Name: Kwantificeren van Gist Chronologisch Life Span door uitgroei van Aged cellen (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2009-05-06T00:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 24 s
Description: Leer een high-throughput methode om de chronologische levensduur van gist te kwantificeren door uitgroei van verouderde cellen. Deze techniek meet celviabiliteit over tijd in stationaire fase.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dit werk werd ondersteund door NIH Grant 1R21AG031965-01A1. MK is een Ellison Medical Foundation New Scholar in Aging.

Deel 1: Voorbereiding van het ouder worden culturen <ol><li> Streak stammen van interesse van bevroren voorraden op YEPD agarplaten (1% gistextract, 2% Bacto-pepton, 2% agar, 2% glucose). </li><li> Incubeer de cellen bij 30 ˚ C gedurende 48 uur of totdat enkele kolonies verschijnen. </li><li> Pick enkele kolonies en enten in 5 ml YEPD vloeibaar medium (1% gistextract, 2% Bacto-pepton, 2% glucose) in reageerbuizen. </li><li> Grow culturen &#39;s nachts bij 30 ˚ C, terwijl je continu roert met behulp van een shaker of roller drum. </li><li> Inoculeer 5 ml van synthetische complete (SC) medium (Tabel 1) met 50 pi van het &#39;s nachts cultuur. Over het algemeen drie SC culturen zijn bereid voor elke stam te drievoud biologische replicatie van de levensduur analyse voor elke stam wordt onderzocht. </li><li> Handhaaf de culturen bij 30 ˚ C met een constante agitatie op een roller trommel voor het hele experiment (doorgaans 2 of meer weken). </li></ol> Deel 2: Het nemen van een levensvatbaarheid leeftijd-punt Na twee dagen cultuur in SC media, moeten de cellen in de stationaire fase en het eerste jaar-point is klaar om te worden genomen. Latere leeftijd-punten moeten worden genomen om de 2-3 dagen voor een minimum van twee weken. Voor elke leeftijd punt: <ol><li> Bereid de Bioscreen 100-well platen Honingraat voor inoculatie door het invullen van elk putje met 145 pi van YEPD. Zorg ervoor dat u ten minste een goed gevuld te verlaten met alleen YEPD en geen cellen voor data-analyse later. </li><li> Verwijder de veroudering culturen uit de incubator. </li><li> Kort vortex de eerste cultuur te worden geënt in het Honeycomb plaat, terwijl ze voorzichtig om geen van de cultuur morsen. </li><li> Verwijder de 5 pi van de gemengde cultuur en pipet het in de eerste putje van de honingraat plaat. Vlam de mond van elk reageerbuisje voor en na het verwijderen van de 5 pi aliquot deel. </li><li> Herhaal deze procedure voor elke ouder worden cultuur en zorg ervoor dat de goed positie die overeenkomt met elke cultuur noot. Identieke goed posities moeten worden gebruikt voor elke volgende leeftijd-punt in het hele experiment. </li><li> Vervang de culturen in de 30 ˚ C incubator wanneer u klaar bent met de inentingen. </li></ol> Deel 3: Het laden van de Bioscreen C MBR machine <ol><li> Expose de incubator compartiment door het optillen van het deksel en verwijder het deksel om het monster lade. </li><li> Plaats de nieuwe geïnoculeerde Honeycomb plaat in monsterhouder (gebruik de linker sleuf als je alleen het lezen van een plaat). </li><li> Plaats het deksel op de steekproef lade en laat de deksel op de incubator compartiment. </li><li> Controleer of de warmte-overdracht vloeistof is boven het minimum te vullen niveau. Indien laag, voeg meer met behulp van een 1000 pi pipet met de warmte die vloeistof. </li><li> Met behulp van de Bioscreen software &quot;EZExperiment&quot;, stel de volgende parameters om geschikte groeicurven voor Saccharomyces cerevisiae te krijgen: <ul><li> Aantal monsters: Voer het aantal putten met media of 200 </li><li> Filter: 420-580nm, Wideband </li><li> Temperatuur: 30 ˚ C </li><li> Experiment Lengte: 1 dag, 0 uur, 0 seconden </li><li> Meetinterval: 30 minuten </li><li> Schudden: aan, voortdurend schudden, High </li></ul></li><li> Klik op &quot;Start&quot; om metingen te beginnen. </li></ol> Deel 4: Data Analysis Typisch, zijn zes leeftijd-points die in de loop van twee weken. De leeftijd-punten zijn genomen op dag 2, 4, 6, 9, 11 en 13. Afhankelijk van het experimenteel ontwerp en stammen wordt getest, kan het wenselijk zijn de leeftijd-punten meer of minder vaak of langer dan 2 weken duren. Het is belangrijk om de honingraat plaat belasting in dezelfde volgorde voor elke leeftijd-point zodanig dat elke ouder de cultuur komt overeen met dezelfde goed te positioneren op elke leeftijd-point, want dit maakt data-analyse veel eenvoudiger. <ol><li> Verkrijgen van de output bestanden van de Bioscreen C MBR machine. De software &quot;EZExperiment&quot; zal de uitgang van de Bioscreen gegevens als een tab-gescheiden bestand dat compatibel is met Microsoft Excel en andere software. De eerste kolom laat zien op welk moment van de OD meting is genomen tijdens het experiment, met de daaropvolgende kolommen die elk putje in de Bioscreen Honeycomb platen (figuur 1). </li><li> Verwijder de eerste OD lezen van elke kolom. Deze lezing is &quot;ruis&quot;. </li><li> Normaliseren van de gegevens door het aftrekken van de OD-waarde van het goed met alleen YEPD van alle OD waarden in elke kolom. Dit verwijdert de achtergrond absorptie door de media. </li><li> Plot de uitgroei bochten. De curven zal verschuiven als functie van de leeftijd (figuur 2). Bijvoorbeeld door het plotten van de uitgroei curves van kolom 1 (goed een van de Honeycomb plaat) over de zes tijdstippen is er een duidelijke verschuiving naar rechts van de bochten in de tijd. </li><li> Bereken de verdubbelingstijd (δ) voor elke goed op basis van de groei kinetiek van de dag 2 leeftijds-punt. De vergelijking gebruikt voor de verdubbeling van tijd te berekenen is: <img src="/files/ftp_upload/1156/equat.png" alt="Vergelijking" /> waar de OD 1 en OD 2 opeenvolgende metingen OD en t 1 en t 2 wordt de tijd tussen de metingen te vertegenwoordigen. Bereken verdubbeling keer alleen tussen OD-waarden van 0,2 tot 0,5. Het gemiddelde van deze waarden is de verdubbeling