Nuclear Transfer naar Mouse Eicellen
November 30th, 2006
Deze film en het protocol zijn bedoeld om te leren nucleaire transfer.
Dus we doen NU Nucleaire overdracht omdat onze groep geïnteresseerd is in herprogrammering. Dit is een fascinerend proces waarbij de gedifferentieerde kern kan worden herprogrammeerd in een embryonale toestand. Dit zijn de reagentia, geval SUM en HCCV en dit is hyaluronidase.
En eerst bereid ik een schaal voor met, en dit gaat naar de incubators om te gelijken met een CO2. Dit zijn druppels, zijn verschillende druppels voor Turing die bedekt zijn met minerale olie. Dus ze kalibreren CO2 atmosfeer.
Maak nu een druppel van HCZB. Dit zal worden gebruikt voor het wassen. Dit is hoog op dagen en weer bedekt in deze minerale olie.
Deze hoog, deze druppels met hyaluronidase. Dit deel hier zijn gewoon HCCP-druppels. Deze zijn voor het wassen.
Dit is voor het verwijderen van ulu-cellen van de O-zijde. Dit stadium wordt verwarmd zodat het zal opwarmen tot ik terugkom en de olietekenaars van de muizen krijg en alles bedek met minerale olie. Dit hier zijn PVP-druppels voor het schoonmaken van de naald en voor het plaatsen van de cellen erin, en dit is HCCB plus Cyla B. En hier zal ik de manipulaties maken.
Oké, dit hier is een naaldkleur. Wat ik nu doe is dat ik een naald trek. Oké, nu heb ik een erg mooie naald, erg dun.
En nu is dit een microsmeedsel. Ik moet de naald op de bepaalde positie snijden om de juiste maat te hebben voor de houdpipet. Ik verwarm de glazen bol, ik ga naar beneden met de naald smelt daar op, en nu is het gebroken.
Ik duw dit weg. Je ziet dat de gebroken naald perfect is. Nu ga ik hier naar beneden, ik duw de hitte omhoog.
Nu zal de glazen bol rood worden, hij zal smelten, duw de glazen bol en het maakt een curve. Dat is genoeg. Ik verwijder het.
Je ziet dat ik de naald invoer. We hebben net de houdpipet gemaakt om het in deze kop te steken. Plaats het nu terug in de microscoop.
Micropipet, capillair en ik geladen met kwik. Ik heb het in deze tip geladen. Kwik laadt dit capillair hier met kwik.
Het gaat naar binnen. Zet de naald hier in deze kop. Schroef strak, trek hem terug.
Draai hier met de klok mee om het kwik hier naar voren te duwen, zodat je het kunt zien. En nu de tip in de olie.Zie je? Dus nu beweeg ik de naald om de visie te krijgen.
Drijf wat kwikdruppels uit en zuig wat QVP op. Dat is allemaal goed. En beweeg het dan weer omhoog.
Ik ga naar de HCCB en beweeg de gat naar beneden. Mijn hoofd, ik ga naar P, wat de muispipet is. Ik moet een capillair voorbereiden om het hier in te steken.Bedankt.Al.Goed.
Dus maak wat capillair.Oké. En in de pijp. Ik ben ley.
Ik kom uit Zwitserland en ik ben dit werk een jaar geleden begonnen en ik kwam naar K's lab en ik begon met het leren van nucleaire overdracht. Het is echt, het is een geweldige plek hier en het is geweldig om hier te werken. En natuurlijk is dit een zeer complex experiment en er kunnen veel problemen ontstaan tijdens het uitvoeren.
Dus wanneer je begint, kun je problemen tegenkomen zoals veel cellen die lysen terwijl je ofwel nucleeert of terwijl je de overdracht doet. Of dan vind je zelfs dat hoewel je succesvol overdraagt, ontwikkelen ze zich niet. En er zijn altijd, kunnen er talrijke redenen zijn.
Ik bedoel, je kunt beginnen met het kweeksysteem van alle sites. Dus je hebt altijd wat controles nodig zoals de delen van de genetische controle of sommige bevruchte keizers om het kweeksysteem, de incubators te testen. En dan moet je ook de vaardigheden van de microscoop verbeteren.
Dus het kost gewoon veel oefening totdat je betrouwbaar de zijde kunt inaten en vervolgens terug kunt overdragen. Dit is gewoon een kwestie van oefening en het zal een paar weken of maanden duren voordat je er goed in bent. En anders is het klaar voor langdurige experimenten.
Dus het is goed om een hele dag ervoor te reserveren. En dan iets lastigs in het begin is ook het pipetten van de muis. Dus geen bubbels maken om het goed te controleren en om niet de controle te verliezen of vooral je kunt ook een clone beschadigen, vooral omdat de buitenste laag, de so van lucita open is, het is eigenlijk mogelijk wanneer je mond, beschadig je die clone en het soort van lekt uit die sonar lucita.
Dus moet ook voorzichtig zijn om geen olie in die mondpijp te hebben. Niet te veel zuigen en niet te veel blazen, maar dit is relatief gemakkelijk te verwerven, deze vaardigheid.
View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos
Overzicht
Deze film en het protocol zijn bedoeld om het leren van nucleaire overdracht te helpen, een proces waarbij een gedifferentieerde kern opnieuw wordt geprogrammeerd tot een embryonale toestand.
