij beschrijven een chirurgische procedure die wordt gebruikt om perifere ischemie in konijnen met hyperlipidemie en diabetes te veroorzaken. Deze operatie fungeert als een preklinisch model voor aandoeningen ervaren in perifeer vaatlijden bij patiënten. Angiografie wordt ook beschreven als een middel om de omvang van de geïntroduceerde ischemie en het herstel van de doorbloeding te meten.

Preklinisch model van de achterste ledematen ischemie bij diabetische konijnen

Hier wordt een kritisch hindledemaat ischemie-experimentele model gepresenteerd, gevolgd door een batterij met functionele, histologische en moleculaire tests om de effectiviteit van angiogene therapieën te beoordelen.

Beoordeling van therapeutische angiogenese in een Muriene model van Hindledemaat ischemie

Hier wordt een eenvoudig protocol gepresenteerd voor de gerichte differentiatie van hemogene endotheelcellen van menselijke pluripotente stamcellen in ongeveer 1 week.

Gerichte differentiatie van hemogene endotheelcellen uit menselijke pluripotente stamcellen

Het huidige protocol beschrijft een prospectieve, gerandomiseerde, gecontroleerde klinische studie die een menselijke navelstreng mesenchymale stamcelinjectie evalueert voor de behandeling van chronische diabetische voetulcera.

Prospectieve, gerandomiseerde en gecontroleerde studie van een menselijke navelstrengmesenchymale stamcelinjectie voor de behandeling van diabetische voetulcera

Leer een chirurgische methode voor het toedienen van embryonale stamcel-afgeleide endotheelcellen bij ischemie van de achterpoot. Deze techniek maakt niet-invasieve tracking mogelijk via bioluminescentiebeeldvorming.

Embryonale stamcellen afgeleide endotheelcellen voor de behandeling van ischemie achterbeen

Meer video's verkennen