tijd voor goed. Bereken verdubbeling keer alleen tussen OD-waarden van 0,2 tot 0,5. Het gemiddelde van deze waarden is de verdubbeling tijd voor goed. De meeste wild-type giststammen moet geven een verdubbeling van de tijd de waarde tussen de 85 tot 90 minuten. </li><li> Voor elke leeftijd-punt, het berekenen van de time-shift (At) in de uitgroei bochten ten opzichte van de initiële leeftijd-point (dag 2). Een gemakkelijke manier om dit te doen is om te bepalen het verschil in de lengte van de tijd die nodig was voor elke well met een buitendiameter van 0,3 te bereiken tussen de initiële leeftijd-point en elke volgende leeftijd-punt. De tijd dat een bepaald goed een OD van 0,3 bereikt, kan worden berekend uit de lineaire regressievergelijking die overeenkomt met ln (OD) als een functie van de tijd tussen de twee tijdstippen bracketing OD = 0,3. </li><li> Bereken de fractie overlevende op elke leeftijd punt om een ​​survival curve (figuur 3) te genereren. Definieer de initiële leeftijd-point (dag 2) tot 100% levensvatbaarheid. Voor elke volgende leeftijd-point Bereken het percentage overleven met behulp van de vergelijking: <img src="/files/ftp_upload/1156/equat2.png" alt="Tweede vergelijking" width="245" height="115" /> waarbij s n is de overleving percentage, At n is de time-shift, en δ n is de verdubbeling van de tijd. </li><li> Genereer overlevingscurven (Figuur 3B) zoals gewenst voor elk goed (of kopiëren putten) door het plotten van de fractie (of percentage) van de levensvatbare cellen als een functie van de leeftijd. </li><li> Bereken het voortbestaan ​​integrale (SI) voor elk putje. SI wordt gedefinieerd als het gebied onder de curve overleven en kan worden geschat door de formule: <img src="/files/ftp_upload/1156/equat3.png" alt="Vergelijking 3" width="400" height="79" /> waar de leeftijd van n is de leeftijd-point (bijv. 2, 4, 6, 9, 11 en 13) en s n is de overleving waarde op die leeftijd-punt. </li><li> Bepaal statistische parameters van repliceren putten uit de SI en de overleving van gegevens. Gemeenschappelijke statistische parameters die van belang zijn gemiddelde, mediaan, en de variantie voor elke set van biologische repliceert. Een t-test of een soortgelijke analyse kan worden gebruikt voor de paarsgewijze vergelijking van SI voor verschillende experimentele en controlegroepen. Het kan ook wenselijk zijn om te overleven bochten, zoals beschreven in 4.8 van de gemiddelde biologische repliceert te genereren. </li></ol> Deel 5: Representatieve resultaten Bij de voltooiing van het experiment, dan heb je geplot het overleven curve en uitgevoerd data-analyse voldoende om de chronologische veroudering mogelijkheden voor verschillende stammen of voorwaarden vast te stellen. Als dit goed wordt uitgevoerd, moeten de groeicurven verkregen uit de Bioscreen C MBR machine lijken op die getoond in Figuur 2 en de daaruit voortvloeiende overlevingscurves moet lijken op die in figuur 3. Over het algemeen, wild-type cellen gekweekt onder de voorwaarden die hier beschreven wordt een mediane chronologische levensduur hebben op de orde van 7 dagen. Aanzienlijke variatie in overleving is waargenomen in verschillende stammen en onder bepaalde omstandigheden, zoals de groei van 0,05% glucose media, kan mediane overleving meer dan 30 dagen. <img src="/files/ftp_upload/1156/1156fig1.png" alt="" /> Figuur 1. Gegevens output van het Bioscreen programma &quot;EZExperiment&quot;. Kolom A geeft het tijdstip waarop een absorptie lezen werd genomen. Opeenvolgende kolommen vertegenwoordigen de putjes van de plaat Honeycomb geënt met cellen van veroudering culturen. <img src="/files/ftp_upload/1156/1156fig2.png" alt="" /> Figuur 2. Uitgroei bochten van een enkele biologische repliceren in de loop van een experiment. Er is een duidelijke verschuiving in de bochten in de tijd als cellen in de vergrijzing van de cultuur te verliezen levensvatbaarheid. De lengte van de tijd tussen het eerste tijdstip (dag 2) en een keer op punt bepaalt levensvatbaarheid op die bepaalde leeftijd. <img src="/files/ftp_upload/1156/1156fig3a.png" alt="" /><img src="/files/ftp_upload/1156/1156fig3b.png" alt="" /> Figuur 3. A) Een survival curve gegenereerd met behulp van de uitgroei van gegevens uit figuur 1. De dag twee keer punt is ingesteld als de 100% levensvatbaarheid punt. B) definitieve overlevingscurven van de twee stammen getest in hetzelfde experiment. Deze overlevingscurven vertegenwoordigen het gemiddelde de levensvatbaarheid van de drie biologische herhalingen voor elke stam. Foutbalken geven de standaarddeviatie binnen de biologische repliceert. Het gearceerde gebied onder de survival curve geeft het voortbestaan ​​integrale (SI) voor een stam. <table border="1"><tbody><tr><td colspan="2"> Tabel 1. Synthetische beschreven medium gebruikt voor het Chronologisch Aging Studies (stam background BY4743) </td></tr><tr><td> Bestanddeel </td><td> Concentratie (g / L) </td></tr><tr><td> D-glucose </td><td> 20 </td></tr><tr><td> Yeast nitrogen base (-AA/AS) </td><td> 1.7 </td></tr><tr><td> (NH 4) 2 SO 4 </td><td> 5.0 </td></tr><tr><td> Adenine </td><td> 0.04 </td></tr><tr><td> L-Arginine </td><td> 0.02 </td></tr><tr><td> L-Asparaginezuur </td><td> 0.1 </td></tr><tr><td> L-Glutaminezuur </td><td> 0.1 </td></tr><tr><td> L-Histidine </td><td> 0.1 </td></tr><tr><td> L-Leucine </td><td> 0.3 </td></tr><tr><td> L-Lysine </td><td> 0.03 </td></tr><tr><td> L-Methionine </td><td> 0.02 </td></tr><tr><td> L-Fenylalanine </td><td> 0.05 </td></tr><tr><td> L-Serine </td><td> 0.375 </td></tr><tr><td> L-Threonine </td><td> 0.2 </td></tr><tr><td> L-Tryptofaan </td><td> 0.04 </td></tr><tr><td> L-Tyrosine </td><td> 0.03 </td></tr><tr><td> L-Valine </td><td> 0.15 </td></tr><tr><td> Uracil </td><td> 0.1 </td></tr></tbody></table> Opmerking: Dit recept is goed voor auxotrophies in diploïde BY4743 stam. Aminozuur auxotrophies moet worden gecompenseerd door het toevoegen van een 5X uiteindelijke concentratie aan de synthetische complete medium.

