Elektrofysiologische methoden voor opname Synaptic Potentials van de NMJ van Drosophila Larven
February 6th, 2009
Hier beschrijven we elektrofysiologische methoden voor het meten van synaptische transmissie bij de neuromusculaire junctie van Drosophila larve. Evoked release wordt kunstmatig geïnitieerd door het stimuleren van de motorische neuron axonen, en de transmissie door middel van de NMJ kan worden gemeten door de postsynaptische respons opgeroepen in de spier.
Om stabiele elektrofysiologische opnames te maken van Joof-larven neuromusculaire knooppunten. Eerst een larve opengesneden om de lichaamswand, spieren en zenuwstelsel bloot te leggen voorafgaand aan het opnemen. De axonen aan de basis van het centrale zenuwstelsel worden achter het ventrale ganglion doorgesneden.
Vervolgens wordt een opname-elektrode op de betreffende spier geplaatst en een stimulerende elektrode wordt in de buurt van de innerverende motorneuronen geplaatst. De afgesneden axonen van de motorneuronen worden in de stimulerende pijp gezuigd. Excitatie-knooppunt-potentialen kunnen dan worden opgenomen.
Hallo, ik ben Wendy MLA van het McCabe Lab in het Department of Physiology and Cellular Biophysics aan de Columbia University. Vandaag laten we je een procedure zien voor het meten van tic-transmissie bij het neuromusculaire knooppunt van GE-lava. We gebruiken deze procedure in ons laboratorium om synaptische fysiologie en neurotransmissie te bestuderen.
Dus laten we beginnen. Om het experiment te starten, snijden we zwervende derde en ster-larven open om de lichaamswand bloot te leggen. Dit protocol is aangepast voor elektrofysiologische experimenten door het gebruik van korte dissectiepennen.
Deze zijn ongeveer twee tot vier millimeter lang en raken minder snel het microscoopobjectief in de elektroden tijdens het experiment. Na het blootleggen van de lichaamswand, gebruiken we een pincet om het centrale zenuwstelsel vast te houden en het lichtjes omhoog te brengen. Snijd vervolgens de perifere motorische zenuw-axonen door en verwijder de hersenen.
Na het verwijderen van de hersenen wassen we de gedissecteerde voorbereiding twee keer met HL 3.1-buffer met één millimolair calcium. Nu de dissectie voltooid is, kunnen intracellulaire opnames gemaakt worden van de larvale spiercellen. Plaats de dissectieplaat op de elektrofysiologie-microscoop en dompel de voorbereiding onder met HL 3.1-buffer plus calcium.
Bevestig vervolgens de bad-elektrode zodat deze in contact komt met de oplossing. De zuig-elektrode wordt gebruikt om de perifere zenuwen te stimuleren die de spier innerveren. Plaats de zuig-elektrode eerst in het bakje om trillingen te voorkomen wanneer de intracellulaire elektrode op de spier wordt geplaatst.
Zodra de elektrode in het bakje zit, plaats deze dicht bij de motorneuron die spier zes innerveert. In het derde abdominaal segment, oefen voorzichtige zuigkracht uit totdat de doorgesneden zenuw zich binnen de glazen pijp bevindt. Wees voorzichtig om de zenuwen niet uit te rekken wanneer zuigkracht wordt toegepast.
Til de pijp lichtjes op zodat deze de spier niet raakt. En plaats het zo dat het niet aan de doorgesneden zenuwvezels trekt. Zodra de zuig-elektrode op zijn plaats zit, plaats de opname-elektrode voor de intracellulaire opnames.
Gebruik een scherpe micro-elektrode gevuld met drie molare kaliumchloride. Plaats de opname-elektrode boven het centrum van spier zes. Pas de input-offset aan zodat deze nul leest voor de badoplossing.
Laat de elektrode langzaam zakken en nadert de spier onder hoge optische vergroting tot deze het spieroppervlak raakt. Om te bevestigen dat de spier is gepenetreerd, kijk naar de oscilloscoop. Het rustmembraanpotentiaal zou minstens negatief 60 millivolt moeten zijn.
Sporadische miniatuur-nplate-potentiaal zou nu zichtbaar moeten zijn. Zodra de opname-elektrode op zijn plaats is, laat de cellen een minuut stabiliseren. Voordat u begint met de opnames, gebruikt u een axon HS two, een hoofdtrap in een axon clamp two B-versterker om veranderingen in het membraanpotentiaal te detecteren.
De axon clamp two B is verbonden met een computer die P clamp-software draait via de digit data. 1322 A, die het signaal digitaliseert. Neem het membraanpotentiaal op op een PC. Met clamp X-software, breng stimuli aan op de motorische axon om excitatie-membraanpotentiaal of ejs te genereren.
Zodra de ejs gegenereerd zijn, neem de miniatuur-ejs op over een periode van drie minuten zonder stimuli-synapse. Soft mini-analysesoftware kan worden gebruikt om de sporen te analyseren en de mini EJP-amplitude en frequentie te bepalen. Om ejs te genereren.
Gebruik een master eight-pulsgenerator om te stimuleren naar het afgesneden uiteinde van een motorneuron-programma. De generator levert 0,3 milliseconde vierkante voltagepulsen programma. Er is een interval van vijf seconden tussen de stimuli om synaptische herstel mogelijk te maken.
