Name: Het meten van de buurt plasmamembraan en Global intracellulair calcium Dynamics in Astrocyten (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2009-04-26T23:27:00.000+00:00
Duration: 12 min 48 s
Description: Leer hoe u intracellulaire calciumdynamiek meet in astrocyten met behulp van geavanceerde microscopietechnieken. Deze methode omvat astrocyt-neuron co-cultures en simultane waarneming van globale en membraan-nabije calciumsignalen.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dit werk werd ondersteund door de Uehara Memorial Foundation van Japan (tot ES), alsmede de Whitehall Stichting, het Nationaal Instituut voor Neurologische Aandoeningen en Stroke en een Stein-Oppenheimer Endowment Award (voor BSK).

Experimentele procedures De experimentele procedure bestaat uit twee belangrijke onderdelen die hieronder worden beschreven in een stapsgewijze manier. Deel 1: VOORBEREIDING hippocampus astrocyten CULTUREN In het kort werden gemengd hippocampal astrocyten-neuron culturen bereid met behulp van een gevestigde protocol 1,2,3. We geoptimaliseerd de procedure om een ​​gezonde gekweekte astrocyten opleveren. Alle procedures hieronder vermelde moet worden uitgevoerd in een steriele omgeving, zoals een laminaire stroming kap. Voorbereiden coverslips <ul><li> 22 mm dekglaasjes (VWR, 48380-068) </li><li> Poly-D-Lysine (PDL, Sigma P0899), porties (1 mg / ml) </li><li> Laminine monsters (20 ug / ml): 49 ml steriel water toe te voegen aan 1 mg / ml laminine-oplossing (Sigma L2020), maken 1,2 ml porties en bewaar bij -20 ° C </li></ul><ol><li> Los PDL in steriel water (50 ug / ml) </li><li> Autoclave de dekglaasjes, spoelen met steriel water en plaats in de PDL (20 ml voor 100 dekglaasjes). &#39;S nachts vertrekken bij kamertemperatuur. </li><li> Vervang de PDL met steriel water (3 uitgebreide wasbeurten). Dan droog de dekglaasjes en bewaar bij 4 ° C. </li><li> De dag voor beplating van de astrocyten, plaats de individuele dekglaasjes in een steriele goed op een 6-well plaat (Multiwell Flat-bodemplaten met deksels, steriel van BD Bioscience). Doe 400 ul van laminine op elke dekglaasje en incubeer overnacht, in de couveuse om de verdamping te voorkomen. </li></ol> Ontleding Dissection media: <ul><li> 500 Balanced Salt ml Earle&#39;s Solution (EBSS) (1x), vloeistof (Invitrogen, 14.155-063) </li><li> 5 ml HEPES oplossing (Sigma, H0887) </li></ul> Hippocampale media: <ul><li> 412,5 ml Minimum Essential Medium (MEM) (1x), vloeibare Bevat Earle&#39;s zouten, maar geen L-glutamine of fenol rood (Invitrogen, 51200-038) </li><li> 10 ml glucose (Sigma, D-(+)-glucose WATERVRIJE SIGMA ULTRA G7528), een M in MEM </li><li> 5 ml penicilline-streptomycine (Invitrogen, 15140-122) </li><li> 5 ml natriumpyruvaat oplossing (Sigma, S8636) </li><li> 12,5 ml HEPES oplossing 1 M (Sigma, H0887) </li><li> 5 ml N-2 Supplement (100X), vloeistof (Invitrogen, 17.502-048) </li><li> 50 ml Horse Serum, hitte-geïnactiveerd (Invitrogen, 26050-088) </li></ul> Papaïne oplossing: <ul><li> Voeg 5 ml van de dissectie media in Worthington PAPAÏNE-022 flacon (LK003178; uiteindelijke concentratie van 20 U / ml) en incubeer bij 37 ° C gedurende 60 minuten. </li></ul><ol><li> Onthoofden rat pups leeftijd van P1 (normaal 2 pups) volgende richtlijnen gescreend en goedgekeurd door de nationale regelgeving en de lokale institutionele Dierverzorging en gebruik Comite. </li><li> Verwijder het vel en de schedel en de hersenen plaats in de petrischaal gevuld met koud dissectie media. </li><li> Verwijderde hersenvliezen, ontleden beide halfronden en ontleden hippocampus. </li><li> Hak de hippocampus naar ~ 1X1 mm stukken en verteren in papaïne oplossing bij 37 ° C gedurende 11-13 minuten. </li><li> Zodra de stukjes weefsel hebben gevestigd, te verwijderen papaïne voorzichtig en voeg 5 ml van de hippocampus medium om alle sporen van het enzym te verwijderen. Herhaal deze stap en resuspendeer in de hippocampus medium (2 ml). </li><li> Vermaal de cellen ~ 5 keer totdat er geen klonten links, met drie vlam gepolijst pipetten van steeds kleinere boringen (1000 pm, ~ en ~ 500 pm 300 pm). </li><li> Eenmaal gewreven, gaan de cellen door