<ol><li>Steinkraus, K. A., Kaeberlein, M., Kennedy, B. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Replicative+aging+in+yeast%3A+the+means+to+the+end%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Cell+Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Replicative aging in yeast: the means to the end.</a> Annu Rev Cell Dev Biol. 24, 29(2008).</li>
<li>Kaeberlein, M. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aKaeberlein%2C+M+%22Handbook+of+models+for+human+aging%22">Handbook of models for human aging</a>. Conn, P. M. , Elsevier Press. Boston. 109(2006).</li>
<li>Fabrizio, P., Longo, V. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+chronological+life+span+of+Saccharomyces+cerevisiae%5BTitle%5D)+AND+%22Aging+Cell%22%5BJournal%5D)">The chronological life span of Saccharomyces cerevisiae.</a> Aging Cell. 2 (2), 73(2003).</li>
<li>Murakami, C. J., Burtner, C. R., Kennedy, B. K., Kaeberlein, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+method+for+high-throughput+quantitative+analysis+of+yeast+chronological+life+span%5BTitle%5D)+AND+%22J+Gerontol+A+Biol+Sci+Med+Sci%22%5BJournal%5D)">A method for high-throughput quantitative analysis of yeast chronological life span.</a> J Gerontol A Biol Sci Med Sci. 63 (2), 113(2008).</li>
<li>Piper, P. W., Harris, N. L., MacLean, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preadaptation+to+efficient+respiratory+maintenance+is+essential+both+for+maximal+longevity+and+the+retention+of+replicative+potential+in+chronologically+ageing+yeast%5BTitle%5D)+AND+%22Mech+Ageing+Dev%22%5BJournal%5D)">Preadaptation to efficient respiratory maintenance is essential both for maximal longevity and the retention of replicative potential in chronologically ageing yeast.</a> Mech Ageing Dev. 127 (9), 733(2006).</li>
<li>Fabrizio, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Superoxide+is+a+mediator+of+an+altruistic+aging+program+in+Saccharomyces+cerevisiae%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Superoxide is a mediator of an altruistic aging program in Saccharomyces cerevisiae.</a> J Cell Biol. 166 (7), 1055(2004).</li>
</ol>

