Name: Nuclear Transfer naar Mouse Eicellen (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2006-11-30T00:00:00.000+00:00
Duration: 14 min 17 s
Description: Leer de nucleaire transfertechniek voor het reprogrammeren van gedifferentieerde kernen naar een embryonale toestand met muizeicellen. Deze methode ondersteunt onderzoek naar stamcelbiologie en regeneratieve geneeskunde.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

DE zou graag Dr Hide Akutsu bedanken voor het delen van zijn NT trucs en dr. Stephen Sullivan en Garrett Birkhoff voor de kritische lezing van het protocol.

Voorbereidingen: <ol><li class="jove_step"> Een gedetailleerde beschrijving van superovulatie en MicroDrop embryo cultuur kunnen elders 2 te vinden. </li><li class="jove_step"> Bereid een petrischaal met microdruppels van embryo cultuur medium (bijv. KSOM, Chemicon). Dek af met minerale olie (minerale olie batches moet worden getest op compatibiliteit met embryo cultuur). Evenwicht bij 37 ° C in de lucht, vermeerderd met 5% CO 2. (In Thermo Electron-3110 watermantel incubator of gelijkwaardig) </li><li class="jove_step"> Bereiden een gerecht voor de isolatie van eicellen: Plaats druppels HEPES-gebufferde CZB en hyaluronidase (0,1% w / v, Sigma) in een helft van de schotel en HCZB in de andere helft. Dek af met minerale olie. Hou de schotel warm op een verwarmde stadium van een dissectie microscoop. </li><li class="jove_step"> Bereid de microscoop: Plaats een holding pipet van een buitendiameter van ongeveer 50 μ m (iets kleiner dan de diameter van de eicel) en een opening van ongeveer 20 μ m in een pipet houder. Holding pipetten zijn makkelijk te maken met de nodige apparatuur, een naald trekker (Sutter Instruments) en een microforge (Narishige), maar ze kunnen ook worden gekocht bij Humagen. Laad 3-5 μ l kwik in de staart van een micropipet (inwendige diameter 8 μ m). Voorkomen dat kwik morsen. Bereid een schotel met verschillende kleine druppels elk van de 11% w / v PVP (polyvinylpyrrolidon) in HCZB en 5 μ g / ml cytochalasine B in HCZB. Gebruik het deksel van een petrischaal in plaats van de schotel zelf als het deksel heeft een korte rand die niet interfereren met de beweging van het bedrijf en de enucleatie pipetten. Lijn de holding pipet en de enucleatie pipet in een HCZB drop. Aspireren een beetje HZCB in de punt van de holding pipet. </li><li class="jove_step"> Voorbereiding van de donor cellen hangt grotendeels af van het celtype en het experiment de onderzoeker voornemens is te verrichten. In het algemeen moet donor cellen worden behandeld met een proteolytisch enzym, zoals trypsine en bewaard op ijs om kleverigheid te verminderen tot overdracht. </li><li class="jove_step"> Humaan euthanaseren muizen 14-15 uur na de toediening van hCG. Oogst eileiders en ontleden ze in de warme HCZB-hyaluronidase druppels. Na ca.. 5 min, zullen eicellen worden meestal vrij van cumulus cellen. Ze moeten dan enkele malen gewassen in HCZB, dan verder gewassen in de pre-evenwicht KSOM drops, en bewaard in de couveuse tot enucleatie. </li></ol> Enucleatie Manipulaties worden uitgevoerd met hydraulische micromanipulators, (Narishige) op een