middel van een cel-zeef (poriegrootte, 70 micrometer, BD Bioscience). Tel de cellen in 10 ul van de opschorting. Pas het volume van de hippocampus medium om 400.000 cellen / ml hebben. </li><li> Zuig het laminine uit de dekglaasjes, en voor de covers kunnen drogen, plaat 200 pi van de celsuspensie per dekglaasje aan. </li><li> Laat ze te bevestigen voor 60 min in de couveuse, en daarna 2 ml van de hippocampus medium per well toe te voegen. </li><li> De volgende dag, aspiratie oud hippocampus medium om dode cellen en vuil te verwijderen en 2 ml van de voorverwarmde verse hippocampus medium toe te voegen. </li></ol> Onderhoud Neurobasal media: <ul><li> 500 ml neurobasal (Invitrogen, 12348-017) </li><li> 10 ml serum B27 gratis aan te vullen (Invitrogen, 17504-044) </li><li> 5 ml penicilline-streptomycine (Invitrogen, 15140-122) </li><li> 1,25 ml L-glutamine (Invitrogen, 25030-149) </li></ul> Voer de astrocyt-neuron culturen twee keer per week met neurobasal medium, te beginnen vier dagen na plating. Preincubate de media over 30 min in de incubator in een geventileerde kolf de temperatuur en de CO 2 evenwicht. Deel 2: CALCIUM IMAGING Hippocampus opname buffer: 110 mM NaCl, 5,4 mMKCl, 1,8 mM CaCl2, 0,8 mM MgCl2, 10 mM D-glucose, 10 mM HEPES (Alle chemicaliën van Sigma) pH 7,4 (ingesteld met NaOH). Het laden van calcium indicator kleurstof in astrocyten <ol><li> Plaats de cultuur in een goed op een 6-wells plaat gevuld met 2 ml hippocampus opname buffer met 2,5 uM Fluo-4, AM (Invitrogen, F-14217) en 0,05% Pluronic ® F-127 20%-oplossing in DMSO (Invitrogen, P-3000MP) en incubeer bij kamertemperatuur gedurende 10-30 minuten. </li><li> Verwijder Fluo-4-oplossing en was coverslips drie keer met de hippocampus opname buffer en incubeer bij kamertemperatuur gedurende 30 minuten. </li><li> Plaats het dekglaasje op de kamer, en reinig de andere kant van dekglaasje met lens reinigingsvloeistof. </li><li> Doe een kleine druppel immersie-olie (Immersion Olie Type DF uit Cargille) over de doelstelling en zet kamer (Open kamer voor 25 mm ronde dekglaasje van Warner Instruments) op het podium van de microscoop (Olympus IX71). </li><li> Kijk naar de cellen met behulp van transmissie-licht om te zien hoe de cellen kijken, en krijgen ze in focus. Dan verlichten de cellen met 488 nm uit een monochromator (V Polychrome van TILL Vision) en bepalen of de fluorescentie-signaal van Fluo-4 is uniform en aantoonbaar in astrocyten. </li><li> Gebruik EPI en TIRF verlichting aan calcium te meten in astrocyten. </li></ol> TIRF microscopie Kortom, we gebruik van een Olympus IX71 microscoop uitgerust met een Andor IXON DV887DCS EMCCD camera. De controle van excitatie en beeld acquisitie is bereikt met behulp van TILLVision software. De balken van 454/488/515 nm Argon (100 mW) en 442 nm solid state (45 mW) lasers worden gecombineerd en gecontroleerd met een TILL Polyline laser combiner, TIRF dual port condensor en acoustoptical afstembare filter en de controller (AOTF; allemaal uit TILL Fotonica) en ingevoerd in een Kineflex brede band vezel voor toetreding tot de TIRF condensor. We maken gebruik van een Olympus 60X 1,45 NA lens te TIRF te bereiken. De camera versterking is ingesteld voor elke astrocyten om het beste signaal te verstrekken aan ruis. De achtergrond en principes van TIRF microscopie zijn onlangs beoordeeld vier, vijf. Het merendeel van de optische componenten die we gebruiken werden gekocht van TILL Photonics, dat nu deel uitmaakt van Agilent Technologies (http://www.till-photonics.com/). De TIR-penetratie diepte kan worden berekend uit de vergelijkingen hieronder. <img style="float:left;" src="/files/ftp_upload/1142/equation.png" alt="Vergelijking" /> d = indringdiepte n1 = brekingsindex van glas n2 = brekingsindex van de cel a = hoek van inval NAi = numerieke apertuur van de incidentie Om ervoor te zorgen de laser is optimaal afgestemd voor TIRF we vinden het nuttig om 100 nm TL-bead (Invitrogen, F8803) te observeren. We hebben nu nog beelden en video&#39;s van kralen met EPI en TIRF microscopie. Wanneer u in TIRF, observeert men een dramatische toename in signaal-ruis en de kralen weer te geven Brownse