Micro-Array aandrijving voor chronische In vivo Opname: Tetrode Assembly

In dit protocol beschrijven we de vervaardiging en installatie van Tetros-bundels van vier elektroden voor chronische in vivo registratie bij waakvrije knaagdieren om te beginnen met de vervaardiging van de tetro's. Een streng microelektrode-draden wordt twee keer dubbelgevouwen om een bundel van vier parallelle draden te maken. Deze draden worden vervolgens samen gedraaid en gefixeerd met een hettepistool.

Elke voltooide tero wordt in een opbergdoos geplaatst. Terwijl er meer tero's worden gemaakt, wordt elke tero door een speciaal daarvoor bestemd pad geschoven, dat via een opening in een lineaire actuator binnenkomt en via de basis van de micro-drive array uitgaat. Elk van de vier draden van de tero wordt verbonden met afzonderlijke pinnen op een uitgangconnectorplaat die aan de bovenzijde van de micro-drive array is bevestigd.

De impedantie van elk kanaal van de tero wordt verlaagd met behulp van een verguldingsproces via galvanisatie. Zodra alle tero's zijn geïnstalleerd en gegalvaniseerd, worden twee aardingsdraden bevestigd aan de respectievelijke pinnen op de connectorplaat, en wordt er, nadat de kegel is geaard, een beschermende kegel aan het frame van de micro-drive array bevestigd ter bescherming. Een volledig functionerende Tero micro-drive array, klaar voor implantatie. Hallo, ik ben Dave Nian van het laboratorium van Nat Wilson aan het Pickout Institute for Learning and Memory.

Vandaag laten we u bij MIT een procedure zien voor het fabriceren van teros, het laden van teros en het voltooien van de laatste fasen van de reconstructie van de micro-drive. We gebruiken deze procedure in ons laboratorium om gecoördineerde neurale activiteit tussen grote populaties en neuronen in een preparaat van een wakker, bewegend dier te bestuderen. Laten we beginnen.

Om de tero voor onze standaard micro-drive array te maken, beginnen we met een stuk geïsoleerde 12 micron microme-draad van 50 centimeter. Vouw de draad dubbel en strijk met uw vingers langs het paar om ze aan elkaar te laten hechten. Zorg ervoor dat het draadpaar over de gehele lengte goed contact maakt.

Vouw het paar opnieuw door de twee uiteinden tegen elkaar aan te houden. Zorg ervoor dat de lus aan één uiteinde niet geknikt is. Knip de vier draden aan het uiteinde zonder lus af, zodat de vier punten op één lijn liggen.

Voor de volgende stap heeft u een aangepaste krokodillenclip, een gemotoriseerd draaiapparaat en een horizontale stang boven het draaiapparaat nodig. De krokodillenclip is aangepast door een plastic staafje aan de basis van de clip te lijmen. Wanneer de uiteinden zijn blootgelegd, klemt u de vier draden samen met de aangepaste krokodillenclip.

Hang de lus van draad over de horizontale stang. Plaats de krokodillenclip in de gemotoriseerde tafel. Voer ongeveer drie minuten lang 80 rechtsom draaiingen uit, gevolgd door 40 linksom draaiingen aan het draadbundel.

Deze parameters kunnen naar eigen behoefte worden aangepast. Nadat het tero-draaien is voltooid, worden de draden aan elkaar gesmolten door ze vanuit drie verschillende hoeken te verhitten met een hittepistool. Gebruik voor elke hoek een gemiddelde tot lage luchtstroom en begin één tot twee centimeter onder het punt waar de bundel draden splitst. Beweeg het hittepistool vervolgens op een afstand van twee centimeter van de draden naar beneden en naar boven gedurende ongeveer vijf seconden.