omgekeerde microscoop, zoals de Nikon TE200. Een piezo micromanipulator (Primetech) wordt gebruikt voor het boren van de zona pellucida. Platte enucleatie en overdracht pipetten zijn verkrijgbaar bij Humagen. Reinig en smeer de enucleatie pipet in de PVP daalt verdrijven microscopisch kwik druppels en door het opzuigen en verdrijven PVP. Om te voorkomen dat kleverigheid van de naald, moet dezelfde procedure worden gedaan tussen elke groep van eicellen die ofwel enucleated of overgedragen. Plaats een kleine groep van eicellen in de HCZB-cytochalasine B drop. De grootte van de groep moet worden aangepast aan het niveau van de ervaring van de onderzoeker. Eicellen mogen niet worden bewaard op het podium langer dan 20-30 min. Verplaats de instrumenten om de HCZB-cytochalasine B daalt. De holding pipet en de enucleatie pipet moet worden gebracht in lijn met het equatoriale vlak van de eicel. Dit wordt mogelijk als de holding pipet heeft een buitendiameter die iets kleiner is dan de eicel zelf. Draai een eicel tot aan de verschillend refractieve metafase spindel kan worden gezien. Als een beginner niet kan zien van de as, kan de metafase plaat worden geïdentificeerd met behulp van de DNA-kleurstof Hoechst en UV-verlichting, echter, die niet compatibel is met efficiënte embryonale ontwikkeling. Plaats de metafase spindel bij drie en goed houd het met het bedrijf pipet. Van toepassing zijn piëzo pulsen aan de zona pellucida te dringen. Raak de metafase plaat met de enucleatie pipet. Zodra de weerstand van de metafase spindel kan &#39;gevoeld&#39;, zuigen de spindel en trek de naald. De eicel cytoplasma vloeistof is, de metafase spindel beweegt echter wel als een groepje bij aanraking met de pipet. Probeer om de hoeveelheid cytoplasma dat is verwijderd met de spindel te verminderen. Na een groep van eicellen is enucleated, was ze door middel van embryo kweekmedium en plaats ze in de couveuse tot overdracht. Sommige enucleated eicellen mogen niet worden overgedragen, maar moeten worden geactiveerd en dienen als een controle voor enucleatie. Deze eicellen zullen fragment binnen enkele uren, wat aangeeft succesvol enucleatie. Kerntransfer Plaats cellen in PVP-oplossing (11% PVP in HCZB). Als er veel klonen arrestatie aan de een-cellig stadium, moet de PVP concentratie worden verlaagd tot 5% of minder. Meng cellen goed with PVP. Pick-up cellen met een pipet met een inwendige diameter van iets kleiner dan de diameter van de cel. Het membraan van de cel zou moeten breken op aspiratie. In sommige gevallen kunnen herhaalde verdrijven en aspiratie, alsmede de toepassing van zachte piëzo-pulsen worden gebruikt om de donor cel te breken. Een nieuwe daling van de donor-cellen moeten worden gemaakt met elke groep van eicellen worden overgedragen, als donor cellen kleverig na verloop van tijd. Injecteer de gebroken donorcel kort na het breken van de membraan. Voor de overdracht, richten zich op het equatoriale vlak van de eicel zelf in plaats van het equatoriale vlak van de zona pellucida, en plaats de overdracht en de holding pipet in hetzelfde vlak. Houd de eicel, waaronder een deel van zijn cytoplasma stevig. Dringen in de zona