diffusie. We vinden het nuttig om het gedrag van 100 nm kralen met TIRF microscopie op regelmatige basis (~ een keer per week) om er zeker van dat optimale TIRF gebeurt, in plaats van de besmette schuin verlichting die zich zou voordoen in acht als de kritische hoek waren niet gelijk aan α (zie figuur 1). Toepassing van de G-eiwit gekoppelde receptor agonisten Astrocyten express een verscheidenheid van GQ-gekoppelde receptoren 6, 7 waaronder metabotrope glutamaat receptoren en P2Y receptoren (agonist, ATP, ADP). Activatie van deze receptoren leidt tot een aanzienlijke stijging van de intracellulaire calcium niveaus binnen astrocyten. Zo kan men gemakkelijk waarnemen intracellulair calcium verhogingen tijdens het aanbrengen van ATP (30 pM) tot astrocyten 8-10. We maken gebruik van een snelle oplossing switcher van Warner Instruments genaamd de VC-77SP Fast-Step Perfusie System (http://www.warneronline.com/index.cfm). Met deze methode oplossingen kunnen worden toegepast in minder dan ~ 10 ms. <img src="/files/ftp_upload/1142/Fig 1a.jpg" alt="Figuur 1" /> <img src="/files/ftp_upload/1142/fig1c.jpg" alt="" /> Figuur 1. Cartoon en foto&#39;s van de beeldvorming opgezet. A. Geeft een foto van de microscoop gemonteerd op een airtable, terwijl (B) toont een foto van de laser montage, controllers en beam dozen. C. Geeft een foto van de microscoop podium met de kamer geplaatst voor de beeldvorming. Aan de linkerkant de snelle perfusie apparaat kan worden gezien (samen met de stappenmotor en theta slangen). Aan de rechterkant van de headstage van een Axopatch 200A versterker wordt gezien. De cartoon schematiseert het licht pad in de set-up en hoe TIRF is bereikt. De laser is gericht op de achterkant brandvlak van de 60X 1,45 NA objectief en zijn positie is aangepast uit het midden, zodat het naar voren komt in de immersie olie op de kritische hoek α. Op dit punt van de straal last van totale interne reflectie en vervalt met een afstand λ (zie de vergelijking in de hoofdtekst) in het medium van de lagere brekingsindex. In dit geval is dat de opname buffer rond de astrocyten en de astrocyten zelf. Het resultaat is een optische excitatie (en dus beeldvorming) van moleculen binnen ~ 100 nm van het plasmamembraan. In de cartoon van de cel is dit weergegeven als groen &quot;enthousiast&quot; membraan receptoren, terwijl die in de cel of op de bovenkant van de cel zijn niet enthousiast. Een volledig verslag van TIRF microscopie is verstrekt door Steyer en Almers 4. <img src="/files/ftp_upload/1142/fig2.png" alt="Figuur 2" /> Figuur 2. Afbeeldingen van 100 nm fluorescerende bolletjes verworven met EPI en TIRF microscopie. A. Geeft EPI beelden van een gezichtsveld met enkele tientallen 100 nm fluorescerende kralen. De rode pijlen wijzen naar kralen die hebben gevestigd op de glazen dekglaasje, terwijl het blauwe pijlpunten wijzen kralen die zijn verspreiden in water. B. Toont een TIRF beeld van hetzelfde gezichtsveld zoals in A. In deze visie alleen de aanhanger kralen aangegeven door rode pijlen zichtbaar zijn. Dit komt omdat deze had gevestigd op de glazen coverlsip en dus binnen de ~ 100 nm evanescente veld. De kralen die in A door blauwe pijlen zijn niet in deze regio en zijn dus onzichtbaar in de TIRF beelden. De lagere kavels tonen 3D-weergave van de beelden. Het is duidelijk dat een grote toename in signaal-ruis voor kralen binnen de evanescente veld toen waargenomen door TIRF microscopie. In feite voor deze beelden de signaal-ruisverhouding voor de EPI was 7,1 ± 0,6, terwijl het voor TIRF het was 20 ± 0,7. <img src="/files/ftp_upload/1142/fig3.png" alt="Figuur 3" /> Figuur 3. Beelden van astrocyten geladen met Fluo-4 calcium indicator kleurstof verworven met EPI en TIRF microscopie. A. EPI beelden van een gezichtsveld met vijf astrocyten. B. Een TIRF beeld van hetzelfde gezichtsveld getoond in B. Merk op dat de beelden in A en B zijn significant verschillend. Dit is omdat met TIRF verlichting alleen de plasmamembraan regio&#39;s in nauwe appositie bij de glazen dekglaasje worden afgebeeld. De onderste panelen tonen ATP opgewekte intracellulair calcium transiënten afgebeeld met EPI en TIRF microscopie.

