Zuivering en Visualisatie van Influenza A Viral ribonucleoproteïne Complexen

Deze procedure begint met het verwijderen van onzuiverheden uit de influenzavirusoplossing door middel van centrifugatie. Vervolgens wordt het virale membraan opengebroken met een detergent en worden de vrijgekomen VR np's gescheiden op een glycerolgradiënt.

Centrifugatiefracties uit de gradiënt worden verzameld en van elke fractie wordt een aliquot geanalyseerd. Op een SDS-PAGE worden de gels gekleurd met Coomassie blauw om de piekfracties die V NP's bevatten te bepalen. De fracties die V NP's bevatten, worden vervolgens geconcentreerd door centrifugatie en de gezuiverde VRP's worden aangebracht op een koperen TEM-objectglas, dat vervolgens negatief wordt gekleurd voor visualisatie van de VRP's via transmissie-elektronenmicroscopie. Hallo, ik ben WinCo Wu in het laboratorium van Dr. Nellie Pane van de afdeling Zoölogie aan de University of British Columbia.

Ik ben Lindsay Weaver, voorheen van het Pane Lab. Vandaag laten we u een procedure zien voor de zuivering van influenza, virale ribonucleoproteïnecomplexen. We gebruiken deze procedure in ons laboratorium om de nucleaire import van het influenzavirus A in weefselkweekcellen te bestuderen.

Laten we beginnen. Start het experiment door 750 µL MNT-buffer in een Beckman polycarbonaat centrifugebuis van 11 mm bij 34 mm te brengen. Voeg vervolgens 500 µL van een influenza A-virusoplossing van 2 mg/mL toe aan de buis en pipetteer dit meerdere keren op en neer om het virus met de MNT-buffer te mengen.

Plaats na het mengen de buis in een TLA one 20.2 rotor en centrifugeer deze 10 minuten bij 109.000 ×g bij vier graden Celsius in een Beckman Optima max E centrifuge. Verwijder na afloop van de centrifugatie het supernatant en resuspendeer het pellet in 500 µL disruptiebuffer door het pellet krachtig te vortexen. Schud vervolgens 20 minuten bij 31 graden Celsius in een Eppendorf ThermoMixer.

Wanneer het schudden is voltooid, wordt overgegaan tot sedimentatiesnelheids-centrifugatie in een glycerolgradiënt. Om de glycerolgradiënt voor te bereiden, plaatst u de volgende hoeveelheden glycerol in een Beckman UltraClear centrifugebuis van 13 millimeter bij 51 millimeter: 1 milliliter 70% (volume/volume) glycerol, 0,75 milliliter 50% glycerol, 0,375 milliliter 40% glycerol en 1,8 milliliter 33% glycerol. Deze glyceroloplossingen worden bereid door pure glycerol te mengen met NM-buffer.

Bereid daarnaast een balanceerbuis voor die zowel glycerol als buffer bevat. Vortex vervolgens het gedisrupteerde virale monster opnieuw en breng dit over op de glycerolgradiënt. Plaats de buis in een Beckman MLS 50 swinging bucket rotor en centrifugeer de gradiënt gedurende drie uur en 45 minuten bij 217.000 ×g bij vier graden Celsius.

Nadat de centrifugatie is voltooid, worden er handmatig aliquoten van 250 µL van de gradiënt verzameld, beginnend aan de bovenkant van de buis. Bewaar de fracties op ijs of bij vier °C. Zodra de fracties zijn verzameld, kunnen deze worden geanalyseerd middels SDS-polyacrylamidegelelektroforese.

Om te beginnen met de SDS-PAGE-analyse, brengt u 20 µL van elke fractie over naar een nieuw buisje. Voeg vervolgens vijf µL van een 5x SDS-PAGE-monsterbuffer toe en verhit het monster vijf minuten lang tot 95 °C. Centrifugeer de monsters na verhitting kort en breng ze aan op een 10% polyacrylamidegel; voeg in een van de wells molecuulgewichtmarkers toe. Laat de monsters vervolgens door de gel lopen totdat de bromfenolblauw-laadkleurstof bijna de onderkant van de gel bereikt.

