Name: Isolatie van Protoplasten uit weefsels van 14-dagen-oude zaailingen van Arabidopsis thaliana /em (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2009-08-17T00:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 16 s
Description: Leer een betrouwbare methode om intacte protoplasten te isoleren uit 14 dagen oude zaailingen van Arabidopsis thaliana. Deze techniek behoudt celviabiliteit gedurende minstens 96 uur voor diverse plantbiologische experimenten.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Dit werk werd ondersteund door de Cornell University Agricultural Experiment Station (CUAES) NYC-125433 Hatch Grant en Cornell Start-Up Grant toegekend aan OKV

Deel 1. Bereiding van vaste medium voor het kweken van planten. We meestal cultuur planten op geconcentreerd Murasige en Skoog (MS) medium, aangevuld met 1% sucrose en 0,7% agar. Het bevat alle noodzakelijke ingrediënten om planten gezond te houden. Ter voorbereiding van 1L van MS, media pH 5,7 <ol><li> Voeg 2,15 g van MS poeder in 800 ml water in 1.5-2.0L autoclaveerbaar fles. </li><li> Plaats een roerstaaf in de fles en los MS poeder door roeren medium op een bewogen plaat. </li><li> Al roerend, toe te voegen, druppel voor druppel, 1N KOH om de pH van MS medium aan te passen naar 5,7. </li><li> Voeg 10 g sucrose, blijf roeren. </li><li> Voeg 7 g agar *. </li><li> Pas het uiteindelijke volume van de bereide medium tot 1000 ml en steriliseer in de autoclaaf .* </li><li> Plaats geautoclaveerd medium op een bord en roeren afkoelen tijdens het roeren, zodat de agar niet neerslaan op de bodem van de fles. Afkoelen middellange tot ~ 60 ° C. * </li><li> Giet 100 mm Petri platen. Houd platen bij 4 ° C. </li></ol> * Tip 1: Probeer niet om agar op te lossen. Het zal solubiliseren tijdens de autoclaaf. * Tip 2: Houd de roeren bar in een fles tijdens de autoclaaf, zul je later nodig hebt. * Tip 3: Als je je handen op de geautoclaveerde fles voor 10 s, betekent dit dat het medium voldoende is afgekoeld en je kunt beginnen gieten platen. Deel 2. Plantmateriaal en groeiomstandigheden. <ol><li> Steriliseren zaden van Arabidopsis thaliana <ol><li> Plaats 100 mg van de zaden in Eppendorf microcentrifugebuizen en voeg 1 ml 70% ethanol. Meng goed en incubeer gedurende 2 minuten. Spin zaden naar beneden, aspireer het supernatant. </li><li> Voeg 1 ml van 1,8% bleekwater-oplossing * die 0,1% Tween-20. Mix voor 10 minuten. Spin down zaden en aspireer bleekwater oplossing. </li><li> Deze stap moet worden uitgevoerd in een laminaire stroming kap. Voeg 1 ml steriel water om zaden, goed mengen. Spin down zaden, zuigen water. Herhaal deze stap 5 keer. </li></ol></li><li> Verspreid zaden op de bereid in stap 1 platen (100 zaden / plaat). </li><li> Houden geplaatste platen voor 24-48 uur bij 4 ° C in het donker voor de stratificatie. </li><li> Kweek planten voor 14 dagen in de groei van kamer met 8 uur light/16 uur donker lichtperiode (bij een fotosynthetische foton flux dichtheid van 250 mol m -2 s -1) op 23 / ​​19 ° C licht / donker temperatuur wordt geregeld, en 75% relatieve vochtigheid. </li></ol> * Tip 1: Bleach oplossing is verzonnen door verdunning een huishouden Clorox, met 6% natriumhypochloriet en het