<ol><li>Richler, E., Chaumont, S., Shigetomi, E., Sagasti, A., Khakh, B. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+approach+to+image+activation+of+transmitter-gated+P2X+receptors+in+vitro+and+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">An approach to image activation of transmitter-gated P2X receptors in vitro and in vivo.</a> Nature Methods. 5, 87-93 (2008).</li>
<li>Granseth, B., Odermatt, B., Royle, S. J., Lagnado, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clathrin-mediated+endocytosis+is+the+dominant+mechanism+of+vesicle+retrieval+at+hippocampal+synapses%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Clathrin-mediated endocytosis is the dominant mechanism of vesicle retrieval at hippocampal synapses.</a> Neuron. 51, 773-786 (2006).</li>
<li>Nunez, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Primary+culture+of+hippocampal+neurons+from+P0+newborn+rats%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Primary culture of hippocampal neurons from P0 newborn rats.</a> J Vis Exp. 19, (2008).</li>
<li>Steyer, J. A., Almers, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+real-time+view+of+life+within+100+nm+of+the+plasma+membrane%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">A real-time view of life within 100 nm of the plasma membrane.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 2, 268-275 (2001).</li>
<li>Jaiswal, J. K., Fix, M., Takano, T., Nedergaard, M., Simon, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Resolving+vesicle+fusion+from+lysis+to+monitor+calcium-triggered+lysosomal+exocytosis+in+astrocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Resolving vesicle fusion from lysis to monitor calcium-triggered lysosomal exocytosis in astrocytes.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 104, 14151-14156 (2007).</li>
<li>Araque, A., Carmignoto, G., Haydon, P. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamic+signalling+between+astrocytes+and+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Physiol%22%5BJournal%5D)">Dynamic signalling between astrocytes and neurons.</a> Annu Rev Physiol. 63, 795-813 (2001).</li>
<li>Haydon, P. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((GLIA%3A+listening+and+talking+to+the+synapse%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Neurosci%22%5BJournal%5D)">GLIA: listening and talking to the synapse.</a> Nat Rev Neurosci. 2, 185-193 (2001).</li>
<li>Bowser, D. N., Khakh, B. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ATP+excites+interneurons+and+astrocytes+to+increase+synaptic+inhibition+in+neuronal+networks%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">ATP excites interneurons and astrocytes to increase synaptic inhibition in neuronal networks.</a> J Neurosci. 24, 8606-8620 (2004).</li>
<li>Bowser, D. N., Khakh, B. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two+forms+of+astrocyte+single+vesicle+exocytosis+imaged+with+total+internal+reflection+fluorescence+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Two forms of astrocyte single vesicle exocytosis imaged with total internal reflection fluorescence microscopy.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 104, 4212-4217 (2007).</li>
<li>Bowser, D. N., Khakh, B. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vesicular+ATP+is+the+predominant+cause+of+intercellular+calcium+waves+in+astrocytes%5BTitle%5D)+AND+%22J+Gen+Physiol%22%5BJournal%5D)">Vesicular ATP is the predominant cause of intercellular calcium waves in astrocytes.</a> J Gen Physiol. 129, 485-491 (2007).</li>
<li>Agulhon, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((What+is+the+role+of+astrocyte+calcium+in+neurophysiology%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">What is the role of astrocyte calcium in neurophysiology.</a> Neuron. 59, 932-946 (2008).</li>
<li>Barres, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+mystery+and+magic+of+glia%3A+a+perspective+on+their+roles+in+health+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">The mystery and magic of glia: a perspective on their roles in health and disease.</a> Neuron. 60, 430-440 (2008).</li>
<li>Lee, S. Y., Haydon, P. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Astrocytic+glutamate+targets+NMDA+receptors%5BTitle%5D)+AND+%22J+Physiol%22%5BJournal%5D)">Astrocytic glutamate targets NMDA receptors.</a> J Physiol. 581, 887-888 (2007).</li>
<li>Shigetomi, E., Bowser, D. N., Sofroniew, M. V., Khakh, B. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two+forms+of+astrocyte+calcium+excitability+have+distinct+effects+on+NMDA+receptor-mediated+slow+inward+currents+in+pyramidal+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Two forms of astrocyte calcium excitability have distinct effects on NMDA receptor-mediated slow inward currents in pyramidal neurons.</a> J Neurosci. 28, 6659-6663 (2008).</li>
<li>Cahoy, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+transcriptome+database+for+astrocytes%2C+neurons%2C+and+oligodendrocytes%3A+a+new+resource+for+understanding+brain+development+and+function%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">A transcriptome database for astrocytes, neurons, and oligodendrocytes: a new resource for understanding brain development and function.</a> J Neurosci. 28, 264-278 (2008).</li>
</ol>