pellucida met behulp van piëzo-pulsen. Breng de donor kern aan het uiteinde van de pipet, druk dan op de pipettip bijna aan de andere kant van de enucleated eicel, dicht bij het bedrijf pipet, het maken van een diepe groef in de eicel. Aspireren een zeer kleine hoeveelheid van de eicel cytoplasma in de pipet, breng dan een enkele zwakke piezo impuls naar de eicel membraan te breken, verwijdert u de donorkern, snel terugtrekken van de naald, terwijl aspireren in de cytoplasmatische membraan aan de rechterkant van de groef. Door het gelijktijdig intrekking van de naald en het aanzuigen, moet het mogelijk zijn om het gat achtergelaten door NT te sluiten. Dit &#39;gat verwijderen van techniek zal het aantal eicellen dat lyse tijdens de NT. Was de gereconstrueerde eicellen in KSOM en stuur ze terug naar de incubator gedurende 1-3 uur. Eicelactivatie Bereid een helft van een schotel met druppels van calcium vrij MCZB en de andere helft met druppels van calcium vrij MCZB plus 10 mM Sr 2 + en 5 μ g / ml cytochalasine B naar polaire lichaam extrusie remmen. Equilibreren gedurende 30 minuten. onder de 5% CO 2 in de lucht. Goed wassen NT embryo&#39;s in calcium-vrije MCZB en deze vervolgens plaats in kleine groepen in verschillende druppels van calcium-vrije MCZB. Zet de schotel naar de incubator en cultuur voor 5-6 uur. Om te controleren voor de kunstmatige activering protocol en voor embryo kweekomstandigheden, moeten niet-enucleated eicellen worden gebruikt. Zij zullen ontwikkelen als parthenogenetische embryo&#39;s. Na activering, was de embryo&#39;s door middel van KSOM en plaats embryo&#39;s in de incubator voor de lange termijn cultuur. Pronuclei moet duidelijk zichtbaar zijn op dit tijdstip, met vermelding van een succesvolle overdracht. Embryo Cultuur Media Cookbook Master Zouten Begin met 980 ml ​​ultrapuur H 2 O in steriele 1 L fles Voeg droge componenten: NaCl 4760 mg (81mm) Sigma S-5886 KCl 360 mg (5mm) Sigma P-5405 MgSO 4 • 7H 2 O 290 mg (1.18mM) Sigma M-2773 KH 2 PO 4 160 mg (1.17mM) Sigma P-5655 EDTA 2Na 40 mg (0,1 mm) Sigma E-6635 Glucose (D) 1000 mg (5,5 mm) Sigma G-6152 Voeg liquide componenten Na-lactaat (melkzuur) 5,3 ml &amp; nbsp; Sigma 44263 Pen&#39;Strep 10 mL Gibco 15140-122 Voor MCZB Stock Zouten: Filter steriliseren 500 ml meester zouten (goed voor 3-4 maanden; bewaren bij 4 ° C) Voor HCZB Stock Zouten: Begin met 500 ml meester zouten Voeg 50 mg PVA (koud oplosbaar; Sigma P-8136) Roer voor de 30-60 min en steriele filter (goed voor 3 maanden; bewaren bij 4 ° C) Ca + + Gratis MCZB (voor de eicellen activering in 5% CO 2) Begin met 99 ml MCZB voorraad zouten Voeg droge componenten: NaHCO 3 211 mg Sigma S-5761 Na-pyruvaat (pyrodruivenzuur) 3 mg Sigma P-4562 L-Glutamine 15mg Sigma G-8540 Bovine serum albumine (BSA) 500 mg Sigma A-3311 Zwenken totdat alle componenten zijn opgelost; steriel filter. HCZB (voor micromanipulatie in omgevingslucht) Begin met 99 ml HCZB voorraad zouten Voeg droge componenten: Hepes-Na 520 mg Sigma H-3784 NaHCO 3 42 mg Sigma S-5761 Voeg liquide componenten: 128 mM CaCl 2 (18.8g / l) 1 ml Sigma C-7902 Pas de pH op 7,5 met 1 N HCl Swirl totdat het is opgelost; steriel filter.