Bij het NMJ registreer ten minste 10 geïnduceerde potentiaal van elke spier en bereken de gemiddelde amplitudes. Deze figuur toont een typische trace die is opgenomen van spier zes van een wilde-type sal-larve met geïnduceerde EJP-reacties en spontane mini EJ.PS We hebben je zojuist laten zien hoe je cy-potentiaal opneemt van het neuromusculaire knooppunt van drosophila-lava. Bij het uitvoeren van deze procedure, is het belangrijk om te onthouden de dissectie binnen drie tot 10 minuten te voltooien en de elektrofysiologische opnames onmiddellijk te starten terwijl de cellen nog gezond en responsief zijn.
Als de dissectie te lang duurt, zal het rustmembraanpotentiaal van spiercellen minder dan min 60 millivolt zijn, wat te laag is om op te nemen. Dus dat was het. Bedankt voor het kijken en veel succes met je experimenten.
View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos
Overzicht
Dit artikel beschrijft elektrofysiologische methoden voor het meten van synaptische transmissie op de neuromusculaire junctie (NMJ) van Drosophila-larven. Het proces omvat het dissekeren van de larven om de lichaamswand en het zenuwstelsel bloot te leggen, gevolgd door het plaatsen van opname- en stimulerende elektroden om excitatoire junctiepotentialen te meten.
Belangrijke studiecomponenten
Wetenschapsgebied
- Elektrofysiologie
- Neurowetenschappen
- Synaptische transmissie
Achtergrond
- Het begrijpen van synaptische transmissie is cruciaal voor inzichten in neurale communicatie.
- Drosophila-larven dienen als modelorganisme voor het bestuderen van NMJ.
- Elektrofysiologische technieken maken nauwkeurige metingen van synaptische activiteit mogelijk.
- Evoquering release op de NMJ kan kunstmatig worden gestimuleerd voor analyse.
Doel van het onderzoek
- Om methoden voor het opnemen van synaptische transmissie op de NMJ te demonstreren.
- Om een protocol te bieden voor onderzoekers die geïnteresseerd zijn in elektrofysiologische studies.
- Om het begrip van neuromusculaire signaleringsmechanismen te verbeteren.
Gebruikte methoden
- Dissectie van Drosophila-larven om spieren en zenuwstelsel bloot te leggen.
- Plaatsing van opname-elektroden op de belangrijke spier.
- Gebruik van stimulerende elektroden nabij motorneuronen.
- Opname van excitatoire junctiepotentialen na stimulatie.
Belangrijkste resultaten
- Succesvolle meting van synaptische transmissie op de NMJ.
- Demonstratie van evoquerende excitatoire junctiepotentialen.
- Validatie van de elektrofysiologische benadering voor het bestuderen van NMJ.
- Inzichten in de dynamiek van synaptische signalering in Drosophila.
Conclusies
- De beschreven methoden bieden een betrouwbare aanpak voor het bestuderen van NMJ-transmissie.
- Elektrofysiologische opnames kunnen belangrijke aspecten van synaptische functie onthullen.
- Dit onderzoek draagt bij aan het bredere begrip van neuromusculaire interacties.
Veelgestelde vragen
Executive Industry Relevance
Electrophysiological recording at the Drosophila larval neuromuscular junction (NMJ) provides a genetically tractable, quantitative platform for interrogating synaptic function and neurotransmission. This model enables high-confidence target validation and mechanistic de-risking in early discovery, supporting predictive assessment of synaptic modulation and genetic perturbations. The approach is directly relevant for portfolio teams seeking robust, reproducible systems for neurobiology-driven drug discovery.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables direct measurement of synaptic transmission and quantal content for functional target validation.
- Supports mechanistic de-risking by isolating genetic or pharmacological effects on neurotransmission.
- Facilitates hypothesis-driven interrogation of synaptic pathways in a defined, manipulable system.
Screening & Assay Development
- Provides a standardized, reproducible assay for quantifying excitatory junction potentials (EJPs) and miniature EJPs (mEJPs).
- Delivers quantitative outputs suitable for comparative analysis across genetic backgrounds or compound treatments.
- Enables preparation of validated biological systems for downstream screening workflows.
Translational & Preclinical Research
- Aligns with disease-relevant synaptic mechanisms for translational continuity in neurobiology programs.
- Supports risk-adjusted advancement by providing predictive data on synaptic function and modulation.
- Offers a bridge from genetic discovery to preclinical validation in neuromuscular and synaptic disorders.
Pipeline & Workflow Integration
This electrophysiological method integrates into the discovery continuum from early target validation through assay development and preclinical research, enabling iterative hypothesis testing and mechanistic evaluation.
- Discovery Biology: Supports null hypothesis testing and pathway clarification by quantifying synaptic responses to defined manipulations.
- Screening: Delivers reproducible, quantitative readouts of EJP amplitude and frequency for robust assay development.
- Analytics: Provides digitized, statistically analyzable data for cross-condition and cross-genotype comparisons.
- Translational Research: Facilitates alignment with disease-relevant synaptic endpoints for preclinical continuity.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable, genetically flexible platform for ongoing neurobiology and synaptic function studies.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in synaptic target validation.
- Operational Value: Standardizes electrophysiological workflows for reproducibility and scalability across teams.
- Strategic Value: Enables informed go/no-go decisions and capital-efficient portfolio triage based on quantitative synaptic data.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization and advancement of neurobiology-focused assets.
Implementation Considerations
- Requires expertise in electrophysiology and Drosophila genetics for optimal execution.
- Demands specialized instrumentation, including microelectrodes, amplifiers, and digitization hardware.
- Necessitates cross-team standardization of dissection and recording protocols for reproducibility.
- Adaptable to various genetic backgrounds and experimental manipulations within the Drosophila system.
- Limited to model organism context; translational extrapolation requires careful validation.