toevoegen van Tween-20 tot een uiteindelijke concentratie van 0,1%. Deel 3. Isolatie van protoplasten van Arabidopsis zaailingen. <ol><li> Snijd 2 g van 14-dagen-oude zaailingen met een vers scheermesje in 15 ml van een filter-gesteriliseerd TVL Solution. We hakken plantmateriaal in een steriele wegwerp petrischalen. </li><li> Overdracht gehakt weefsels in 200 ml bekerglas, voeg 20 ml van een filter-gesteriliseerd enzymoplossing, draai de beker te laten weefsels mengen met Enzyme Solution, dek af met parafilm en aluminiumfolie. </li><li> Schud plantenweefsels op 35 toeren per minuut in het donker bij kamertemperatuur gedurende 16 tot 18 uur </li><li> Verzamel de vrijgekomen protoplasten in 50 ml Falcon buis door zeven tot en met 8 lagen van de kaasdoek, pre-nat in W5 Solution. </li><li> Zeef protoplasten van de kaas-doek nog een keer door het wassen van de doek met 15 ml W5 Solution. </li><li> Zorgvuldig overlay protoplasten met 10 ml W5 Solution, niet storen de suiker gradiënt, centrifuge voor 7 minuten bij 100 g. </li><li> Verzamel 10 ml van protoplasten op het snijvlak van enzymoplossing en W5 Solution (Fig. 1B) en over te dragen aan een nieuwe 50 ml Falcon buis. </li><li> Voeg 15 ml W5 Solution, centrifuge gedurende 5 minuten bij 60 g. Verwijder het supernatant. </li><li> Was protoplasten vrij van enzymoplossing door resuspenderen protoplasten in 15 ml van de W5 Solution, centrifuge voor 5 min op 60 g </li><li> Verwijder de bovenstaande vloeistof, hersuspenderen gepelleteerde protoplasten in 1-3 ml W5 Solution. </li><li> Evalueer protoplast opbrengst door de cel tellen met een hemocytometer. </li></ol> Deel 4. Reagentia: TVL: 0.3 M sorbitol; 50 mM CaCl 2 Filter-steriliseer en bewaar bij -20 ° C. Enzyme Oplossing: 0,5 M sucrose, 10 mM MES-KOH [pH 5,7], 20 mM CaCl2, 40 mM KCl, 1% Cellulase (Onozuka R-10), 1% Macerozyme (R10). Filter-steriliseren en vers te gebruiken. W5 Oplossing: 0,1% (w / v) glucose, 0,08% (w / v) KCl, 0,9% (w / v) NaCl, 1,84% (w / v) CaCl 2, 2 mM MES-KOH pH 5,7. Filter-steriliseer en bewaar bij kamertemperatuur. Deel 5: representatieve resultaten: Met behulp van Arabidopsis kweekomstandigheden zoals beschreven in deel 1 en 2 maakt gezonde zaailingen, geschikt voor het isoleren van protoplasten (Fig. 1A). Protoplast worden gezuiverd door sucrose dichtheid GradiENT centrifugeren en verzameld op het snijvlak van W5 en Enzyme oplossingen (Fig. 1B). Met behulp van protoplast isolatie procedure zoals beschreven in deel 3 hebben we normaal gesproken de oogst 05 tot 10 oktober 6 van intact protoplasten (Fig. 1C) van een gram verse zaailingen. <img src="/files/ftp_upload/1149/Fig1.jpg" alt="Figuur 1" /> Figuur 1. Isolatie van protoplasten van Arabidopsis zaailingen. A, Weefsels van 14-dagen-oude zaailingen van Arabidopsis werden verzameld en omgezet in protoplasten door een aangepaste procedure van (Chen en Halkier, 2000). B, werden Protoplasten gezuiverd door sucrose dichtheidsgradiënt centrifugatie en verzameld op het snijvlak van enzym-oplossing en W5 uffer (witte pijlen). C, Bright-veld microscopie van protoplasten. Microfoto&#39;s werden verzameld met behulp van een gekoelde CCD camera gekoppeld aan de Zeiss Axioscope 2 plus microscoop.