<ol><li>Eggan, K., Jaenisch, R. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aEggan%2C+K+%22Mammalian+and+Avian+Transgenesis-+New+Approaches%22">Mammalian and Avian Transgenesis- New Approaches</a>. Pease, S., Lois, C. , Springer. (2006).</li>
<li>Nagy, A., Gertsenstein, M., Vintersten, K., Behringer, R. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aNagy%2C+A+%22Manipulating+the+mouse+embryo%22">Manipulating the mouse embryo</a>. Press, C. S. H. L. , (2003).</li>
<li>Wakayama, T., Perry, A. C., Zuccotti, M., Johnson, K. R., Yanagimachi, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Full-term+development+of+mice+from+enucleated+oocytes+injected+with+cumulus+cell+nuclei%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Full-term development of mice from enucleated oocytes injected with cumulus cell nuclei.</a> Nature. 394, 369-374 (1998).</li>
</ol>

De auteurs hebben niets te melden.

Neem contact op voor extra buffers composities in het protocol wordt een deel.

nuclear transfer naar mouse eicellen

Nuclear Transfer into Mouse Oocytes

Kernenergie te zetten in een onbevruchte eicel kan herstellen ontwikkelingsstoornissen potentieel om een ​​gedifferentieerde cel. Dit toont aan dat de processen die ten grondslag liggen ontwikkeling, differentiatie en veroudering zijn epigenetische in plaats van genetische processen. De omkeerbaarheid van deze processen opent opwindende perspectieven in fundamenteel onderzoek, en in de verdere toekomst, in de regeneratieve geneeskunde. In de muis, kunnen embryonale stamcellen worden afgeleid uit gekloonde embryo&#39;s pre-implantatie fase. Dergelijke embryonale stamcellen hebben het vermogen om aanleiding te geven tot alle celtypes van het volwassen organisme. Belangrijk is dat deze cellen zijn genetisch identiek aan de donor. Indien van toepassing op de mens, zou dit mogelijk de winning van stamcellen uit een patiënt. Deze cellen kunnen vervolgens worden onderverdeeld in de getroffen celtype van de patiënt en bestudeerd in vitro, of worden gebruikt om de beschadigde of ontbrekende cellen te vervangen. De studie van nucleaire transfer in de muis blijft belangrijk want het kan ons informeren over de principes van de nucleaire herprogrammering. Deze film en de bijbehorende protocol zijn bedoeld om het leren nucleaire transfer in de muis, een methode in eerste instantie ontwikkeld in de groep van prof. dr. Yanagimachi (Wakayama et al.. 1998).

Deze film en het protocol zijn bedoeld om te leren nucleaire transfer.

Nuclear Transfer naar Mouse Eicellen

Kernoverdracht in een onbevruchte oöcyt kan het ontwikkelingspotentieel van een gedifferentieerde cel herstellen. Dit demonstreert dat de processen die ten grond liggen aan ...

We voeren kernoverdracht (NU) uit omdat onze groep geïnteresseerd is in herprogrammering. Dit is een fascinerend proces waarbij de gedifferentieerde kern kan worden hergeprogrammeerd naar een embryonale staat. Dit zijn de reagentia case SUM en HCCV en dit is hyaluronidase.Ten eerste bereid ik een schaal voor, die naar de incubators gaat om te equilibreren met CO2. Dit zijn druppels, verschillende druppels voor Turing die bedekt zijn met minerale olie. Zo kalibreren zij de CO2-atmosfeer.Maak nu een druppel HCZB. Deze zal worden gebruikt voor het wassen. Deze wordt gedurende meerdere dagen bewaard en opnieuw bedekt met deze minerale olie.Dit is hoog, dit daalt met hyaluronidase. Dit deel hier zijn gewoon HCCP-druppels. Deze zijn voor het wassen.Dit is bedoeld voor het verwijderen van ulu-cellen van de O-zijde. Deze plaat wordt verwarmd, zodat deze warm blijft totdat ik terugkom om de olie-tekens van de muizen te halen en alles te bedekken met minerale olie. Hier zijn PVP-druppels voor het reinigen van de naald en om de cellen in te plaatsen, en dit is HCCB plus Cyla B. En hier zal ik de manipulaties uitvoeren.Oké, dit is een naaldhouder. Wat ik nu doe, is een naald trekken. Oké, nu h

Research

JoVE Journal

Biology

Biologie

We zien hier dat epigenetische herprogrammering via Somatic Cell Nuclear Transfer (SCNT) kan worden gebruikt als een instrument om muismodellen te genereren met een vooraf bepaalde T-cel receptor (TCR) specifieke kenmerken. Deze transnuclear muizen drukken de overeenkomstige TCR uit hun endogene locus onder de controle van de endogene promotor.

