Een magnetisch Tether System om visuele en olfactorische Mediated Flight Control in Drosophila Onderzoek

Het groeiende vakgebied van de Joof-olfactie heeft geleid tot steeds geavanceerdere gedragstests, zoals het olfactorische magnetische tether-apparaat of OMT. Bij deze procedure wordt de dorsale thorax van de vlieg met lijm aan een mnuchin-speld bevestigd. De vlieg wordt onder een hoek van 30 graden opgehangen met de speld in de juiste stand, en vervolgens uitgelijnd tussen twee neodymiummagneten.

Wanneer dit correct wordt uitgevoerd, resulteert dit in een vrije bewegingsruimte. Een geurpoort wordt vervolgens zo uitgelijnd dat er een pluim ontstaat die vloeiend van de toevoersproeier over de kop van de vlieg in de vacuümkamer stroomt. De eigenschap van de vlieg om de geurstof te lokaliseren wordt vervolgens getest in de aanwezigheid van visuele stimuli.

Hoi, ik ben Brian DeMars uit het laboratorium van Dr. Mark Fry van de afdeling Physiological Science aan de University of California Los Angeles. Vandaag laten we u zien hoe u vliegen vastzet voor gebruik in een olfactorisch magnetisch tether-apparaat. We laten u ook zien hoe u de magneten en geurpoorten uitlijnt en hoe u de massastromingssnelheden voor het geurtoedieningssysteem instelt.

We gebruiken deze procedure in ons laboratorium om de door visuele en olfactorische prikkels gestuurde vluchtcontrole bij fruitvliegen te bestuderen. Laten we beginnen. Om te starten met het vastzetten, verzamel vliegen vier tot zes dagen na de eclosie en laat ze vier tot zes uur vasten.

In een buisje met voedingsmedium dat een vochtig kim wipe bevat om uitdroging te voorkomen, wordt vervolgens een groep gemarkeerde vliegen overgebracht naar een klein buisje dat is geplaatst in een messing blok op een peltier-koelplateau dat is ingesteld op vier graden Celsius. Bij deze temperatuur zullen de vliegen binnen ongeveer 30 seconden onder narcose raken.

Plaats een Kim wipe op het koelplateau om vocht te absorberen. Plaats vervolgens de geanestheseerde vliegen op het plateau voor sortering en selecteer de grootste vrouwtjes om vast te binden. Duw met een fijn penseel een enkele vlieg in positie in de op maat gemaakte sarcofaag, die is ontworpen om één wild-type vrouwelijke fruitvlieg te accommoderen.

Gebruik nu de microscoop om te controleren of de vlieg correct is gepositioneerd op zijn rugzijde. De voorkant van de vlieg moet naar u toe gericht zijn en de achterkant van u af. Plaats vervolgens een minuchin-pin met een magnetische staaf die is gemonteerd op een micromanipulator.

De speld moet worden uitgelijnd zodat het stompe uiteinde naar de dorsale thorax van de vlieg wijst. Dit bevindt zich net achter de kop, tussen de twee vleugels. De vlieg moet correct langs drie assen op de speld worden geplaatst.

De pitch, de roll en de yaw: de speld moet perfect verticaal staan wanneer deze van voren, richting de ogen, wordt bekeken; zelfs een kleine hoeveelheid roll tussen de vlieg en de speld is onaanvaardbaar. De hoek in zijaanzicht tussen de speld en de lange as van het lichaam (pitch) moet een hoek van 30 graden omhoog (neus omhoog) hebben ten opzichte van de horizon. Houd er rekening mee dat de speld mogelijk moet worden ingekort voor een optimale werking van de tether.

Dit zal afhangen van de afstand tussen de ophangmagneten. Zodra de mnuchin-pin is uitgelijnd, gebruikt u een dunne stalen draad om een kleine druppel UV-geactiveerde lijm aan het stompe uiteinde van de mnuchin-pin aan te brengen. Manipuleer de pin nu zodanig dat de lijmdruppel het thorax van de vliegen net boven de kop raakt.

Zorg ervoor dat er niet te veel lijm wordt gebruikt. Bij de juiste druppelgrootte moet de lijm een bolletje vormen en van de speld over het thorax vloeien. Hard vervolgens de lijm uit met twee korte bursts van 22 seconden UV-licht.

Zodra het vastzetten is voltooid, wordt met een pincet een klein vierkant Kimwipe-doekje aan elke vlieg aangeboden vanwege een instinctieve landreflex. De vliegen zullen zich aan de Kimwipes vasthouden. Na een herstelperiode van één uur zijn de vastgezette vliegen klaar voor de experimenten.

Om een vloeiende bewegingsvrijheid van 360 graden te bereiken, is het essentieel om de magneten correct uit te lijnen. Houd hiervoor de onderste ringmagneten horizontaal vast met een plastic huls en plaats deze direct bovenop een transparante vacuümkamer. De bovenste staafmagneet is verticaal gefixeerd op ongeveer driekwart inch boven de onderste magneten, waarbij een V-dubbellager met epoxy aan het onderste oppervlak van de bovenste magneet is bevestigd.