De high-throughput chronologische levensduur test hier beschreven is een effectieve methode voor het kwantificeren van de veroudering potentieel van grote aantallen van stammen met een hoge nauwkeurigheid en precisie. De primaire opmars van deze methode ten opzichte van klassieke methoden voor de bepaling te overleven door het tellen van kolonievormende eenheden (bijv. zie 3) is het gebruik van een shaker / incubator / plaat leesapparaat, zoals de Bioscreen C MBR machine met een hoge resolutie groeicurven te ...

<table><tbody><tr><td>Bacto Peptone</td><td>Reagens</td><td>BD Biosciences</td><td>211677</td><td></td></tr><tr><td>Bacto Gistextract</td><td>Reagens</td><td>BD Biosciences</td><td>288620</td><td></td></tr><tr><td>Difco Agar</td><td>Reagens</td><td>BD Biosciences</td><td>214530</td><td></td></tr><tr><td>Yeast Nitrogen Base zonder aminozuren en ammoniumsulfaat</td><td>Reagens</td><td>MidSci</td><td>J630-500G</td><td></td></tr><tr><td>Aminozuren</td><td>Reagens</td><td>Sigma-Aldrich</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ammoniumsulfaat</td><td>Reagens</td><td>Spectrum</td><td>AM185</td><td></td></tr><tr><td>Dextrose</td><td>Reagens</td><td>Fisher Scientific</td><td>D16-10</td><td></td></tr><tr><td>Bioscreen C MBR-apparaat</td><td>Instrument</td><td>Growth Curves USA</td><td>5101370</td><td></td></tr><tr><td>Bioscreen 100-well Honeycomb-plaat</td><td>Instrument</td><td>Growth Curves USA</td><td>9502550</td><td></td></tr></tbody></table>