Houd er rekening mee dat hoge temperaturen de isolatie volledig zullen doen smelten en tot kortsluitingen kunnen leiden. Nu de draden met elkaar zijn versmolten, verwijdert u de tero uit het teweelapparaat door de krokodillenklem voorzichtig op te tillen om de spanning op de tero te verminderen, en knipt u de tero vlakbij de krokodillenklem door. Knip aan het andere uiteinde de lus zo door dat er vier ongemerkte draden van gelijke lengte overblijven. Scheid vervolgens de individuele draden aan de bovenkant door de draden voorzichtig te buigen met een pincet met zachte punten.

De tero is nu klaar om in de micro drive-array te worden geladen. Maak nog 21 tot 25 Tet-wegen en bewaar deze in een stofvrije doos totdat het tijd is om door te gaan met het tero-laadproces. U heeft een volledige micro drive-array nodig als u er nog geen heeft gebouwd.

Raadpleeg de video over de micro-elektrode-aandrijvingsmatrix voor de fabricage van de micro-aandrijvingsmatrix voor chronische in vivo opname in ons ontwerpplan. De tero wordt aan één uiteinde bevestigd aan de connectorhardware en loopt door de poly mid-draaghuls in de micro-aandrijving, zodat de elektrodepunten onder de basis van de micro-aandrijvingsmatrix uitsteken. We zullen nu dit laadproces voor één tero demonstreren.

Bouw voordat u begint de drive-houder die aan de ene kant aan de connectorplaat kan worden bevestigd en aan de andere kant kan worden vastgeklemd door een bak met ijs. In dit voorbeeld is de drive-houder een milax-connector die is gelijmd aan één uiteinde van een X exacto-messteel. Houd de tetrode vast met zachte pincetten en duw, met behulp van een stereoscoop, de punt van de tetrode in de poly-mid dragersbuis van een van de micro-drives. Duw de tetrode in de buis totdat de individuele elektrodedraden zich dicht bij de connectorplaat aan de bovenkant van de drive-array bevinden. Wees voorzichtig om de draden niet te knikken of te buigen, aangezien de tetrode anders onder een hoek in plaats van loodrecht het brein zal binnendringen, wat de integriteit van de tetrode zal verzwakken.

Voer nu voorzichtig het andere uiteinde van de vier draden met een zachte pincet in de respectievelijke gaten van de elektrode-interfacekaart. Voorkom opnieuw dat de draden knikken of buigen. Wanneer alle vier de draden op hun plaats zitten, duwt u de gouden pinnen met een tang met een verkorte onderkaak in hun gaten.

Wanneer de pinnen in het gat worden geduwd, wordt de isolatie van de draad verwijderd en ontstaat er een elektrische verbinding voor latere referentie. Houd de mapping tussen de microdrives en de pinpositie op de elektrode-interfacekaart bij. Ga door met het laden van in totaal 18 tetroden.

De drie overgebleven micro-aandrijvingen op de array worden gebruikt om de referentie-elektroden te huisvesten. Elke referentie-elektrode is gemaakt van een tero die slechts één van de vier niet-gebonden yns gebruikt. Om de referentie-elektroden te bevestigen, volgt u de laadprocedure, maar bevestigt u slechts één van de vier elektroden aan de betreffende referentie-elektrodepin op de connectorplaat.

Als u opnames op meerdere locaties plant, kan het nuttig zijn om de verbindingen van de tetro's naar de connectorplaat vooraf uit te stippelen. Cluster bijvoorbeeld tetro's die op één anatomische regio zijn gericht samen op de elektrode-interfaceplaat. Dit moet de mogelijkheid minimaliseren om tijdens de experimenten de verkeerde tetro aan te passen.

Zodra het laden van de tero is voltooid, maakt u twee aardingsdraden, één voor het dier en één voor de beschermende kegel. Knip een geïsoleerde stalen draad van zes inch lang af en verwijder met een metalen pincet drie millimeter isolatie van beide uiteinden van de draad. Knip vervolgens een geïsoleerde stalen draad van vier inch lang af.