<ol><li>Cocking, E. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Method+for+the+Isolation+of+Plant+Protoplasts+and+Vacuoles%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">A Method for the Isolation of Plant Protoplasts and Vacuoles.</a> Nature. 187, 962-963 (1960).</li>
<li>Chen, S., Halkier, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+glucosinolate+uptake+by+leaf+protoplasts+of+Brassica+napus%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Characterization of glucosinolate uptake by leaf protoplasts of Brassica napus.</a> J Biol Chem. 275, 22955-22960 (2000).</li>
<li>Robert, S., Zouhar, J., Carter, C., Raikhel, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+intact+vacuoles+from+Arabidopsis+rosette+leaf-derived+protoplasts%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Protocols%22%5BJournal%5D)">Isolation of intact vacuoles from Arabidopsis rosette leaf-derived protoplasts.</a> Nat. Protocols. 2, 259-262 (2007).</li>
<li>Yoo, S. D., Cho, Y. H., Sheen, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Arabidopsis+mesophyll+protoplasts%3A+a+versatile+cell+system+for+transient+gene+expression+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Arabidopsis mesophyll protoplasts: a versatile cell system for transient gene expression analysis.</a> Nat Protoc. 2, 1565-1572 (2007).</li>
<li>Zhai, Z., Sooksa-nguan, T., Vatamaniuk, O. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Establishing+RNAi+as+a+reverse+genetic+approach+for+gene+functional+analysis+in+protoplasts%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Phys%22%5BJournal%5D)">Establishing RNAi as a reverse genetic approach for gene functional analysis in protoplasts.</a> Plant Phys. 149, 642-652 (2009).</li>
</ol>

De voorlopige patent beschrijft deze procedure voor gebruik ervan in functionele analyses van plantaardige genen zijn gedeponeerd bij Cornell Centrum voor Technologie Enterprise en commercialisering (CCTEC), juni 2008. Docket Geen 50341/015001: Vatamaniuk, OK, en Zhai, Z. methode voor een snelle functionele analyses van plantaardige genen.

Om ervoor te zorgen de hoge opbrengst van intacte protoplast is het heel belangrijk om weer te beginnen met gezonde planten. Gebruik filter-steriliseren-oplossingen voor het isoleren van protoplasten. Vergeet niet dat protoplasten kwetsbaar zijn. Daarom, wanneer u protoplasten hanteren, niet mengen, pipet of vortex ze krachtig, omdat het hen zal remmen. In plaats daarvan, mix protoplasten door langzaam draaiende of taping de centrifugebuis. De beschreven procedure opbrengst intact protoplasten die levensvatbaar zijn voo...

<table><tbody><tr><td>Murashige and Skoog basiszoutmengsel (MS)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M5524</td><td></td></tr><tr><td>Agar</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A1296</td><td></td></tr><tr><td>Petrischalen (100x15mm)</td><td>Krackeler Scientific, Inc.</td><td>82-4001</td><td></td></tr><tr><td>Cellulase (OnozukaR&amp;#8208;10)</td><td>Research Products International Corp.</td><td>C32200</td><td></td></tr><tr><td>Macerozyme (R10)</td><td>Research Products International Corp.</td><td>M22010</td><td></td></tr><tr><td>Gaasdoekjes</td><td>Fisher Scientific</td><td>06-665-29</td><td></td></tr><tr><td>Lab-rotator</td><td>Fisher Scientific</td><td>1167152Q</td><td></td></tr><tr><td>AllegraX&amp;#8208;15R centrifuge</td><td>VWR international</td><td>392932</td><td></td></tr><tr><td>Axioskop 2 Plus microscoop</td><td>Carl Zeiss, Inc.</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

isolatie van protoplasten uit weefsels van 14-dagen-oude zaailingen van arabidopsis thaliana</em

Isolation of Protoplasts from Tissues of 14-day-old Seedlings of Arabidopsis thaliana