Het is goed vast te staan ​​dat astrocyten intracellulair calcium verhogingen weer te geven. Deze zich voordoen spontaan, kan worden veroorzaakt door neuronale activiteit of door toepassing van agonisten aan receptoren activeren op de astrocyt oppervlak 11. Een belangrijke en controversiële kwestie is of de astrocyten intracellulair calcium hoogtes kan leiden tot het vrijkomen van signaalmoleculen die receptoren te activeren op neuronen 11, 12. Dit is controversieel omdat er bewijzen voor en tegen deze opvatting, zoals...

<table><tbody><tr><td>VWR&amp;#174; Micro Dekglasjes, rond, nr. 1</td><td>Instrument</td><td>VWR international</td><td>48380-068</td><td></td></tr><tr><td>Poly-D-lysine hydrobromide</td><td>Reagens</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P0899</td><td></td></tr><tr><td>Laminine uit Engelbreth-Holm-Swarm muissarcoom basaalmembraan</td><td>Reagens</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L2020</td><td></td></tr><tr><td>Earle&amp;rsquo;s Balanced Salt Solution (EBSS) (1X), vloeibaar</td><td>Reagens</td><td>Invitrogen</td><td>14155-063</td><td></td></tr><tr><td>Minimum Essential Medium (MEM) (1X), vloeibaar Bevat Earle&amp;rsquo;s zouten, maar geen L-glutamine of fenolrood</td><td>Reagens</td><td>Invitrogen</td><td>51200-038</td><td></td></tr><tr><td>Penicilline-streptomycine vloeibaar</td><td>Reagens</td><td>Invitrogen</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>Natriumpyruvaatoplossing</td><td>Reagens</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S8636</td><td></td></tr><tr><td>HEPES-oplossing 1 M</td><td>Reagens</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H0887</td><td></td></tr><tr><td>N-2 Supplement (100X), vloeibaar</td><td>Reagens</td><td>Invitrogen</td><td>17502-048</td><td></td></tr><tr><td>Paardenserum, hitte-geïnactiveerd</td><td>Reagens</td><td>Invitrogen</td><td>26050-088</td><td></td></tr><tr><td>PAPAIN-022</td><td>Reagens</td><td>Worthington Biochemical</td><td>LK003178</td><td></td></tr><tr><td>Neurobasal&amp;#8482; Medium (1X), vloeibaar zonder fenolrood</td><td>Reagens</td><td>Invitrogen</td><td>12348-017</td><td></td></tr><tr><td>B-27 serumvrij supplement (50X), vloeibaar</td><td>Reagens</td><td>Invitrogen</td><td>17504-044</td><td></td></tr><tr><td>L-glutamine-200 mM (100X), vloeibaar</td><td>Reagens</td><td>Invitrogen</td><td>25030-149</td><td></td></tr><tr><td>Celzeven</td><td>Instrument</td><td>BD Biosciences</td><td>352350</td><td></td></tr><tr><td>BD Falcon multiwell platen met platte bodem en deksels, steriel</td><td>Instrument</td><td>BD Biosciences</td><td>353046</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Reagens</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S7653</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>Reagens</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P3911</td><td></td></tr><tr><td>CaCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt; hexahydraat</td><td>Reagens</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>21108</td><td></td></tr><tr><td>MgCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt; hexahydraat</td><td>Reagens</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M2670</td><td></td></tr><tr><td>HEPES vrij zuur</td><td>Reagens</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H3375</td><td></td></tr><tr><td>D-(+)-glucose</td><td>Reagens</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G7528</td><td></td></tr><tr><td>Fluo-4, AM 1 mM oplossing in DMSO</td><td>Reagens</td><td>Invitrogen</td><td>F-14217</td><td></td></tr><tr><td>Pluronic&amp;#174; F-127 20% oplossing in DMSO</td><td>Reagens</td><td>Invitrogen</td><td>P-3000MP</td><td></td></tr><tr><td>Immersie-olie TYPE DF</td><td>Microscoop</td><td>Cargill Labs</td><td>16242</td><td></td></tr><tr><td>Open kamer voor 25 mm ronde dekglasjes, 100 &amp;mu;l volume</td><td>Instrument</td><td>Warner Instruments</td><td>64-0362 (RC-21BDW)</td><td></td></tr><tr><td>P-2 platform voor Series 20 kamers, zonder verwarming</td><td>Instrument</td><td>Warner Instruments</td><td>64-0278 (P-2)</td><td></td></tr><tr><td>FluoSpheres carboxylaat-gemodificeerde microsferen, 0,1 &amp;mu;m, geel-groen fluorescent (505/515) 2% vaste stoffen</td><td>Reagens</td><td>Invitrogen</td><td>F8803</td><td></td></tr></tbody></table>

het meten van de buurt plasmamembraan en global intracellulair calcium dynamics in astrocyten

Measuring Near Plasma Membrane and Global Intracellular Calcium Dynamics in Astrocytes

De hersenen bevatten gliacellen. Astrocyten, een soort van gliale cel, zijn al lange tijd bekend dat een passieve ondersteunende rol te verstrekken aan neuronen. Echter, steeds meer bewijs suggereert dat astrocyten kunnen ook actief in de hersenfunctie deel te nemen door middel van functionele interactie met neuronen. Echter, veel fundamentele aspecten van de biologie astrocyte blijven controversieel, onduidelijk en / of experimenteel onontgonnen. Een belangrijk punt is de dynamiek van de intracellulaire calcium transiënten in astrocyten. Dit is relevant omdat calcium is goed ingeburgerd als een belangrijke tweede boodschapper en omdat is voorgesteld dat astrocyten calcium verhogingen kan de afgifte van zenders van astrocyten te activeren. Toch is er nog geen gedetailleerd of bevredigende beschrijving van de buurt plasmamembraan calcium signalisatie in astrocyten. Totale interne reflectie fluorescentie (TIRF) microscopie is een krachtig hulpmiddel om fysiologisch relevante signalering gebeurtenissen te analyseren binnen ongeveer 100 nm van het plasmamembraan van levende cellen. Hier gebruiken we TIRF microscopie en hoe dat monitor in de buurt plasmamembraan en de wereldwijde intracellulair calcium dynamiek vrijwel gelijktijdig. De verdere verfijning en systematische toepassing van deze aanpak heeft de potentie om te informeren over de precieze details van astrocyten calcium signalering. Een gedetailleerde kennis van astrocyten calcium dynamiek kan een basis bieden om te begrijpen of, hoe, wanneer en waarom astrocyten en neuronen ondergaan calcium-afhankelijke functionele interacties.

