Name: Live-Imaging van gliale cel migratie in de Drosophila Eye verbeelding Disc (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2009-07-09T00:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 12 s
Description: Leer live-imaging van gliale celmigratie in het ontwikkelende oog van Drosophila met GFP-markering. Deze methode maakt real-time observatie van celgedrag mogelijk voor neurowetenschappelijk onderzoek.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Patrick Cafferty wordt ondersteund door een postdoctoraal fellowship van de Multiple Sclerose Vereniging van Canada.

Deel 1: Pre-experimentele set-up. <ol><li> Een week op voorhand, mate vliegt genereren larve die uitdrukken GFP onder de controle van een glia-specifieke promoter. Voor ons experiment hebben we gevisualiseerd GFP getagd met een nucleair lokalisatie volgorde uitgedrukt in gliale cellen met behulp van de omgekeerde polariteit (repo) promotor (3, 4). </li><li> Bereid dekglaasjes ten minste een dag van tevoren door het weken 18 mm ronde dekglaasjes gedurende 10 minuten in 1% poly-L-lysine oplossing en de lucht drogen &#39;s nachts. </li><li> Op de dag voor het experiment, schoon een Chamlide magnetische cultuur kamer door het weken componenten &#39;s nachts in 70% ethanol. </li><li> Op de dag van het experiment, voor te bereiden kweekmedium door het toevoegen van foetaal runderserum, penicilline-streptomycine-oplossing, en insuline tot 10 ml insect medium Schneiders met behulp van aseptische technieken. De werkende concentraties zijn: 1X foetaal runderserum, 100U/ml penicilline, streptomycine 0.1mg/ml en 0,2 mg / ml insuline in insectencellen medium Schneider (gemodificeerd van (5)). </li><li> Laat de cultuur kamer te droge lucht in een celcultuur kap. Afwassen resterende ethanol uit de cultuur kamer door spoelen met voorbereide kweekmedium. </li></ol> Deel 2: Dissectie van de Drosophila eye-brain complex. <ol><li> Selecteer een derde instar dwalen larve van de zijde van een vlieg flacon en plaats in een daling van gekoelde kweekmedium op een petrischaaltje op ijs gedurende enkele minuten. Chilling de larve wordt aanbevolen om peristaltische contracties lichaam langzaam voor het gemak van dissectie. </li><li> Plaats de gekoelde larve in een daling van kweekmedium op een Sylgard gecoate schaal onder een dissectie microscoop. </li><li> Onder de dissectie microscoop, het gebruik van een paar Dumont fijne tang stevig vastpakken van de larve ongeveer een derde van de weg van de achterste einde. Wacht tot de larve extrudeert zijn mond haken vanaf het voorste eind. Pak de mond haken met een tweede pincet bij volledige extensie. Te ontleden de larve, langzaam trekt de twee paren van de tang in tegengestelde richting. Het oog-brein-complex, samen met de speekselklieren, vet lichamen en verbeelding weefsel, weg zal trekken uit het larvale lichaam. Trek niet aan de mond haken te snel anders zullen ze af scheuren van het oog-hersen-complex. </li><li> Trim weg speekselklieren, vet lichamen en verbeelding schijven met behulp van ultra-fijne klipper schaar. De twee hemisferen van de hersenen en oog-discs zullen worden toegevoegd aan de ventrale zenuw snoer en de mond haken. </li><li> Plaats een 18 mm dekglas op een glasplaatje. Laat een rand van het dekglas opknoping over de rand van de dia om later halen de dekglas. Voeg een druppel kweekmedium op de 18 mm dekglas. Breng de oog-brein-complex in het kweekmedium door vast te pakken de mond te haken met een tang. Niet direct begrijpen het oog-hersen-complex met de tang of het weefsel wordt beschadigd. </li><li> Met behulp van fijne dissectie schaar, knip uit de mond haken uit het oog-hersenen complex en gooi deze weg. Het verwijderen van de mond haken is belangrijk voor de live-imaging als de mond haken zal blijven contract in het kweekmedium waardoor het weefsel te bewegen tijdens de microscopie. </li><li> Om gliale migratie te visualiseren in het oog verbeelding schijf, knip voorzichtig de optische steel, de dunne weefsel dat de hersenen en de ogen schijf verbindt en weg te duwen of verwijderen van de hersenen (zie figuur 1A). Te visualiseren glia binnen de optische steel, laat de hersenen, optische stalken, en in het oog