Transnuclear Muizen met vooraf gedefinieerde T-cel-receptor Bijzonderheden tegen Toxoplasma gondii Verkregen via SCNT

Eicellen zijn gevoelig voor te wijten aan fouten in chromosoom segregatie aneuploïdie tijdens de meiotische rijping. Aneuploïde eieren kan leiden tot onvruchtbaarheid, miskramen of ontwikkelingsstoornissen, zoals het syndroom van Down. Hier beschrijven we methoden om materialen van keuze te introduceren in eicellen en methoden om meiotische rijping onderzoeken en te beoordelen ploïdie.

Eicel muis micro-injectie, rijping en ploïdie Assessment

This video describes the pronuclear injection of lentiviral vectors into the perivitelline space of a fertilized mouse embryo. The lentivirus contains the transgene, which is incorporated into the genome of the fertilized embryo, eventually giving rise to transgenic mice.

Lentiviral Vector-Based Perivitelline Injection: A Method to Transduce the Gene of Interest Into Fertilized Single-Cell Mouse Oocytes

Hier presenteren we een protocol voor de karakterisering van muis antral eicellen gebaseerd op nucleolair organisatie.

Isolatie en karakterisering van de Muis Antral Eicellen Gebaseerd op Hergroepering van nucleoli chromatine Organization

We beschrijven een dramatisch verbeterde methode voor het klonen van de muis met trichostatin A, vitamine C en gedeïoniseerd bovien serumalbumine. Laten we een vereenvoudigde, reproduceerbare protocol dat efficiënte ontwikkeling van gekloonde embryo's wordt ondersteund. Vandaar, zou deze methode worden een gestandaardiseerde procedure voor het klonen van de muis.

Combinatorische behandelingvan Trichostatin A en vitamine C verbetert de Efficiency van het klonen van muizen door overdracht van de somatische cel

Als de genetische varianten die zijn gekoppeld aan ziekten bij de mens begint te worden blootgelegd, wordt het steeds belangrijker systemen waarmee snel evalueren de biologische betekenis van deze geïdentificeerde varianten te ontwikkelen. Dit protocol wordt beschreven methoden voor de evaluatie van menselijke genfunctie tijdens vrouwelijke meiose ik met behulp van de muis eicellen.

Met behulp van de muis eicellen te beoordelen van menselijke genfunctie tijdens de meiose I

Er wordt een geoptimaliseerd protocol gepresenteerd dat de uitputting van cytoplasmatische microtubuli organiserende centra in muizenoöcyten tijdens metafase I mogelijk maakt met behulp van een nabij-infrarode femtosecondelaser.

Multi-foton laserablatie van cytoplasmatische microtubule organiserende centra in muizenoöcyten

Fout in chromosoomsegregatie is een veel voorkomend kenmerk in eicellen. Daarom geeft het bestuderen van het controlepunt voor de spindelassemblage belangrijke aanwijzingen over de mechanismen die nodig zijn om gezonde eieren te produceren. Het huidige protocol beschrijft drie complementaire testen om de integriteit van het controlepunt van de spindelassemblage in muizenoöcyten te evalueren.

Evaluatie van de integriteit van het spindelassemblagecontrolepunt in muizenoöcyten

Dit protocol biedt een experimenteel kader om de fysieke impact van het cytoskelet op de nucleaire vorm en de interne membraanloze organellen in het eicelsysteem van muizen te documenteren. Het raamwerk kan worden aangepast voor gebruik in andere celtypen en contexten.

Het vastleggen van op cytoskelet gebaseerde agitatie van de eicelkern van muizen op ruimtelijke schalen

Dit protocol laat de techniek voor de extractie van eicellen of een vroeg stadium bevrucht embryo uit de eileider van muizen. De mogelijkheid om de infindibulum identificeren en steek een stomp uiteinde naald in is het essentieel om de juiste uitvoering van de procedure.

Ophalen van Muis Eicellen

Leer de nucleaire transfertechniek voor het reprogrammeren van gedifferentieerde kernen naar een embryonale toestand met muizeicellen. Deze methode ondersteunt onderzoek naar stamcelbiologie en regeneratieve geneeskunde.

Nuclear Transfer naar Mouse Eicellen

Meer video's verkennen