We beschrijven hoe te meten in de buurt van membraan en de wereldwijde intracellulair calcium dynamiek in gekweekte astrocyten met behulp van totale interne reflectie en epifluorescentie microscopie.

Het meten van de buurt plasmamembraan en Global intracellulair calcium Dynamics in Astrocyten

De hersenen bevatten gliale cellen. Astrocyten, een type gliale cel, staan er al lang om bekend dat ze een passieve ondersteunende rol vervullen voor neuronen. Echter, ...

In het eerste deel van deze video demonstreren we hoe de astrocyten-neuron co-cultuur wordt voorbereid. Hiervoor worden verschillende hippocampi van P1-ratten verzameld in een buis, gedigereerd met papaine, gedissocieerd door trituratie en vervolgens geplaatst op dekglasjes. Het tweede gedeelte laat zien hoe de intracellulaire calciumdynamiek in astrocyten wordt gemeten, wat het laden van de calciumindicator-kleurstof Fluo-4 in astrocyten omvat, gevolgd door het meten van de globale calciumdynamiek via epifluorescentiemicroscopie en het meten van de calciumdynamiek nabij het membraan via TIRF-microscopie.Door de verlichting automatisch en snel te wijzigen, kunnen zowel het globale calciumgehalte als het calciumgehalte nabij het membraan bijna gelijktijdig worden waargenomen. Hallo, ik ben Aji omi, postdoctoraal onderzoeker van het Budget COS-lab van de afdeling Fysiologie aan de University of California Los Angeles. Vandaag laten we u een procedure zien voor calcium-imaging van astrocyten.Wij gebruiken deze procedure in onze laboratoriumstudie naar calciumdynamiek nabij het membraan en globale calciumdynamiek in een astrocyte. Door de eliminatie automatisch en snel te wijzigen, kunnen we globale calcium en calcium nabij het membraan onderscheiden. Bijna gelijktijdig zal ik laten zien hoe we een TP toepassen om een calciumstijging in de astrocyte te veroorzaken.Ik zal afsluiten met een samenvatting en een bespreking van de barrière met de methode voor het bestuderen van astrocyten. Laten we beginnen. Om de astrocytenkweek te starten, verwijdert u de huid en de schedel van de kop van een onthoofde rattenpup.Plaats de hersenen in een Petrischaal gevuld met koud dissectiemedium, dissecteer beide hemisferen en verwijder de hersenvliezen. Dissecteer vervolgens de hippocampi. Hak de hippocampi in stukjes van ongeveer één bij één millimeter.Verteer in Pappa-oplossing bij 37 °C gedurende 11 tot 13 minuten. Haal het gedisseceerde weefsel uit de incubator. Zodra de weefselstukjes zijn bezonken, worden deze voorzichtig uit de propane-vertering verwijderd en worden vijf milliliter hippocampusmedium toegevoegd om de gesneden stukjes hippocampus te wassen.Herhaal deze stap en resuspendeer de cellen vervolgens in hippocampaal medium. Tritureer de cellen ongeveer vijf keer met drie vlamgepolijste, progressief kleinere pipetten. Laat de cellen vervolgens door een cellenzeef met een maaswijdte van 70 micrometers gaan en voeg vier milliliters medium toe aan de zeef.Tel de cellen in 10 µL van de suspensie. Pas het volume van het hippocampaal medium aan om een concentratie van 400 000 cellen per mL te verkrijgen. Bereid vervolgens de dekglasjes voor het uitplaten van de celsuspensie door het laminaat af te zuigen van de dekglasjes, die gedurende de nacht zijn blootgesteld aan een laminaatoplossing.Voordat de dekglasjes kunnen drogen, worden 200 µL van de cel-suspensie per dekglasje aangebracht. Laat deze 60 minuten in de incubator hechten. Voeg na incubatie twee milliliter hippocampaal medium per well toe.Aspireer de volgende dag het oude hippocampale medium om dode cellen en debris te verwijderen en voeg twee milliliter voorverwarmd vers hippocampusmedium toe. Het onderhoud van astrocyten-neuron co-culturen moet vier dagen na het uitplaten beginnen door tweemaal per week één milliliter vers neurobasaal medium toe te voegen. Zorg ervoor dat de media ongeveer 30 minuten in de incubator in een geventileerde kolf worden gepre-incubeerd om de temperatuur en koolstofdioxide te equilibreren.Voordat de astrocyten worden bestudeerd, is het nuttig om naar nano-fluorescente beads te kijken om de laserhoek voor turf te optimaliseren. Doe hiervoor 200 microliters water op de Petrischaal, voeg één microliter 100 nanometer fluorescente beads toe en meng dit; observeer de beads met epi-fluorescentiemicroscopie. Bekijk de beads vervolgens