verbeelding schijf intact (zie figuur 1E). </li><li> Pak de dekglaasje met behulp van pincet en trek een cirkel rond onder het weefsel van belang met een permanent marker. Deze cirkel zal helpen bij het lokaliseren van de weefsel voor microscopie in deel 4. </li></ol> Deel 3: Montage van de ogen denkbeeldige schijf in een magnetisch cultuur kamer. <ol><li> Met behulp van een tang, pakt u de opknoping rand van het dekglaasje. Breng de dekglaasje op de bodemplaat van de Chamlide magnetische kamer zonder verstoring van het weefsel in cultuur. </li><li> Plaats de siliconen O-ring op het hoofdgedeelte van de Chamlide kamer. Installeer het belangrijkste orgaan op de top van de bodemplaat. </li><li> Voeg langzaam kweekmedium naar de kamer. Niet toe te voegen het kweekmedium te snel of het weefsel van de rente zal worden verstoord. Niet volledig vullen de kamer om voor gasuitwisseling mogelijk maken onder de kap. </li><li> Plaats voorzichtig de onzichtbare deksel op de top van de Chamlide kamer. </li></ol> Deel 4: Visualisatie van migrerende gliacellen in het oog disc. <ol><li> Plaats de cultuur kamer op het podium van een confocale of fluorescentie microscoop. Zoek het monster met behulp van de cirkel op de dekglaasje als een referentie op lage vergroting. </li><li> Focus op het monster met behulp van een 40x lens. Laat het weefsel om zich te vestigen op het dekglaasje. Maak foto&#39;s van het oog schijf of optische stalken elke 10-15min gedurende 3-4 uur. Het weefsel kan trillen en bewegen onscherp. Handmatig scherpstellen het weefsel voordat de foto zal verlichten eis probleem. </li></ol> Deel 5: Representatieve resultaten: Correct wordt uitgevoerd, ons protocol liet ons toe om een ​​reeks beelden van GFP-gelabelde gliacellen die van de optische steel migreerden in het oog denkbeeldige schijf (figuur 1 BD) te verzamelen. Terwijl live beeldvorming voor een periode van 60 minuten was voldoende om veranderingen in de positie van gliale kernen binnen een wild-type oog verbeelding disc, observeren gliale kernen in een mutant van een gen dat nodig is voor gliale cel migratie geheel niet aan de optische steel (pijlen af te sluiten Figuur 1 FH). We hebben gekweekt eye-hersen-complexen voor periodes zo lang als 240 minuten voor het observeren van verslechtering van de gekweekte weefsel. Na de 240-minuten time-punt dat we beginnen te GFP positieve cellen te observeren in het kweekmedium omliggende gekweekte oog-brein-complexen (pijl Figuur 2 C). Daarnaast GFP zal ophopen in diffuse plekken in de weefsels wijzen op een defect in het weefsel integriteit. <img src="/files/ftp_upload/1155/figure1.png" alt="" width="589" height="241" /> Figuur 1: Live beeldvorming van GFP-gelabelde gliale kernen in de ontwikkelingslanden wild-type en mutant visuele systemen. A, E) Afbeeldingen gemaakt met behulp van differentieel interferentie contrast (DIC) microscopie van gekweekte wild-type en mutant eye-verbeelding schijven (ED). In het wild type, zijn gliacellen geboren in en migreren van de optische steel (OS) in het oog-disc. De hersenen is verwijderd om vervlakking en beeldvorming van het oog imaginaire disc te vergemakkelijken. BD) Fluorescentie microscopie van het wild type gekweekte oog verbeelding schijf in (A) op 0, 30, en 60 minuten de tijd punten onthult GFP-gelabelde gliale kernen migreren in het oog disc. FH) Fluorescentie microscopie van de mutant eye-hersen-complex in (E) op 0, 30, en 60 minuten tijdstippen toont een blokkering van GFP-gelabelde gliale kernen binnen de optische steel (pijl). De hersenen (BR) is overgelaten aan de optische steel om beeldvorming van glia te vergemakkelijken in de steel. <img src="/files/ftp_upload/1155/Figure_2.png" alt="" width="600" height="156" /> Figuur 2: Live beeldvorming van GFP-gelabelde gliale membranen in een wild-type oog imaginaire disc. We hebben met succes gekweekt eye-hersen-complexen voor de 240-minuten periodes. Weefsel gekweekte langer dan 240 minuten begint af te breken. Het kweekmedium rondom het oog denkbeeldige disc (ED), optische steel (OS), en de hersenen kwab (BR) bij 0 (A) en 150 minuten (B), in vergelijking met de 300 minuten tijd-punt (C), is gratis van GFP-positieve cellen, aangegeven door een pijl.