Dit zal de positionering van de vliegen standaardiseren en de rotationele wrijving minimaliseren. Houd er rekening mee dat deze magneten gevaarlijk kunnen zijn en onjuist gebruik kan leiden tot beschadiging van apparatuur of licht lichamelijk letsel. Lijn vervolgens de bovenste en onderste magneten visueel ruwweg uit.

Door de bovenste staafmagneet direct boven het middelpunt van de onderste ringmagneten te plaatsen, is het handig om de bovenste magneet aan een micromanipulator te bevestigen voor fijne afstelling. Plaats nu een vlieg in de arena en pas de horizontale en verticale positie van de bovenste magneet aan totdat de vlieg aan het begin van elk experiment vloeiend en gestaag 360 graden kan roteren; controleer bij elke vlieg of de rotatie soepel verloopt om te garanderen dat de magneten correct zijn uitgelijnd en dat de mnuchin-pinnen niet beschadigd zijn. Als de opstelling onjuist is, zal de vlieg mogelijk helemaal niet spinnen.

Kan een beperkte bewegingsvrijheid hebben of kan roteren met inconsistente snelheden. Dit kan een probleem zijn met de verlijming, wat getest kan worden door een gestreept raster voor de vlieg te roteren om een omo-respons op te wekken. Als de vlieg niet spint of inconsistent spint, vervang deze dan door een andere vlieg.

Als deze vlieg niet correct draait en deze problemen zich bij elke vlieg voordoen, dan is het probleem waarschijnlijk te wijten aan de uitlijning van de magneten en zal verdere afstelling nodig zijn om een stabiele geur te bereiken. Voor het volgen van de initiële opstelling van het geursysteem moeten Teflon-buisjes met een kleine diameter worden gelegd van de gasmultiplexer naar de op maat gemaakte watergeurflacons. De uitlaat van deze flacons dient via dezelfde Teflon-buisjes rechtstreeks te worden verbonden met de hypodermische poortbuisjes.

Vervolgens wordt een heldere acryl vacuümkamer onder de arena geplaatst om de magneten te ondersteunen. Gebruik een glazen buis van vier millimeter, gemonteerd onder de vlieg en verbonden met de vacuümkamer, om de vacuümopening dichter bij de vlieg te brengen en de diameter van de opening te verkleinen. Plaats nu met een pincet een vastgezette vlieg in de arena.

Zodra de vlieg op zijn plaats is, schakelt u een aantrekkende geur in. U kunt visueel controleren of de vlieg zich in de richting van de geurpoort begeeft wanneer de geur wordt ingeschakeld. Als de vlieg geen voorkeur voor de geur lijkt te hebben, gebruik dan trial-and-error om de OMT te optimaliseren.

Pas eerst de positie van de geurpoort aan totdat de vlieg de geur lijkt te volgen. Hier zijn de geurpoorten gemonteerd op micromanipulatoren en gepositioneerd vier millimeter dorsaal en drie millimeter anterieur ten opzichte van de kop van de vlieg. Als het wijzigen van de positie van de geurpoort het volgen van de geur niet verbetert, pas dan de massastroomsnelheid aan totdat de vlieg de geur lijkt te volgen.

We gebruiken instellingen van zeven milliliters per minuut. Als het aanpassen van de massastroom niet leidt tot een verbetering van het geurvolgen, pas dan de stroomsnelheid van het vacuüm aan totdat de vlieg de geur lijkt te volgen. We stellen de vacuümstroomsnelheid in op 13 liters per minuut met behulp van een stroomregelaar.

Zodra de positie van de poort en de stroomsnelheden zijn ingesteld, moet er periodiek worden gewisseld tussen het toedienen van waterdamp en geurdamp met behulp van een schakelbare gasmultiplexer. Als de apparatus correct is opgezet, zouden twee dingen geobserveerd moeten worden. Ten eerste zou een vastgezetten vlieg in de OMT, onder constante roterende visuele stimuli, vloeiend 360 graden moeten draaien om de verticale ya-as; schokkerige draaiingen, genaamd kos, zijn kenmerkend voor spontaan draaigedrag bij afwezigheid van constante visuele stimuli.

Als vliegen niet soepel kunnen roteren, kan dit te wijten zijn aan onjuiste verlijming en verkeerd uitgelijnde magneten. Ten tweede moet u controleren of de vlieg in de richting van de geurpoort beweegt wanneer de geur wordt ingeschakeld. Wanneer de geur wordt uitgeschakeld, moet de vlieg spontaan zoeken zonder voorkeur voor een specifieke positie in de arena.

Als de vliegen de geurpluim niet actief volgen, kan dit betekenen dat u de positie van de geurpoort, de luchtstroomhoeveelheid en/of de vacuümsnelheid moet aanpassen. We hebben u zojuist laten zien hoe u een vlieg vastzet voor gebruik in een olfactorisch magnetisch tether-apparaat. We hebben u ook laten zien hoe u de magneten en geurpoorten correct uitlijnt en hoe u de massastroomsnelheden voor het geurafgiftesysteem instelt.

Dat is alles. Bedankt voor het kijken en veel succes met uw experimenten.