Elektrofysiologische methoden voor opname Synaptic Potentials van de NMJ van Drosophila Larven

Om stabiele elektrofysiologische opnames te maken van neuromusculaire juncties in Joof-larven. Dissekeer eerst een larve om de lichaamswand, spieren en het zenuwstelsel bloot te leggen voordat de opname begint. De axonen aan de basis van het CZS worden posterior ten opzichte van het ventrale ganglion doorgesneden.

Vervolgens wordt een registreerelektrode op de desbetreffende spier geplaatst en een stimulerende elektrode nabij de innerverende motorneuronen. De doorgesneden axonen van de motorneuronen worden in de stimulerende pipet gezogen. Vervolgens kunnen excitatoire junctiepotentialen worden geregistreerd.

Hallo, ik ben Wendy MLA van het McCabe Lab van de afdeling Fysiologie en Cellulaire Biofysica aan de Columbia University. Vandaag laten we u een procedure zien voor het meten van de synaptische transmissie bij de neuromusculaire overgang van GE-larven. We gebruiken deze procedure in ons laboratorium om de synaptische fysiologie en neurotransmissie te bestuderen.

Laten we beginnen. Om het experiment te starten, worden dwalende derde-stadiumlarven en stervormige larven gedisseceerd om de lichaamswand bloot te leggen. Dit protocol is aangepast voor elektrofysiologische experimenten door het gebruik van korte dissectiepinnen.

Deze zijn ongeveer twee tot vier millimeter lang en hebben een kleinere kans om tijdens het experiment het objectief van de microscoop of de elektroden te raken. Nadat de lichaamswand is blootgelegd, gebruikt u een pincet om het CZS vast te houden en het licht op te tillen. Snijd vervolgens de motorische axonen van de perifere zenuwen door en verwijder de hersenen.

Nadat het brein is verwijderd, wordt het gedissecteerde preparaat tweemaal gewassen met HL 3.1 buffer met één millimolar calcium. Nu de dissectie is voltooid, kunnen intracellulaire opnames worden gemaakt van de larvale spiercellen. Plaats de dissectieplaat op de elektrofysiologische microscoop en onderdompel het preparaat in HL 3.1 buffer met calcium.

Bevestig vervolgens de bad-elektrode zodat deze in contact staat met de oplossing. De zuigelektrode wordt gebruikt om de perifere zenuwen te stimuleren die de spier innerveren. Plaats eerst de zuigelektrode in de schaal om vibraties te voorkomen wanneer de intracellulaire elektrode op de spier wordt geplaatst.

Zodra de elektrode in het schaaltje is geplaatst, positioneert u deze dicht bij het motorneuron dat spier zes innerveert. Pas in het derde abdominale segment een zachte zuigkracht toe totdat de doorgesneden zenuw zich in de glazen pipet bevindt. Let erop dat de zenuwen niet worden uitgerekt wanneer de zuigkracht wordt toegepast.

Til de pipet iets op zodat deze de spier niet raakt. Positioneer deze vervolgens zodanig dat er geen trek aan de doorgesneden zenuwvezels wordt uitgeoefend. Zodra de zuigelektrode op zijn plaats zit, positioneert u de registratie-elektrode voor de intracellulaire registraties.

Gebruik een scherpe micro-elektrode gevuld met drie molar kaliumchloride. Positioneer de registratie-elektrode boven het centrum van spier zes. Pas de input-offset aan zodat deze nul aangeeft voor de badoplossing.

Laat de elektrode langzaam zakken en benader de spier onder hoge optische vergroting totdat deze het spieroppervlak raakt. Controleer de oscilloscoop om te bevestigen dat de spier is gepenetreerd. Het rustmembraanpotentiaal moet ten minste -60 millivolt zijn.

Sporadische miniature nplate-potentialen zouden nu zichtbaar moeten zijn. Zodra de registratie-elektrode op zijn plaats zit, laat u de cellen één minuut stabiliseren. Gebruik vóór het starten van de registraties een Axon HS two, een headstage in een AxClamp 2B-versterker om veranderingen in het membraanpotentiaal te detecteren.

De axle clamp two B is gekoppeld aan een computer waarop P clamp software draait via de digit data. 1322 A, die het signaal digitaliseert. Registreer de membraanpotentiaal op een pc. Breng met de clamp X software stimuli toe aan het motorisch axon om exciterende membraanpotentialen of ep's op te wekken.

Zodra de ejp's zijn gegenereerd, worden de miniature ejp's gedurende een periode van drie minuten opgenomen zonder stimulatie-synapsis. Soft mini-analysesoftware kan worden gebruikt om de sporen te analyseren en de amplitude en frequentie van de mini EJP te bepalen. Om ejp's te genereren.

Gebruik een master eight pulsgenerator om het doorgesneden uiteinde van een motorneuron te stimuleren. De generator moet vierkante spanningspulsen van 0,3 milliseconde afgeven. Hanteer een interval van vijf seconden tussen de stimuli om synaptisch herstel mogelijk te maken.

Registreer bij de NMJ ten minste 10 opgewekte potentialen van elke spier en bereken het gemiddelde van de amplitudes. Deze figuur toont een typisch spoor geregistreerd van spier zes van een wildtype sal-larve met opgewekte EJP-responsen en spontane mini EJ.PS. We hebben zojuist gedemonstreerd hoe cy-potentialen geregistreerd kunnen worden van de neuromusculaire junctie van drosophila-larven. Bij het uitvoeren van deze procedure is het belangrijk om te onthouden de dissectie binnen drie tot 10 minuten te voltooien en onmiddellijk te starten met de elektrofysiologische registraties terwijl de cellen nog gezond en responsief zijn.

Als de dissectie te lang duurt, zal het rustmembraanpotentiaal van de spiercellen lager zijn dan minus 60 millivolt, wat te laag is om te registreren. Dat was alles. Bedankt voor het kijken en veel succes met uw experimenten.