met turf-microscopie.Voor calciumimaging plaatst u de cultuur in een put van een zes-putsplaat gevuld met twee milliliter hippocampale registratiebuffer die 2,5 micromolar fluo-4 AM en 0,05% Pluronic F-127 (20% oplossing in DMSO) bevat, en incubeert u dit gedurende 10 tot 30 minuten bij kamertemperatuur; vergeet niet de plaat af te dekken om bleken van de fluo-4 te voorkomen. Verwijder de fluo-4 oplossing en was de dekglasjes drie keer met hippocampale registratiebuffer. Incubeer de gewassen dekglasjes gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur.Plaats het dekglas in de kamer, reinig de andere zijde van het dekglas met lensreinigingsvloeistof en voeg 200 µL hippocampusbuffer toe. Breng één kleine druppel immersie-olie aan op het objectief en plaats de kamer op de tafel van de microscoop. Bekijk de cellen met transmissielicht om scherp te stellen en om het uiterlijk van de cellen te beoordelen.Belicht vervolgens de cellen met 488 nanometer vanuit een monochrome bron en bepaal of het fluorescentiesignaal van flu oh four uniform en detecteerbaar is. Gebruik bij astrocyten epi- en turf-illuminatie om calcium in de astrocyten te meten. Hier worden fluorescente beads waargenomen via epi-illuminatie.Naast het produceren van achtergrondfluorescentie vertonen ze ook aanzienlijke brownse beweging naarmate de belichtingshoek verandert. Wanneer de laser de kritieke hoek nadert, wordt de laserstraal volledig gereflecteerd door de glas-waterinterface. Deze totale interne reflectie genereert een elektromagnetisch veld, het zogenaamde evanescente veld.Dit heeft een diepte in de cel met een lagere brekingsindex van ongeveer 100 nanometers. Je kunt fluoroforen in deze dunne laag op het oppervlak van het preparaat exciteren. Hier zijn fluorescerende kralen waargenomen bij turf-illuminatie vergeleken met epi-illuminatie.De signaal-ruisverhouding van de verlichting neemt aanzienlijk toe wanneer de hoek wordt verkleind. De laserstraal reflecteert niet aan het oppervlak en gaat door het dekglas om de fluorescerende kraaltjes direct te raken. Er is veel achtergrondfluorescentie zichtbaar.Nu vergroten we de hoek. Opnieuw neemt de achtergrondruis aanzienlijk af en zijn fluorescerende beads zichtbaar nabij het oppervlak van het dekglas. Deze afbeeldingen tonen met flu oh four geladen astrocyten en neuronen.Astrocyten zijn platte cellen met fijne uitlopers, terwijl neuronen ronde cellichamen en dikke, lange dendrieten hebben. Zowel astrocyten als neuronen zien er gezond uit en zijn goed gevuld met flu. Oh vier correct.Het observeren van astrocyten via epi- of confocale microscopie is nuttig om vast te stellen of de astrocyten gezond zijn en of calciumindicatoren correct in de astrocyten zijn geladen. In de regio's van de astrocyt die het dichtst bij het dekglas liggen, de zogenaamde footprint, wordt waargenomen dat een TP een calciumtoename nabij het plasmamembraan veroorzaakt. Het is bekend dat hippocampale astrocyten pure anergische receptoren tot expressie brengen en dat een TP, wanneer toegevoegd aan het bad, een globale calciumvrijgave kan veroorzaken.We hebben zojuist aangetoond hoe u een hippocampus osteocytcultuur kunt voorbereiden en hoe u het calciumgehalte van een osteocyt zowel globaal als nabij het plasmamembraan kunt meten. Bij het uitvoeren van deze procedure is het belangrijk om te onthouden dat de laserhoek moet worden geoptimaliseerd; de beste manier om dit op de microscoop te waarborgen, is door het gedrag van 100 millimeter stroomsnelheden te observeren. De gelijktijdige registratie van het globale calciumgehalte en het calciumgehalte nabij het membraan zal ons niet alleen een gedetailleerde beschrijving van het calciumsignaal verschaffen, maar ook nieuw inzicht bieden in het mechanisme van calciumregulatie in astrocyten.Daarnaast denken wij dat de hier beschreven aanpak nuttig is voor het meten van het calciumgehalte nabij het membraan en het globale intracellulaire calciumgehalte in andere onbekende exciteerbare weefsels. Dat is alles. Bedankt voor het kijken en veel succes met uw experiment.

measuring-near-plasma-membrane-global-intracellular-calcium-dynamics

Research

JoVE Journal

Biology

Biologie

De bereiding van acute hersenplakjes van hippocampi geïsoleerd, evenals de gelijktijdige elektrofysiologische opnames van astrocyten en neuronen...