Verwijder drie millimeter isolatie aan het ene uiteinde en één centimeter aan het andere uiteinde. Leid de aardingsdraad van zes inch door het gat aan de zijkant van de micro-drive array en omhoog naar de interfacekaart. Verbind de blootgestelde draad met de elektrode-interfacekaart met een gouden pin in het daarvoor bestemde aardingsgat.

Deze draad wordt verbonden met de schedel van het dier. Leid de randaarddraad van vier inch parallel aan de eerder geïnstalleerde randaarddraad. Verbind het gestripte uiteinde van drie millimeter met de electrode-interfacekaart via een gouden pin in een ander aangewezen aardgat.

Deze draad wordt later verbonden met een beschermende kegel, die zal fungeren als een kleine kooi van Faraday om ruisopname te verminderen. We zijn nu klaar met het aansluiten van de draden en kunnen overgaan tot het verfijnen van onze teros. Ons doel bij dit proces is om alle teros zo te knippen dat ze iets langer zijn dan de diepte van de doelstructuur in de hersenen in ons voorbeeld.

De micro-drives zijn ontworpen voor een maximale verplaatsing van vijf tot zes millimeter, wat voldoende is om veel neocorticale gebieden en de dorsale hippocampus van een volwassen rat te bereiken. Laat eerst alle micro-drives zakken zodat de tetrodes gelijktijdig maximaal zijn blootgesteld. Knip alle tetrodes af op lengten die ongeveer vijf millimeter langer zijn dan de gewenste uiteindelijke lengte, waarbij een scherpe fijne schaar wordt gebruikt voor de laatste knip.

Bereid een paar gekartelde scharen voor in een pan met ijs; klem één handvat vast met een lichte hoek naar beneden en met de kartelingen naar boven gericht, terwijl het andere handvat vrij blijft hangen. Trek nu alle Tet-elektroden volledig terug in hun geleidingscanule door de micro-aandrijvingen omhoog te draaien. Gebruik een stereoscoop om één Tet-elektrode volledig uit de canule te schuiven.

Positioneer de gekartelde schaar met behulp van een liniaal op de gewenste afstand van de canulegeleider. Knip de tero langzaam en voorzichtig door met één vloeiende beweging. Nadat de tero is doorgeknipt, wordt de micro-drive drie tot vier millimeter omhoog getrokken.

Herhaal dit proces voor elke tero totdat ze allemaal zijn gesneden. Op dit punt bent u klaar voor het vergulden. Vergulden.

De ro teros is cruciaal voor stabiele opnames op de lange termijn. Het voorkomt corrosie en verbetert de biocompatibiliteit. Stel de impedantiemeter in op de externe modus in de stroomgenerator en de DC-controlemodus met audio-uitgang.

Plaats de twee elektroden van de stroomgenerator op de zes mogelijke paren kanalen binnen elke tero en gebruik de audiofeedback om vast te stellen of er kortsluitingen tussen de paren bestaan. Een kortsluiting tussen kanaalparen klinkt als volgt. Als er sprake is van een kortsluiting, knip de tero dan opnieuw door met gekartelde scharen en test dit opnieuw.

Als het probleem aanhoudt, gooi dan de Tet-road weg en vervang deze. Verschuif alle micro-drives naar beneden en breid alle Tet-roads zoveel mogelijk uit. Pas de configuratie van de apparatuur aan om de impedantie van de elektroden te controleren.

Dompel nu de uiteinden van alle teros in een bad met standaard verguldingsoplossing. Het goudbad is elektrisch verbonden met de negatieve aansluiting van de impedantiemeter. Controleer de impedantie van de elektrode door de positieve aansluiting van de impedantiemeter tegen de overeenkomstige pin op de connectorplaat te plaatsen.

Meet en noteer de impedantie van elke draad op de micro-drive array. Normale waarden liggen tussen één en drie megaohm op de stroomgenerator. Stel de stroom in op één tot drie µA.

Vervolgens zorgvuldig. Bevestig de positieve lead van de impedantiemeter aan de pin op de connectorplaat. Op de impedantiemeter.