Verwijder de gel uit het SDS-PAGE-apparaat en kleur de gel met Coomassie Blue. Identificeer op basis van de kleuringsresultaten de fracties die voornamelijk influenza nucleoproteïne bevatten.

Het influenza A NP is ongeveer 56 kilodalton groot en is het belangrijkste eiwit dat in virale ribonucleoproteïnecomplexen wordt aangetroffen. Daarom is de NP-band doorgaans de sterkste band in de fracties die VRNP's bevatten. In het volgende deel zullen we deze VRNP-fracties concentreren.

Combineer de glycerolfracties die hoofdzakelijk NP bevatten en verdeel deze over twee Beckman polycarbonaatcentrifugebuizen van 11 millimeter bij 34 millimeter; vul elke buis met met ethylpyrocarbonaat of DEPC behandeld ultrapuur water. Pipetteer vervolgens meerdere keren op en neer om te mengen. Plaats de buizen in een Beckman TLA 120.2 rotor en centrifugeer gedurende vier en een halve uur bij 157 000 ×g bij 4 °C.

Verwijder na voltooiing van het centrifugeren het supernatant en resuspendeer de pellet. Verdeel de gezuiverde V NPS in aliquots van 50 µL DEPC-behandeld water; zet één aliquot apart en bewaar de overige bij -80 °C. We kunnen nu verdergaan met de negatieve kleuring van VRP's.

Verdun één µL gezuiverde VRNP in negen µL vers bereide en tweemaal gefilterde PBS-buffer; voer een glow discharge uit op een koperen TEM-specimengrid gedurende 30 seconden. Dit grid was vooraf gecoat met een Parlow Dion- en koolstoffilm. Breng met een pincet, waarmee het vers behandelde specimengrid wordt vastgehouden, een druppel van vijf µL verdunde VRNP aan op het specimengrid.

Laat de druppel gedurende acht minuten in trekken op het raster terwijl u wacht. Plaats een klein strookje Parafilm in een bakje en breng vervolgens twee druppels van elk 10 µL PBS-buffer aan op de Parafilm, samen met een druppel van 80 µL van de vers bereide kleuringsoplossing, die bestaat uit 1% ammoniummolybdaat. Was nu het monster-raster door het voorzichtig in de twee druppels PBS te laten zakken voor een totale tijd van één minuut.

Gebruik vervolgens een stuk filterpapier om een deel van de monsteroplossing van het monsterrooster weg te zuigen zonder het monsterrooster te laten uitdrogen. Dompel het monsterrooster direct nadat de laatste druppel buffer van het monsterrooster is weggezogen volledig onder in de druppel kleurstof. Wacht vervolgens één minuut.

Gebruik na één minuut een nieuw stuk filterpapier om de kleuringsoplossing volledig van het monsterrooster te absorberen. Laat het monsterrooster enkele minuten aan de lucht drogen voor observatie. Hieronder volgen representatieve transmissie-elektronenmicroscopiebeelden van negatief gekleurde V nps, gemaakt met een transmissie-elektronenmicroscoop.

Zoals hier te zien is, lijken de V NPS op staafvormige deeltjes met een variabele lengte van ongeveer 30 nanometer tot 120 nanometer. Het oligomere NP is georganiseerd als een keten van NP-moleculen die verder is gevouwen in een dubbele helicale herhalingsstructuur. Daarom kunnen er soms lussen aan beide uiteinden van deze staafvormige deeltjes worden waargenomen.

We hebben zojuist gedemonstreerd hoe u influenza-virale ribonucleoproteïnecomplexen kunt zuiveren en visualiseren. Bij het uitvoeren van deze procedure is het belangrijk om geen PBS te gebruiken bij het verdunnen van de vRNPs als u uranylacetaat gebruikt voor negatieve kleuring.

Dat was alles. Bedankt voor het kijken en veel succes met uw experimenten.