Dubbele Elektrofysiologische Opnames van synaptisch-opgeroepen astrogliale en Neuronale responsen bij acute hippocampus Slices

Source: Bannai, H., et. al., Dissection of Local Ca2+ Signals in Cultured Cells by Membrane-targeted Ca2+ Indicators. J. Vis. Exp. (2019)The video demonstrates fluorescence imaging to observe compartment-specific spontaneous calcium dynamics in astrocytes by sequentially monitoring calcium-sensitive proteins localized on the plasma membrane and endoplasmic reticulum.

Spontaneous Calcium Imaging for Compartment-Specific Dynamics in Astrocytes

Hier beschrijven we een aanpassing van de protocollen voor homeostatische plasticiteit induceren in neuronen voor de studie van plasticiteit van astrocytaire G-proteïne gekoppelde receptoren. Onlangs gebruikt om wijzigingen in astrocytaire I mGluRs bij jonge muizen te onderzoeken, kan de werkwijze worden toegepast voor de schaal van verschillende astrocytaire GPCRs meten in weefsel van volwassen muizen in situ en in vivo, en een betere waardering van de gevoeligheid van astrocytaire receptoren...

Inducerende Plasticiteit van astrocyten receptoren door Manipulatie van neuronale tarieven

De eigenschappen en functies van astrocytenintracellulaire Ca2+ signalen in het striatum blijven onvolledig onderzocht. We beschrijven methoden om genetisch gecodeerde calciumindicatoren in striatale astrocyten tot expressie te brengen met behulp van adeno-geassocieerde virussen van serotype 2/5 (AAV2/5), evenals procedures om Ca2+ signalen binnen striatale astrocyten in situ betrouwbaar te beeldhouwen.

Imaging intracellulaire Ca 2+ Signalen in Striatale Astrocyten van volwassen muizen met behulp van genetisch gecodeerd Calcium Indicatoren

Het AWESAM protocol beschreven hier is optimaal voor het kweken van lymfkliertest astrocyten los van andere hersencellen in een snelle, eenvoudige en goedkope manier. AWESAM astrocyten vertonen spontane Ca2 + signalering, morfologie en gene expressieprofielen vergelijkbaar met de astrocyten in vivo.

Kweken In Vivo-graag lymfkliertest astrocyten met behulp van de snelle, eenvoudige en goedkope AWESAM-Protocol

Hier gedemonstreerd zijn protocollen voor het isoleren van (1) vers intact cerebrale endothelial "buizen" en (2) gelijktijdige metingen van endothelial calcium en membraanpotentiaal tijdens endotheel afkomstige hyperpolarisatie. Verder, deze methoden toestaan voor farmacologische tuning van endothelial cel calcium en elektrische signalering als individuele of interactieve experimentele variabelen.

Gelijktijdige metingen van intracellulair Calcium en membraanpotentiaal in vers geïsoleerd en Intact muis cerebrale endotheel

Hier presenteren we een protocol voor Ca2 + imaging in zenuwcellen en gliacellen, waarmee de dissectie van Ca2 + signalen bij subcellular resolutie. Dit proces is van toepassing op alle celtypes waarmee de expressie van genetisch gecodeerde Ca2 + indicatoren.

Dissectie van lokale Ca2 + signalen in gekweekte cellen door membraan-gerichte Ca2 + indicatoren

Hier beschrijven we een in vitro Live-imaging methode om intracellulair transport van organellen en de handel in plasma membraan eiwitten in muriene astrocyten te visualiseren. Dit protocol presenteert ook een analysemethode voor het vrachtvervoer en kinetiek.

Visualisering en analyse van intracellulair transport van organellen en andere Cargo's in astrocyten

Dit proctocol heeft tot doel een methode te bieden voor in vitro en in vivo mitochondriale Ca2+ beeldvorming in astrocyten en neuronen.

Beeldvorming mitochondriale Ca2+ opname in astrocyten en neuronen met behulp van genetisch gecodeerde Ca2+ indicatoren (GECI's)

De huidige methoden beschrijven een niet-ratiometrische benadering voor hoge resolutie, sub-compartimentale calciumbeeldvorming in vivo in Caenorhabditis elegans met behulp van direct beschikbare genetisch gecodeerde calciumindicatoren.

Subcellulaire beeldvorming van neuronale calciumbehandeling in vivo

Dit protocol biedt een uitgebreide beschrijving van een methode voor het gelijktijdig registreren van calciumsignalen van neuronen en astrocyten over meerdere geheugengerelateerde hersengebieden en demonstreert de toepassing ervan tijdens een leer- en geheugengedragsparadigma.

Een tweekleurige vezelfotometriemethode voor het registreren van activiteit van astrocytenneuronen over meerdere hersengebieden tijdens leer- en geheugengedrag

Leer hoe u intracellulaire calciumdynamiek meet in astrocyten met behulp van geavanceerde microscopietechnieken. Deze methode omvat astrocyt-neuron co-cultures en simultane waarneming van globale en membraan-nabije calciumsignalen.

Het meten van de buurt plasmamembraan en Global intracellulair calcium Dynamics in Astrocyten

Meer video's verkennen