Live-Imaging van gliale cel migratie in de Drosophila Eye verbeelding Disc

We dissekeren de larven door de posterieure en anterieure uiteinden vast te pakken en vervolgens de pincetten in tegenovergestelde richtingen te trekken. Overtollig weefsel wordt weggesneden met ultrafijne scharen. Hierdoor komen de twee hemisferen van de imaginale schijven van het larvale brein-oog zichtbaar.

Het ventrale zenuwkoord en de mondhaken. Het oog-hersencolplex van de larve wordt overgebracht naar een kweekkamer. We scheiden de hersenkwab van de optische steel om de migratie van gliacellen binnen een imaginale oogschijf van het wildtype te visualiseren.

Om gestopte gliacellen in de oogsteel van een mutant waar te nemen, laten we de hersenkwab verbonden met de oogsteel. Hallo, ik ben Patrick Cafferty van het laboratorium van Vanessa Als in de afdeling Zoölogie aan de University of British Columbia. Hallo, ik ben Rin.

Vanaf vandaag laten we u een procedure zien voor het visualiseren van migrerende gliacellen in het ontwikkelende oog van drosophila. We gebruiken deze procedure in ons laboratorium om de ontwikkeling van gliacellen te bestuderen. Laten we beginnen.

Eén week vóór de start van het experiment worden vliegen gepaard om larven te genereren die GFP tot expressie brengen onder controle van een glia-specifieke promoter. Dit experiment omvat de visualisatie van GFP gekoppeld aan een nucleaire lokalisatiesequentie die tot expressie komt in gliacellen. Bereid ten minste één dag van tevoren ronde dekglasjes van 18 millimeter voor met de promoter voor omgekeerde polariteit door ze 10 minuten te weken in een 1% poly-L-lysine-oplossing en ze vervolgens de dag vóór het experiment een nacht aan de lucht te laten drogen.

Reinig een magnetische kweekkamer met kettingligging door de componenten op de dag van het experiment een nacht lang te weken in 70% ethanol. Gebruik aseptische technieken om het kweekmedium voor te bereiden. Voeg foetaal runderserum, penicilline-streptomycine-oplossing en insuline toe aan 10 milliliters Schneider's insectenmedium.

Laat de schone, met magnetische kralen gevulde kweekkamer aan de lucht drogen in een celkweekkast voordat het resterende ethanol wordt weggespoeld door te spoelen met het bereide kweekmedium. Zodra deze voorbereidingen zijn getroffen, kunnen we beginnen met de dissectie van het oog-hersenencomplex van de drosophila. Om deze procedure te starten, selecteer je een dwalende larve in het derde stadium van de zijkant van een vliegenbuisje en plaats je deze enkele minuten ter afkoeling in een druppel gekoeld kweekmedium op een Petri-schaal op ijs.

Het wordt aanbevolen om de larven te laten afkoelen zodat de peristaltische lichaamscontracties vertragen voor een gemakkelijker dissectieproces. Plaats vervolgens de gekoelde larven in een druppel kweekmedium op een met agar gecoate schaal onder een dissectiemicroscoop. Gebruik een pincet van het type Dumont fine om de larven stevig vast te pakken. Wacht op ongeveer een derde van de afstand vanaf het posterieure uiteinde tot de larve de mondhaken uit het anterieure uiteinde steekt; zodra de mondhaken volledig zijn uitgestrekt, pakt u deze vast met een tweede pincet.

Trek om de larven te dissekeren de twee paren pincetten langzaam in tegenovergestelde richtingen. Het oog-hersenencomplex, samen met de speekselklieren, vetlichamen en imaginaal weefsel, zal loskomen van het larvenlichaam. Trek de mondhaken niet te snel, anders scheuren ze af van het iBrain-complex.