<ol><li>Aigouy, B., Lepelletier, L., Giangrande, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glial+chain+migration+requires+pioneer+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Glial chain migration requires pioneer cells.</a> J. Neurosci. 28, 11635-11641 (2008).</li>
<li>Silies, M., Yuva, Y., Engelen, D., Aho, A., Stork, T., Klambt, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glial+cell+migration+in+the+eye+disc%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Glial cell migration in the eye disc.</a> J. Neurosci. 27, 13130-13139 (2007).</li>
<li>Brand, A. H., Perrimon, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeted+gene+expression+as+a+means+of+altering+cell+fates+and+generating+dominant+phenotypes%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Targeted gene expression as a means of altering cell fates and generating dominant phenotypes.</a> Development. 118, 401-415 (1993).</li>
<li>Sepp, K. J., Auld, V. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Conversion+of+lacZ+enhancer+trap+lines+to+GAL4+lines+using+targeted+transposition+in+Drosophila+melanogaster%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">Conversion of lacZ enhancer trap lines to GAL4 lines using targeted transposition in Drosophila melanogaster.</a> Genetics. 151, 1093-1101 (1999).</li>
<li>Gibson, M. C., Patel, A. B., Nagpal, R., Perrimon, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+emergence+of+geometric+order+in+proliferating+metazoan+epitheia%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">The emergence of geometric order in proliferating metazoan epitheia.</a> Nature. 442, 1038-1041 (2006).</li>
<li>Lee, T., Luo, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mosaic+analysis+with+a+repressible+cell+marker+%28MARCM%29+for+Drosophila+neural+development%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Mosaic analysis with a repressible cell marker (MARCM) for Drosophila neural development.</a> Trends Neurosci. 24, 251-254 (2001).</li>
</ol>

De auteurs hebben niets te melden.

In dit protocol beschrijven we de observatie van gliale cel migratie in het oog denkbeeldige schijf met behulp van live-microscopie. In ons wild-type voorbeeld (figuur 1 AD), gebruikten we een nucleaire GFP marker om gliale cel beweging waarnemen in het oog disc in de loop van een uur. In een mutant voor een kandidaat-gen die nodig zijn voor gliale cel migratie momenteel onderzoek in ons laboratorium, zagen we een blokkering van gliale celkernen binnen de optische steel gedurende een periode van een uur (figuur...

<table><tbody><tr><td>Poly-L-lysine</td><td>Reagens</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P8920</td><td></td></tr><tr><td>Schneider&amp;rsquo;s insectenmedium</td><td>Reagens</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S0146</td><td></td></tr><tr><td>Penicilline-streptomycine</td><td>Reagens</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P4458</td><td></td></tr><tr><td>Insuline-oplossing uit runderpancreas</td><td>Reagens</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>I0516</td><td></td></tr><tr><td>Chamlide magnetische kamer</td><td>Instrument</td><td>Live cell Instrument</td><td>CM-R-10</td><td>Kamer van het type 35 mm schaal voor 18 mm dekglas</td></tr><tr><td>Ultrascherpe knip-schaar</td><td>Instrument</td><td>Fine Science Tools</td><td>15200-00</td><td></td></tr><tr><td>Dumont #5 pincet</td><td>Instrument</td><td>Fine Science Tools</td><td>11251-20</td><td></td></tr><tr><td>Fluorescentiemicroscoop</td><td>Microscoop</td><td>Carl Zeiss, Inc.</td><td></td><td>Elk fluorescentie-beeldvormingssysteem dat over de nodige filters en excitatie voor GFP beschikt, kan worden gebruikt.</td></tr></tbody></table>