kwantificeren van gist chronologisch life span door uitgroei van aged cellen

Quantifying Yeast Chronological Life Span by Outgrowth of Aged Cells

De gist<em&gt; Saccharomyces cerevisiae</em&gt; Heeft zich bewezen als een belangrijk model organisme in het gebied van vergrijzing onderzoek<sup&gt; 1</sup&gt;. De replicatieve en chronologische levensduur zijn twee gevestigde paradigma&#39;s gebruikt om te bestuderen veroudering in gist. Replicatieve veroudering wordt gedefinieerd als het aantal van de dochter van cellen een enkele gist moeder cel produceert voor veroudering, chronologische veroudering wordt bepaald door de lengte van de tijd cellen kunnen overleven in een niet-delende, rust-achtige toestand<sup&gt; 2</sup&gt;. Hebben we een high-throughput-methode voor kwantitatieve meting van de chronologische levensduur. Deze methode houdt veroudering van de cellen in een bepaald medium onder roeren en bij constante temperatuur. Op elke leeftijd-punt, is een sub-populatie van cellen verwijderd zijn van de vergrijzing cultuur en geënt in een rijke groei medium. Een hoge-resolutie groeicurve wordt dan verkregen voor deze sub-populatie van oude cellen met behulp van een Bioscreen C MBR machine. Een algoritme wordt vervolgens toegepast op het relatieve aandeel van levensvatbare cellen in elke sub-populatie op basis van de groei kinetiek bij elke leeftijd-point te bepalen. Deze methode vereist aanzienlijk minder tijd en middelen in vergelijking met andere chronologische levensduur testen met behoud van reproduceerbaarheid en precisie. De high-throughput aard van deze test moet het mogelijk maken voor grootschalige genetische en chemische screens om nieuwe lange levensduur modifiers te identificeren voor verdere testen in meer complexe organismen.

Chronologische veroudering in gist verwijst naar het verlies van cel levensvatbaarheid geassocieerd met de tijd in de stationaire fase. Hier beschrijven we een high-throughput methode voor het kwantitatief bepalen van gist chronologische levensduur.

Kwantificeren van Gist Chronologisch Life Span door uitgroei van Aged cellen

De bakkersgist Saccharomyces cerevisiae is een belangrijk modelorganisme gebleken in het veld van het verouderingsonderzoek 1. De replicatieve en ...