Schakel snel van de normale modus naar de bypass-modus en weer terug terwijl u zich in de bypass-modus bevindt. De stroom zal door de Tet-weg en de goudoplossing vloeien, waardoor er goud op de elektrodepunt wordt geplate. De impedantie na elke platingronde moet lager zijn dan daarvoor.

Herhaal de huidige puls. Als de impedantie niet onder één mega ohm is gezakt. Een conservatief bereik van aanvaardbare impedanties ligt tussen 250 kilo ohm en 350 kilo ohm.

Als de impedantie onder de 200 kilo ohm zakt, kan dit duiden op een kortsluiting. Als de impedantie na herhaalde pulsen onvoldoende daalt, kan de tip van de elektrode verstopt zijn. Snijd de tero opnieuw, controleer op kortsluiting en herhaal het verguldingsproces.

Als opnieuw snijden niet helpt, vervang dan de tero en begin opnieuw. Dompel alle tero's na het platingproces in ethanol en laat ze drie tot vijf minuten drogen. Test de tero's op kortsluiting met de stroomgenerator terwijl de tero-tips aan de lucht zijn blootgesteld.

Als er een DC-verbinding bestaat tussen twee of meer elektroden van een tero, snijd de tero dan opnieuw door en verguld deze opnieuw. Nadat het vergulden van alle tero's is voltooid, plaatst u alle tero's in de drive. Als laatste stap brengt u aan de bovenzijde van elke micro drive een druppel cyanoacrylaatlijm van gemiddelde dikte aan op de interface tussen elke tero en de bijbehorende poly-tubing.

Hiermee wordt de tero aan de microdrive vastgezet. Het doel van de beschermkap is om de microdrives en de blootliggende tero-draad tegen de omgeving af te schermen. Het biedt daarnaast ondersteuning bij het hanteren tijdens een experiment en vermindert elektrische ruis.

Wij maken gebruik van een 3D-geprinte plastic kegel. Het is echter mogelijk om de kegel van andere materialen te maken, zoals een gebogen stuk frisdrankblik. Men kan de plastic kegel nemen en aluminiumfolietape aan het binnen- of buitenoppervlak bevestigen.

Steek eerst 3 schroeven met maat 1 72 en een lengte van drie zestiende inch in de zijkanten van de kegel terwijl de aandrijfmateriaalset is opgehangen, en draai ze gedeeltelijk vast. Plaats de kegel over de aandrijving. Zorg ervoor dat beide aardingsdraden vanuit de onderkant van de aandrijfmateriaalset uitsteken.

Wikkel het blootliggende deel van de vier inch lange aarddraad meerdere keren rond een van de 1 72 schroeven en draai de schroef vast. Bevestig de kegel stevig aan de aandrijfbasis door de overige twee kegelschroeven aan te draaien. De productie van de micro-aandrijfarray is nu voltooid. Uw micro-aandrijfarray is geladen met 18 teros in drie referenties.

Het is voorzien van een beschermende kegel en kap voor duurzaamheid. De voltooide drive weegt gewoonlijk gemiddeld 20 tot 25 gram.

De voltooide drive-array wordt geïmplanteerd via een standaard chirurgische procedure. Zoals u kunt zien, is de drive verbonden met een voorversterkerchip en een bundel draden die het signaal naar de hardware en software voor gegevensverwerving geleiden. We hebben u zojuist laten zien hoe u teros maakt en hoe u de constructieprocedure van de micro-drive-array voltooit.

In deze video hebben we laten zien hoe u teros fabriceert, laadt en conditioneert voor in vivo registratie. Daarnaast hebben we laten zien hoe u een kegel aan de micro-driver array toevoegt om deze op lange termijn robuust te maken. De constructie van de micro-driver array omvat vele stappen; wees daarom geduldig, ga voorzichtig om met de elektroden en zorg ervoor dat alle tussentijdse stappen correct zijn voltooid.

Bedankt voor het kijken en veel succes met uw experimenten.