Vaste Fase Synthese

1. Laden van de hars

1. Voeg in een peptidesynthesevat van 100mL 2-chloortritylchloride (CTC) hars (1,1 mmol/g, 0,360 g, 0,400 mmol) toe. Voeg 20 mL DMF toe en laat ze 30 min zwellen onder N_2.
2. Trek de kralen af onder vacuüm en voeg 10 mL DMF toe.
3. Voeg 500 mg Fmoc-Ala-OH (1,60 mmol) en 2,5 mL i-Pr₂EtN toe en meng 15 min onder N₂.
4. Trek het oplosmiddel af onder vacuüm en herhaal het laden met Fmoc-Ala-OH gedurende 15 min.
5. Trek het oplosmiddel af onder vacuüm en was de kralen met 10 mL DMF onder N₂ en trek af onder vacuüm 3x.

2. Deprotectie van de Fmoc-groep

1. Voeg 10 mL 20% 4-methylpiperidine in DMF toe en roer de kralen onder N₂ gedurende 15 min.
2. Trek het oplosmiddel af onder vacuüm en herhaal de deprotectie.
3. Was de kralen met 10 mL DMF onder N₂ en trek af onder vacuüm 3x.

3. Uitvoeren van de Kaiser Test

1. Voer de Kaiser-test uit door 1-2 druppels oplossing A (0,5 mL 0,01 M KCN, 24,5 mL pyridine), oplossing B (1 g ninhydrine, 20 mL n-butanol) en oplossing C (20 g fenol, 10 mL n-butanol) elk toe te voegen aan twee testbuisjes. Eén testbuisje zal de controle zijn, terwijl de andere de reactie zal controleren.
2. Voeg een paar kralen van de hars uit het reactievat toe aan het reactietestbuisje en verwarm de twee testbuisjes tot 110 °C.
3. Als de deprotectie voltooid is, zal de inhoud van het testbuisje donkerblauw/paars worden. Als de deprotectie onvolledig is of is mislukt, zal de oplossing geel blijven. Vergelijk het reactietestbuisje met het controletestbuisje.

4. Koppelen van de volgende bouwstenen

1. Trek het oplosmiddel af onder vacuüm.
2. Was de kralen met 10 mL N-methyl-2-pyrrolidon onder N₂ en trek het oplosmiddel af onder vacuüm.
3. Om de volgende koppeling te starten, voeg 10 mL NMP, 620 mg Fmoc-Phe-OH (1,6 mmol), 610 mg HBTU (1,6 mmol) en 2,5 mL i-Pr₂EtN toe en laat de hars 30 min onder N₂ borrelen.
4. Trek het oplosmiddel af onder vacuüm.
5. Was de kralen met 10 mL DMF onder N₂ en trek af onder vacuüm 3x.
6. Voer de Kaiser-test uit (zie stappen 3.1-3.3) om te controleren of de koppeling voltooid is. De kralen en de oplossing in het testbuisje moeten geel zijn.

5. Het peptide van de hars afsnijden

1. Snijd de resterende Fmoc-groep af met stappen 2.1-2.3.
2. Nadat het oplosmiddel is afgetrokken onder vacuüm, voeg 40 mL splitsingsoplossing (95% TFA, 2,5% H₂O, 2,5% TIPS) toe aan de hars en borrel onder N₂ gedurende 3 uur.
3. Plaats een nieuw opvangflesje op de peptidesynthesizer en trek de TFA-oplossing die het gewenste peptide bevat onder vacuüm af in de nieuwe fles.

6. Precipitatie en isolatie van het peptide

1. Scheid de TFA-oplossing in 4 kegelvormige flacons en voeg 25 mL koude ether (−20 °C) toe aan elke flacon om het peptide te laten neerslaan.
2. Centrifugeer de flacons (3.000 tpm, 0-4 °C) gedurende 20 min. Decanteer de resterende TFA en ether-oplossing uit de kegelvormige flacons en concentreer het peptide-neerslag om het gewenste dipeptide als witte vaste stof te verkrijgen.