Verouderende culturen worden bewaard in reageerbuizen bij 30 °C onder constante agitatie. Via een roltrommel wordt een aliquot cellen van elke verouderende cultuur geïnoculeerd in een well van een bio screen honeycomb-plaat met YEPD-medium. De bio screen CMBR-machine incubeert en schudt de honeycomb-plaat gedurende 24 uur, terwijl de optische dichtheid van elke well wordt gemeten.Om de 30 minuten kunnen groeicurves worden gegenereerd uit de data-output van de bio screen, die gebruikt kunnen worden om de levensvatbaarheid van elke verouderende cultuur te berekenen. Na de incubatie van 24 uur kunnen de celdichtheden in de putjes van de honeycomb-plaat variëren, afhankelijk van de levensvatbaarheid van de oorspronkelijke verouderende cultuur. Hallo, ik ben Chris Murakami van het laboratorium van Dr. Matt Capline en de afdeling Pathologie hier aan de University of Washington.Vandaag laten we u de procedure zien voor het kwantificeren van de chronologische levensduur van gist met behulp van de uitgroei van oude cellen. We gebruiken deze procedure in ons laboratorium om te bestuderen hoe zowel genetische als omgevingsfactoren de levensduur van gist beïnvloeden. Laten we beginnen.Om verouderingsculturen voor te bereiden, wordt eerst een uitstrijk gemaakt van giststammen uit bevroren stocks op YEPD-agarplaten; incubeer de cellen bij 30 °C gedurende 48 uur of totdat er enkelvoudige kolonies verschijnen. Zodra er enkelvoudige kolonies zijn verschenen, worden deze gepikt en geïnoculeerd in vijf milliliter YEPD vloeibaar medium.Kweek culturen in reageerbuizen gedurende de nacht bij 30 °C in een roltrommel om een constante agitatie te waarborgen. Gebruik na de incubatie overnacht 50 µL van elke cultuur om vijf milliliter synthetisch compleet medium te inoculeren. Over het algemeen worden er drie SC-culturen per stam klaargemaakt om biologische triplicaat-replicatie van de levensduuranalyse te verkrijgen voor elke onderzochte stam. Houd de culturen gedurende het gehele experiment, dat gewoonlijk twee of meer weken duurt na twee dagen kweek, bij 30 °C onder constante agitatie op een roltrommel.In SC-medium moeten de cellen zich in een stationaire fase bevinden, waarna het eerste leeftijdspunt kan worden afgenomen. Vervolg-leeftijdspunten moeten elke twee tot drie dagen worden afgenomen gedurende minimaal twee weken. Bereid ter voorbereiding van deze procedure het bioscreen voor.Gebruik 100-well honeycomb-platen voor inoculatie en vul elke well met 145 µL YEPD. Zorg ervoor dat ten minste één well alleen met YEPD wordt gevuld, zonder cellen, voor latere data-analyse. Haal de verouderende culturen uit de incubator.Vortex kort de eerste cultuur die in de honeycombplaat moet worden geïnoculeerd. Let erop dat er geen cultuur wordt gemorst. Flambeer de opening van de reageerbuis en neem 5 µL van de cultuur op om deze in het eerste well van de honeycombplaat te pipetteren.Vergeet niet de mond van de reageerbuis te vlammen. Herhaal na het verwijderen van het aliquot van 5 µL deze inoculatieprocedure voor elke verouderende cultuur. Zorg ervoor dat de well-positie die overeenkomt met elke identieke cultuur wordt genoteerd.Putposities moeten worden gebruikt voor elk opeenvolgend tijdstip gedurende het gehele experiment. Plaats de culturen terug in de incubator op 30 °C. Wanneer de inoculaties zijn voltooid en de culturen in de honingraatplaat zijn geënt, wordt de plaat in de bio screen CMBR-machine geladen.Om dit te doen, maakt u het incubatiecompartiment toegankelijk door het deksel op te tillen. Verwijder vervolgens de afdekking van de monsterlade. Plaats de vers geïnoculeerde honeycomb-plaat in de monsterlade.Gebruik het linker slot. Als u slechts één plaat uitleest, plaatst u de afdekking op de monsterlade en laat u het deksel naar het incubatiecompartiment zakken. Het is belangrijk om te controleren of de warmteoverdrachtsvloeistof zich boven het minimale vulniveau bevindt.Indien dit niet het geval is, voeg dan meer warmteoverdrachtsvloeistof toe met een 1000 µL pipet. Gebruik de bio screen software Easy experiment. Stel de volgende parameters in om geschikte groeicurves voor croce visi te verkrijgen. Voer bij het aantal monsters het aantal wells met medium of 200 in; stel het filter in op een bandbreedte van 420 tot 580 nm.Stel de temperatuur in op 30 °C. De duur van het experiment moet één dag, nul uur en nul seconden zijn. Het meetinterval moet 30 minuten zijn.Stel tot slot het schudden in op continu schudden en klik op 'start' bij 'high' om de metingen te beginnen. Verkrijg de uitvoerbestanden van het BioScreen CMBR-apparaat. De software van het experiment