live-imaging van gliale cel migratie in de drosophila eye verbeelding disc

Live Imaging of Glial Cell Migration in the Drosophila Eye Imaginal Disc

Gliale cellen van zowel gewervelde en ongewervelde organismen moeten migreren naar uiteindelijke doelstelling regio&#39;s om te ensheath en te ondersteunen verbonden neuronen. Terwijl de recente vooruitgang is geboekt om de live-migratie van gliacellen te beschrijven in de ontwikkelingslanden popstadium vleugel (1), studies van<em&gt; Drosophila</em&gt; Gliale cel migratie hebben meestal gepaard met het onderzoek van vaste weefsel. Live-microscopische analyse van de beweeglijke cellen biedt de mogelijkheid om cellulaire gedrag te onderzoeken gedurende het migratieproces, inclusief het bepalen van de snelheid van en veranderingen in de richting van groei. Gepaard met het gebruik van genetische tools kunnen leven imaging worden gebruikt om meer precieze rol voor specifieke genen in het proces van ontwikkeling te bepalen. Eerder werk van Silies<em&gt; Et al..</em&gt; (2) heeft beschreven de migratie van glia afkomstig van de optische steel, een structuur die de zich ontwikkelende oog en de hersenen verbindt, in het oog denkbeeldige schijf in vaste weefsel. Hier schetsen we een protocol voor de behandeling van de live migratie van gliacellen in de<em&gt; Drosophila</em&gt; Oog imaginaire disc. We profiteren van een Drosophila lijn die GFP tot uitdrukking in de ontwikkeling van glia te volgen gliale cel progressie in wild type en in mutant dieren.

Hier beschrijven we een protocol om de migratie van gliacellen te onderzoeken in de zich ontwikkelende Drosophila oog met behulp van levende microscopische analyse gecombineerd met GFP gelabelde gliacellen.

Live-Imaging van gliale cel migratie in de Drosophila Eye verbeelding Disc

Gliale cellen van zowel gewervelde als ongewervelde organismen moeten migreren naar uiteindelijke doelgebieden om geassocieerde neuronen te omhullen en te ondersteunen. Terwijl ...

We dissekeren de larven door de posterieure en anterieure uiteinden vast te pakken en vervolgens de pincetten in tegenovergestelde richtingen te trekken. Overtollig weefsel wordt weggesneden met ultrafijne scharen. Hierdoor komen de twee hemisferen van de imaginale schijven van het larvale brein-oog zichtbaar.Het ventrale zenuwkoord en de mondhaken. Het oog-hersencolplex van de larve wordt overgebracht naar een kweekkamer. We scheiden de hersenkwab van de optische steel om de migratie van gliacellen binnen een imaginale oogschijf van het wildtype te visualiseren.Om gestopte gliacellen in de oogsteel van een mutant waar te nemen, laten we de hersenkwab verbonden met de oogsteel. Hallo, ik ben Patrick Cafferty van het laboratorium van Vanessa Als in de afdeling Zoölogie aan de University of British Columbia. Hallo, ik ben Rin.Vanaf vandaag laten we u een procedure zien voor het visualiseren van migrerende gliacellen in het ontwikkelende oog van drosophila. We gebruiken deze procedure in ons laboratorium om de ontwikkeling van gliacellen te bestuderen. Laten we beginnen.Eén week vóór de start van het experiment worden vliegen gepaard om larven te genereren die GFP tot expressie brenge

live-imaging-glial-cell-migration-drosophila-eye-imaginal

Research

JoVE Journal

Biology

Biologie

Beschrijven we een nieuw rood fluorescerend eiwit (RFP) reporter dat specifiek wordt uitgedrukt in...

A Novel RFP Reporter Steun in de visualisatie van het oog denkbeeldige Disc in Drosophila</em

Drosophila hemocytes verspreiden over het geheel van de zich ontwikkelende embryo. Dit protocol laat zien hoe te monteren en het imago van deze migraties met behulp van embryo's met fluorescent gelabelde hemocytes.