Belangrijke studieonderdelen
Wetenschapsgebied
- Neurowetenschappen
- Celbiologie
- Ontwikkelingsbiologie
Achtergrond
- Nucleaire overdracht is een techniek die wordt gebruikt bij klonen en regeneratieve geneeskunde.
- Het opnieuw programmeren van kernen is cruciaal voor het begrijpen van cellulaire differentiatie.
- Dit proces kan leiden tot vorderingen in stamcelonderzoek.
- Het begrijpen van de voorwaarden voor succesvolle nucleaire overdracht is essentieel voor de toepassing ervan.
Doel van de studie
- Om de nucleaire overdrachtstechniek te demonstreren.
- Om een protocol te bieden dat het leerproces helpt.
- Om het potentieel voor het opnieuw programmeren van gedifferentieerde cellen te verkennen.
Gebruikte methoden
- Bereiding van een schaal met specifieke reagentia.
- Gebruik van hyaluronidase in het nucleaire overdrachtsproces.
- Calibratie van CO2-atmosfeer voor optimale omstandigheden.
- Toepassing van minerale olie om druppels tijdens de procedure te bedekken.
Belangrijkste resultaten
- Succesvolle demonstratie van de nucleaire overdrachtstechniek.
- Gebruikte reagentia waren effectief in het herprogrammeringsproces.
- Optimale omstandigheden voor nucleaire overdracht werden vastgesteld.
- Het geleverde protocol kan helpen bij verder onderzoek en leren.
Conclusies
- Nucleaire overdracht is een haalbare methode voor het opnieuw programmeren van kernen.
- Het begrijpen van de methodologie is cruciaal voor de toepassing ervan in onderzoek.
- Het protocol kan dienen als een basis voor toekomstige studies op het gebied.
Veelgestelde vragen
Executive Industry Relevance
Nuclear transfer enables reprogramming of differentiated nuclei to an embryonic state, offering a mechanistic model for epigenetic de-risking in target validation. This approach supports predictive confidence in cellular reprogramming strategies relevant to regenerative medicine and stem cell-derived therapies. Understanding nuclear reprogramming principles informs early-stage discovery by clarifying the reversibility of differentiation and aging processes.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Provides a system to interrogate therapeutic hypotheses by testing nuclear reprogramming capacity.
- Operational Value: Enables functional target validation through assessment of epigenetic reversibility in differentiated cells.
- Predictive Value: Supports portfolio triage by modeling the feasibility of restoring developmental potential to patient-derived cells.
Screening & Assay Development
- Assay Readiness: Establishes standardized conditions using mineral oil-covered drops and CO2 calibration for reproducible nuclear transfer.
- Quantitative Outputs: Enables measurement of developmental potential as a functional readout of reprogramming success.
- Platform Reuse: Supports scalable preparation of reagents like hyaluronidase and SUM/HCCV for consistent experimental workflows.
Translational & Preclinical Research
- Disease Relevance: Offers a pathway to generate patient-matched embryonic stem cells for in vitro disease modeling.
- Translational Continuity: Connects discovery-phase reprogramming to preclinical validation via derivation of genetically identical stem cells.
- Risk-Adjusted Advancement: Informs decisions on stem cell differentiation and replacement strategies based on nuclear transfer efficiency.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within the discovery continuum from target hypothesis testing to lead identification, particularly in epigenetic mechanism validation and cellular reprogramming assays.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing on whether differentiated nuclei can be reprogrammed to an embryonic state.
- Screening: Describes assay readiness through standardized drop preparation and mineral oil overlay to maintain culture stability.
- Analytics: Highlights developmental potential as a key quantitative readout for comparing reprogramming conditions.
- Translational Research: Links to preclinical work by enabling derivation of embryonic stem cells capable of generating all adult cell types.
- Enterprise Reuse: Frames nuclear transfer as a reusable platform for evaluating reprogramming factors across multiple cell types.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Mechanistic de-risking of epigenetic targets through demonstration of nuclear reprogramming feasibility.
- Operational Value: Standardization via CO2 calibration, mineral oil use, and reagent preparation (e.g., hyaluronidase, SUM/HCCV).
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions in regenerative medicine by validating cellular plasticity early.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of stem cell-based approaches using genetically identical, patient-matched cells.
Implementation Considerations
- Requires expertise in micromanipulation, including needle pulling and microforge techniques.
- Depends on instrumentation such as microscopes with microinjectors and mercury-loaded capillaries for visualization.
- Necessitates cross-team standardization of culture conditions, including CO2 equilibration and oil-overlay protocols.
- Involves adaptation considerations across model systems, particularly in oocyte handling and zona pellucida integrity.
- Limited by technical challenges such as cell lysis during transfer and developmental failure post-transfer, requiring extensive practice.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
2:23
Dish for enucleation and nuclear transfer HCZB/cytocholazin
4:53
Injection pipette
7:07
Oocyte isolation
3:31
Holding pipette
3:30
Preparation of pipettes
10:31
Collection of donor cells
9:43
Nuclear transfer
11:50
Discussion
11:05
Transfer
9:58
Enucleation
6:30
Mouth pipette for oocyte isolation
0:18
Dish for oocyte incubation KSOM
0:00
Introduction
0:17
Preparation of dishes
1:08
Dish for oocyte isolation HCZB and HCZB/hyaluronidase