genereert de BioScreen-gegevens als een tab-gescheiden bestand dat compatibel is met Microsoft Excel en andere software.De eerste kolom, kolom A, toont het tijdstip waarop de OD-meting tijdens het experiment is uitgevoerd. De volgende kolommen vertegenwoordigen elke well in de bio screen honeycomb-platen die zijn geïnoculeerd met cellen uit de verouderende culturen. Verwijder de eerste OD-meting uit elke kolom, aangezien deze meting ruis is.Normaliseer de gegevens door de optische dichtheidswaarde van het putje met alleen YEPD af te trekken van de optische dichtheidswaarden in elke kolom. Hiermee wordt de achtergrondabsorbentie door het medium verwijderd. De uitgroeicurven.De curven zullen verschuiven als functie van de leeftijd; wanneer bijvoorbeeld de uitgroeicurven van kolom één, putje één van de honingraatplaat over de zes tijdspunten worden uitgezet, is er een duidelijke verschuiving van de curven naar rechts over de tijd waarneembaar. De tijdsduur tussen het eerste tijdspunt, dag twee, en een opeenvolgend tijdspunt bepaalt de levensvatbaarheid op die specifieke leeftijd. Bereken de verdubbelingstijd voor elk putje op basis van de groeikinetiek van het tijdspunt op dag twee.De vergelijking die wordt gebruikt om de verdubbelingstijd te berekenen ziet er als volgt uit, waarbij OD één en OD twee opeenvolgende metingen van de optische dichtheid vertegenwoordigen en T één en T twee de tijd tussen de metingen zijn. Bereken de verdubbelingstijden alleen tussen OD-waarden van 0,2 en 0,5. Het gemiddelde van deze waarden is de verdubbelingstijd voor dat monster.De meeste wildtype giststammen zouden voor elk tijdspunt een verdubbelingstijd moeten vertonen tussen de 85 en 90 minuten. Bereken de tijdsverschuiving delta T in de uitgroeicurves ten opzichte van het beginpunt, namelijk dag twee. Een eenvoudige manier om dit te doen is door het verschil te bepalen in de tijd die elke well nodig had om een OD van 0,3 te bereiken tussen het beginpunt en elk daaropvolgend tijdspunt.De tijd waarop een specifieke well een OD van 0,3 bereikte, kan worden berekend met de lineaire regressievergelijking die overeenkomt met de natuurlijke logaritme van de optische dichtheid. Bereken de overlevingsfractie voor elk tijdspunt om een overlevingscurve te genereren, waarbij het initiële tijdspunt op dag twee 100% levensvatbaarheid vertegenwoordigt voor elk opeenvolgend tijdspunt. Bereken het overlevingspercentage met behulp van de volgende vergelijking.Waarbij SN het overlevingspercentage is. Delta TN is de tijdsverschuiving en Sigma N is de verdubbelingstijd. Genereer naar behoefte overlevingscurves voor elk van deze.Bereken vervolgens voor elke well het overlevingsintegraal door de fractie levensvatbare cellen uit te zetten als functie van de leeftijd. De SI wordt gedefinieerd als de oppervlakte onder de overlevingscurve en kan worden geschat met deze formule, waarbij leeftijd N het leeftijdspunt is en SN de bijbehorende overlevingswaarde op dat leeftijdspunt. Bepaal de statistische parameters van de herhaalde wells op basis van de SI- en overlevingsgegevens. Veelvoorkomende statistische parameters van belang zijn het gemiddelde, de mediaan en de variantie voor elke set biologische replica's. Een T-toets of een soortgelijke analyse kan worden gebruikt voor de paarsgewijze vergelijking van de SI voor verschillende experimentele groepen en controlegroepen.Het kan daarnaast wenselijk zijn om overlevingscurven te genereren op basis van gemiddelden van biologische replica's. Na voltooiing van het experiment heeft u de overlevingscurve uitgezet en voldoende data-analyse uitgevoerd om het chronologische verouderingspotentieel voor verschillende stammen of condities te bepalen. Indien correct uitgevoerd, zouden de groeicurven verkregen met de bio screen CMBR-machine vergelijkbaar moeten zijn met deze curve. Over het algemeen zullen wild-type cellen die gekweekt zijn onder de hier beschreven condities een mediane chronologische levensduur hebben van ongeveer zeven dagen.Er wordt aanzienlijke variatie in overleving waargenomen in verschillende stammen en onder bepaalde omstandigheden; zo kan de mediane overleving bij groei in media met 0,05% Glucose 30 dagen overschrijden. We hebben u zojuist een high-throughput methode getoond voor het kwantitatief bepalen van de chronologische levensduur van de gist. Croce visier.Het is belangrijk om te onthouden dat bij het uitvoeren van deze procedure het routinematig onderhoud van de bio screen CMBR-machine essentieel is voor zowel de reproduceerbaarheid van de gegevens als de nauwkeurigheid. Dat is alles. Veel succes met uw experimenten.