Verwijder de speekselklieren, vetlichamen en imaginale schijven. Met behulp van ultrafijne precisieschaartjes blijven de twee hersenhelften en oogschijven verbonden met het ventrale zenuwkoord en de mondhaken. Plaats vervolgens een dekglas van 18 millimeter op een objectglas, waarbij één rand van het dekglas over de rand van het objectglas steekt. Voeg een druppel kweekmedium toe op het dekglas om dit later gemakkelijker op te kunnen pakken.

Pak de mondhaken vast met een pincet en breng het iBrain-complex over naar het cultuurmedium op het dekglas. Zodra het oog-hersencomplex is overgebracht naar het dekglas, kunnen de mondhaken met een fijne dissectieschaar van het oog-hersencomplex worden afgeknipt.

Het verwijderen van de mondhaken is belangrijk voor live-imaging, aangezien de mondhaken in het kweekmedium blijven samentrekken, waardoor het weefsel tijdens de microscopie gaat bewegen. Om GL binnen de optic stalk te visualiseren, laat u de optic stalk van de hersenen en de imaginale oogschijf intact. Om gliale migratie binnen de imaginale oogschijf te visualiseren, snijdt u voorzichtig de optic stalk door—het dunne weefsel dat de hersenen en de oogschijf verbindt—en duwt u de hersenen weg of verwijdert u deze.

Pak tot slot het dekglas op met een pincet en teken met een permanente marker een cirkel eronder rondom het weefsel van belang. Deze cirkel helpt bij het later lokaliseren van het weefsel tijdens de microscopie. De imaginale oogschijf is nu klaar voor montage in een magnetische kweekkamer.

Om de imaginale oogschijf in een magnetische kweekkamer te monteren, gebruikt u een pincet om de uitsteekende rand van het dekglas vast te pakken en het dekglas over te brengen naar de bodemplaat van de magnetische chain line-kamer zonder het weefsel in de kweek te verstoren. Plaats vervolgens de siliconen o-ring op het hoofdlichaam van de chain line-kamer. Installeer het hoofdlichaam langzaam bovenop de bodemplaat.

Voeg kweekmedium toe aan de kamer. Voeg het kweekmedium niet te snel toe, om te voorkomen dat het weefsel wordt verstoord, zodat er gasuitwisseling onder de afdekking mogelijk is. Vul de kamer niet volledig en plaats de onzichtbare afdekking voorzichtig bovenop de chain line-kamer.

Om migrerende gliacellen te visualiseren, plaatst u de kweekkamer op de tafel van een confocale of fluorescentiemicroscoop. Lokaliseer het monster bij een lage vergroting door de cirkel op het dekglas als referentie te gebruiken. Stel scherp op het monster met een 40-voudige lens.

Laat het weefsel tot rust komen en maak elke 10 tot 15 minuten beelden van de oogschijf of de optische steel gedurende drie tot vier uur, mits correct uitgevoerd. Dit protocol resulteert in een reeks beelden van GFP-gelabelde gliacellen die vanuit de optische steel naar de imaginale oogschijf migreren. Hoewel live-imaging gedurende een periode van 60 minuten voldoende was om veranderingen in de posities van gliale kernen in een wildtype imaginale oogschijf waar te nemen, slaagden gliale kernen in een mutant voor een gen dat noodzakelijk is voor de migratie van gliacellen er volledig in niet in om de optische steel te verlaten.

We hebben oog-hersencomplexen gedurende perioden van maximaal 240 minuten gekweekt voordat er verslechtering van het gekweekte weefsel werd waargenomen. Na het tijdstip van 240 minuten beginnen we GFP-positieve cellen waar te nemen in het kweekmedium rondom de gekweekte oog-hersencomplexen. Daarnaast zal GFP zich ophopen in diffuse vlekken door het weefsel heen, wat wijst op een verlies van de weefselintegriteit.

We hebben zojuist laten zien hoe u imaginale schijven kunt kweken om de migratie van gliacellen te bestuderen. Bedankt voor het kijken en veel succes met uw experimenten.