Protoplasten zijn plantaardige cellen die hebben hun celwanden enzymatisch verwijderd. Isolatie van protoplasten van verschillende weefsels plant werd voor het eerst meer dan 40 jaar geleden gemeld<sup&gt; 1</sup&gt; En is sindsdien aangepast om een ​​verscheidenheid van cellulaire processen, zoals subcellulaire lokalisatie van eiwitten, isolatie van intact organellen en gerichte gen-inactivatie door dubbelstrengs RNA interferentie (RNAi) onderzoek<sup&gt; 2-5</sup&gt;. Het merendeel van de protoplast isolatie protocollen gebruiken blad weefsels van volwassen Arabidopsis (bv. 35-dagen-oude planten)<sup&gt; 2-4</sup&gt;. We gewijzigd bestaande protocollen door het gebruik van 14-dagen-oude Arabidopsis zaailingen. In deze procedure, een gram van de 14-dagen-oude zaailingen leverde 5 10<sup&gt; 6</sup&gt; -10<sup&gt; 7</sup&gt; Protoplasten die intact blijven ten minste 96 uur. De opbrengst van protoplasten van zaailingen is vergelijkbaar met de voorbereidingen van de bladeren van volwassen Arabidopsis, maar in plaats van 35-36 dagen, isolatie van protoplasten is voltooid in 15 dagen. Dit maakt het verminderen van de tijd en de groeikamer ruimte die nodig zijn voor het isoleren van protoplasten als volwassen planten worden gebruikt, en versnelt de downstream studies die intact protoplasten vereisen.

Deze video toont een procedure voor het isoleren van intacte protoplasten uit weefsels van 14-dagen-oude zaailingen van Arabidopsis. Gezien het feit dat de geïsoleerde protoplasten intact blijven gedurende minstens 96 uur en worden geïsoleerd van zaailingen in plaats van een-maand-oude volwassen planten, deze procedure versnelt assays die intact protoplasten.

Isolatie van Protoplasten uit weefsels van 14-dagen-oude zaailingen van Arabidopsis thaliana</em

Protoplasten zijn plantencellen waarvan de celwanden enzymatisch zijn verwijderd. De isolatie van protoplasten uit verschillende plantenweefsels werd voor het eerst...

Deze procedure begint met het uitplaten van Arabidopsis-zaden op MS-agar op dag 14. Nadat de zaden zijn gekiemd, worden de zaailingen verzameld en gesneden. Het plantmateriaal wordt vervolgens verteerd in een enzymoplossing die de celwand afbreekt.Het resulterende mengsel wordt door een kaasdoek gezeefd om de protoplasten te scheiden van ander plantmateriaal. De verzamelde protoplasten worden verder gezuiverd op een sucrose-dichtheidsgradiënt door ze te layeren met W five-oplossing. De protoplasten concentreren zich op de interface tussen het enzym en de W five-oplossing.Ze worden verzameld en gewassen voordat er experimenten worden uitgevoerd. Hallo, ik ben Jang Ja van het laboratorium van Lina Wauk van de afdeling Crop and Soil Sciences aan de Cornell University. Vandaag laten we u een procedure zien voor de isolatie van intacte chloroplasten uit 14 dagen oude TH van aro Ana.We gebruiken deze procedure in ons laboratorium om de subcellulaire lokalisatie van de eiwitten van interesse te bestuderen, voor de isolatie van intacte organellen en voor de functionele analyse van genen met behulp van dubbelstrengs RNA-interferentie. Laten we beginnen. We starten de procedure door 0,5 keer

isolation-protoplasts-from-tissues-14-day-old-seedlings-arabidopsis

Research

JoVE Journal

Biology

Biologie

Een methode voor het isoleren van specifieke celtypen uit plantaardig materiaal wordt gedemonstreerd. Deze techniek maakt gebruik van transgene marker lijnen uitdrukken fluorescerende eiwitten in het bijzonder celtypen, cellulaire dissociatie en fluorescentie geactiveerde cel sortering. Daarnaast wordt een groei setup hier vast te staan ​​dat vergemakkelijkt de behandeling...

Fluorescentie geactiveerde celsortering van plantenprotoplasten

De moleculaire basis van ruimtelijke-specifieke fytochroom reacties wordt onderzocht met behulp van transgene planten die weefsel-en orgaan-specifieke fytochroom gebreken vertonen. De isolatie van specifieke cellen vertonen geïnduceerde fytochroom chromofoor uitputting door middel van fluorescentie-Activated Cell Sorting gevolgd door middel van microarray-analyses wordt gebruikt om genen die betrokken zijn bij de ruimtelijke-specifieke fytochroom reacties te identificeren.