Live-beeldvorming van Drosophila melanogaster Embryonale Hemocyte Migraties

De voorbereiding van de ontwikkeling en Adult Drosophila Hersenen en retinae voor Live Imaging

This video demonstrates the immunofluorescence staining of a transgenic Drosophila brain for single-cell imaging of glial cells. The brain expresses membrane-targeted proteins fused with different combinations of antigenic epitopes under the control of a glial-specific recombinase system. The isolated and fixed brains are stained with primary antibodies specific to the antigenic epitopes, followed by fluorophore-conjugated secondary antibodies. This labeling enables the simultaneous imaging of...

Immunofluorescence Staining of Drosophila Brains for the Single-Cell Imaging of Glial Cells

Source: Hellerman, M. B., et al. Live-imaging of the Drosophila Pupal Eye. J. Vis. Exp. (2015)The video demonstrates a live-imaging technique to study eye patterning in a Drosophila melanogaster pupa. Green fluorescent protein (GFP)-tagged markers enable visualization of cellular organization and differentiation during the formation of the developing eye structure.

Live Imaging of the Drosophila Pupal Eye Using Fluorescence Microscopy

Dit protocol Gegevens een gestroomlijnde methode voor live cell imaging uitvoeren in het kader van een intact larvale hersenen. Live cell imaging benaderingen zijn van onschatbare waarde voor de studie van asymmetrische neurale stamcellen divisies evenals andere neurogene en ontwikkelingsprocessen, consequent blootleggen van mechanismen die eerder over het hoofd gezien.

Live-Imaging van<em&gt; Drosophila</em&gt; Larvale neuroblasts

De volwassen structuren van Drosophila zijn afgeleid van zak-achtige structuren die imaginale schijven worden genoemd. Analyse van deze schijven biedt inzicht in vele ontwikkelingsprocessen, waaronder weefselbepaling, oprichting van compartimentgrenzen, celproliferatie, celbestemmingsspecificatie en cellulaire planaire polariteit. Dit protocol wordt gebruikt om imaginale schijven voor te bereiden op licht-/fluorescentiemicroscopie.

Dissectie en Immunokleuring van Imaginal schijven uit Drosophila melanogaster

Dit protocol presenteert een efficiënte methode voor het beeldvormen van het levende Drosophila pupale oogneuro-epitheel. Deze methode compenseert voor weefselbeweging en ongelijke topologie, verbetert de visualisatie van celgrenzen door het gebruik van meerdere GFP-gelabelde junctie-eiwitten en maakt gebruik van een eenvoudig te monteren beeldvormingsopstelling.

Live-beeldvorming van de Drosophila Pupal Eye

Dit protocol beschrijft een gedetailleerde methode voor de lange termijn ex vivo cultuur en live beeldvorming van een Drosophila imaginaire disc. Het toont fotoreceptor differentiatie en ommatidial rotatie binnen de 10 uur periode van live-imaging van het oog disc. Het protocol is eenvoudig en niet duur setup nodig.

Langdurige Live-Imaging van<em&gt; Drosophila</em&gt; Disc Eye

Hier bieden we een gedetailleerd protocol om live beeldvorming uit te voeren van de asymmetrische deling van germinale stamcellen (GSC's) in de Drosophila ovarium-niche. We gebruiken een transgene lijn die ubiquitair een groen fluorescent eiwit (GFP) tot expressie brengt, een fusie van het spectrosoom-eiwit Par-1.

Uitgebreide live beeldvorming van vrouwelijke Drosophila melanogaster kiembaanstammecellen niches

We beschrijven een protocol voor het meten van contacten tussen cellen in aangrenzende epitheellagen in levende imaginaire schijven van de Drosophila-vleugel met behulp van een op GFP-reconstitutie gebaseerde benadering.

Een op GFP-complementatie gebaseerd systeem met dubbele expressie voor het beoordelen van cel-celcontact gemedieerd door cytonemen in levende imaginaire schijven van de Drosophila-vleugel

Leer live-imaging van gliale celmigratie in het ontwikkelende oog van Drosophila met GFP-markering. Deze methode maakt real-time observatie van celgedrag mogelijk voor neurowetenschappelijk onderzoek.

Live-Imaging van gliale cel migratie in de Drosophila Eye verbeelding Disc

Meer video's verkennen