quantifying-yeast-chronological-life-span-by-outgrowth-of-aged-cells

Research

JoVE Journal

Biology

Biologie

In dit artikel geven we een algemeen protocol voor het meten van de replicatieve levensduur van gist moeder cellen.

Het meten van replicatieve levensduur in de gist

Hier beschrijven we een set van DNA-mutatie assays die kunnen worden gecombineerd met de gist chronologische levensduur model om de genen / paden die reguleren of bijdragen aan de genomische DNA instabiliteit tijdens Aging Study.

Studeren Age-afhankelijke genomische instabiliteit met behulp van de S. cerevisiae Chronologische levensduur Model

We beschrijven hier de werking van een microfluïdische apparaat dat continue en hoge-resolutie microscopische beeldvorming van enkele ontluikende gistcellen kunnen gedurende hun volledige replicatie en / of chronologische levensduur.

Continue hoge-resolutie Microscopische waarneming van Replicatieve Aging in Budding gist

Mutatie tarieven bij jonge Saccharomyces cerevisiae cellen gemeten door fluctuatie tests worden gebruikt om mutatie frequenties voorspellen voor moeder cellen van verschillende replicative leeftijden. Magnetische sortering en flow cytometrie worden vervolgens gebruikt om de feitelijke mutatie frequenties en leeftijd van moedercellen meten afwijkingen identificeren voorspelde mutatiefrequentie.

De combinatie van magnetische sorteren van Moeder Cellen en Schommelingen Tests om Genome Instabiliteit Tijdens mitose Aging in Analyze Saccharomyces cerevisiae

Dit artikel een protocol geoptimaliseerd voor het vervaardigen van microfluïdische chips en de opstelling van microfluïdische experimenten om de levensduur en cellulaire fenotypen van afzonderlijke gistcellen te meten.

Met behulp van microfluïdische apparaten te meten Levensduur en Cellulaire Phenotypes in Single Budding gistcellen

Wij presenteren een methode voor het kwantificeren van groeifenotypes van individuele gistcellen, aangezien zij groeien in kolonies op vaste media met behulp van tijdlapse microscopie, één-celdubbelevaluatie van levende arrays van gist (ODELAY). Bevolkings heterogeniteit van genetisch identieke cellen die in kolonies groeien, kunnen direct worden waargenomen en gekwantificeerd.

ODELAY: Een grootschalige methode voor multiparameter kwantificering van gistgroei

Hier presenteren we een protocol voor het inschatten van de Ademhalings- en fermenterende metabolisme door het aanbrengen van de exponentiële groei van Saccharomyces cerevisiae voor de vergelijking van exponentiële groei. Berekening van de kinetische parameters zorgt voor de screening van invloeden van stoffen/verbindingen op gisting of mitochondriaal ademhaling.

Saccharomyces cerevisiae Exponentiële groei kinetiek in Batch cultuur voor het analyseren van de Ademhalings- en fermenterende metabolisme

Hier presenteren we een MATLAB implementatie van geautomatiseerde detectie en kwantitatieve beschrijving van lipide druppeltjes in fluorescentiemicroscopie beelden van splijting en ontluikende gistcellen.

Analyse van de hoeveelheid lipide druppel in splijting en ontluikende gisten met behulp van geautomatiseerde beeldverwerking

Hier is een protocol om genetische interacties te identificeren door middel van een verhoogde kopie nummer suppressor scherm in Saccharomyces cerevisiae. Deze methode stelt onderzoekers in staat om te identificeren, klonen, en testen suppressors in kortstondige gist mutanten. We testen het effect van de toename van het kopieeraantal van SIR2 op de levensduur in een autofagie null mutant.

Een suppressor scherm voor de karakterisering van genetische links reguleren chronologische levensduur in Saccharomyces cerevisiae

In dit artikel geven we een algemeen protocol voor het meten van de levensduur van nematoden gehouden op vaste media met UV-gedode bacteriën voedsel.

Het meten van Caenorhabditis elegans Levensduur over Solid Media

Leer een high-throughput methode om de chronologische levensduur van gist te kwantificeren door uitgroei van verouderde cellen. Deze techniek meet celviabiliteit over tijd in stationaire fase.

Kwantificeren van Gist Chronologisch Life Span door uitgroei van Aged cellen

Meer video's verkennen