Onderzoeken Tissue-en orgel-specifieke fytochroom Reacties met behulp van FACS-assisted Cell-type-specifieke expressie profilering in Arabidopsis thaliana</em

We beschrijven een protocol met behulp van dia's kamer en de media te planten zaadlobben voor confocale beeldvorming van de opperhuid te immobiliseren over meerdere dagen van de ontwikkeling, het documenteren van stomata differentiatie. Fluorofoor-gemerkte eiwitten kan dynamisch worden gevolgd door expressie en subcellulaire lokalisatie, het verhogen van het inzicht in de mogelijke rollen tijdens de celdeling en cel-type differentiatie.

Lange termijn, hoge resolutie Confocale Time Lapse Imaging van<em&gt; Arabidopsis Cotyledon</em&gt; Epidermis Bij het ontkiemen

Wij rapporteren een efficiënte en eenvoudige methode om embryo's te isoleren in een vroeg stadium van de ontwikkeling...

Efficiënte en snelle isolatie van een vroeg stadium embryo&#39;s van<em&gt; Arabidopsis thaliana</em&gt; Zaden

De circadiane klok regelt ongeveer een derde van de Arabidopsis transcriptoom, maar het percentage van genen die te gebruiken bij tijdwaarneming blijft onbekend. Hier visualiseren we een methode om circadiane fenotypes snel te beoordelen in welke mutant lijn van Arabidopsis met behulp van lichtgevende beeldvorming van een circadiaan reporter tijdelijk tot expressie gebracht in protoplasten.

Snelle analyse van het circadiaans fenotypes in Arabidopsis protoplasten getransfecteerd met een Lichtgevende klok Reporter

Hier presenteren wij een interactief capture protocol toegepast op Arabidopsis thaliana leaf mesophyll protoplasten. Deze methode berust op in vivo UV-verknoping en staat voor isolatie en identificatie van plantaardige mRNA-bindende eiwitten uit een fysiologische omgeving.

MRNA Interactome Capture van Plant Protoplasts

We ontwikkelden een eenvoudige en efficiënte protocol voor de voorbereiding van grote hoeveelheden soja protoplasten om te studeren van de ingewikkelde regelgeving en signalering mechanismen in levende cellen.

Een eenvoudige methode voor het isoleren van soja protoplasten en toepassing op voorbijgaande gen expressie Analyses

De haalbaarheid en effectiviteit van high-throughput scRNA-seq-methoden luiden een eencellig tijdperk in plantenonderzoek in. Hier wordt een robuuste en complete procedure gepresenteerd voor het isoleren van specifieke Arabidopsis thaliana wortelceltypen en de daaropvolgende transcriptoombibliotheekconstructie en -analyse.

Isolatie en transcriptoomanalyse van plantenceltypen

Dit protocol beschrijft de bereiding van intacte monsters van de endospermcellaag in Arabidopsis thaliana zaden. De methode vereist alleen gewone laboratoriumapparatuur, zoals een injectienaald en een precisietang, en maakt fluorescerende levende celbeeldvorming met hoge resolutie mogelijk van endospermcellen in zowel ontwikkelende als rijpe zaden.

Preparaat van intact weefsel voor microscopische analyse van de endospermcellaag in zich ontwikkelende en rijpe Arabidopsis-zaden

Dit artikel illustreert de bloemen-dip methode...

Bloemen-dip Transformatie van Arabidopsis thaliana Om te onderzoeken PTSO2:: β-glucuronidase Reporter Gene Expression

Leer een betrouwbare methode om intacte protoplasten te isoleren uit 14 dagen oude zaailingen van Arabidopsis thaliana. Deze techniek behoudt celviabiliteit gedurende minstens 96 uur voor diverse plantbiologische experimenten.

Isolatie van Protoplasten uit weefsels van 14-dagen-oude zaailingen van Arabidopsis thaliana

Meer video's verkennen