Name: Een Neuronale en astrocyte co-cultuur assay voor High Content Analysis van neurotoxiciteit (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2009-05-05T00:00:00.000+00:00
Duration: 15 min 4 s
Description: Leer een gevoelige methode voor neurotoxiciteitsanalyse met neuron-astrocyt co-culturen en high content screening. Dit protocol gebruikt de GE InCell Analyzer voor kwantitatieve beoordeling van celmorfologie en toxiciteit.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

De auteurs willen Drs bedanken. Rick Ryan, Umesh Patel, Jeff Till, Matthew Hsu, Jehangir Mistry en Michele Hatler voor ondersteuning tijdens de ontwikkeling van deze projecten en protocollen.

Cel Bereiding: <ol><li> Voorafgaand aan de cel zaaien voor de test, cultuur neuronen / astrocyten in groeimedia tot ~ 70-80% samenvloeiende (tenzij de cel zaaien direct van dooi of isolatie). </li><li> Los cellen van cultuur flessen / platen via methode geschikt is voor celtype van belang. Indien nodig, de vacht testplaat putten met poly-D-lysine of extracellulaire matrix eiwit te verbeteren celadhesie. Co-culturen van astrocyten en neuronen kan gelijktijdig of opeenvolgend worden gezaaid. Voor sequentiële uitzaaiingen, is plating van astrocyten eerst als een &quot;basale&quot; laag aanbevolen, gevolgd door neuronale plating en differentiatie, indien nodig. Pas celdichtheid in voorkomend geval voor celtype, de daaropvolgende tijd cultuur, parameters die van belang, etc. Afhankelijk van de cultuur leeftijd, cel bron en zaaien dichtheid, kunnen primaire culturen sterk variëren in mate van proliferatie, GFAP expressie of neurietuitgroei - het is belangrijk om karakteriseren en optimaliseren van uw mobiele systeem om de meest biologische relevantie voor uw experimenteel model, maar ook te voorzien in effectieve beeldvorming, segmentatie en analyse met behulp van HCS (zie figuur 1) te verstrekken. Na het toevoegen van cellen tot op het bord (cellen kunnen worden gezaaid in 90 ui media, om toxine behandeling te vergemakkelijken, zoals beschreven in stap 3 hieronder), laat plaat om op een vlakke ondergrond zitten bij kamertemperatuur gedurende 15-30 minuten, zodat zelfs mobiele distributie. Na deze periode, incubeer cellen in groei media (37 ° C / 5% CO 2) gedurende ten minste 24 uur, schakel dan over naar differentiatie cultuur omstandigheden (bijvoorbeeld, een lage serum / NGF voor PC12 cellen), naargelang het geval. Ga door de cultuur tot de cellen te bereiken gewenste niveau van samenloop of differentiatie, het veranderen van de media met tussenpozen geschikt zijn voor cel-type. </li><li> Cel behandelingen (controle verbindingen, test verbindingen, etc.) kunnen worden ingevoerd op elk moment tijdens deze cultuur periode, in voorkomend geval voor het tijdsverloop van de behandeling van belang. Acrylamide, waterstofperoxide en K-252 bis worden geleverd als neurotoxisch controle verbindingen. Voldoende reagentia zijn voorzien voor dubbele 12-punts dosis-respons curves (met inbegrip van een dH 2 O of DMSO-controle ingesteld binnen de dosis-respons) voor alle vijf 96-wells platen. De verbindingen zijn verstrekt op 250X concentratie (voor K-252 bis, uitgaande van een maximale behandeling van 1 uM) of 10X (voor acrylamide en waterstofperoxide, uitgaande van een maximale behandelingen van 100 mm en 10 mm, respectievelijk). Aanbevolen behandeling voorbereiding impliceert half-log (1: √ 10) seriële verdunning van de 250X compound in DMSO, gevolgd door verdunning in Compound verdunningsbuffer tot 10x (10x controle verbindingen van oorsprong uit dH 2 O kan direct serieel verdund worden in een steriele dH 2 O of samengestelde verdunningsbuffer). 10 pi van elke behandeling kan dan worden toegevoegd aan de 90 ul van cultuur media al aanwezig in elke goed, voor een laatste 1X concentratie (0,4% DMSO of 10% dH 2 O). Voorbeeld data is voorzien voor 24 of 96 uur van samengestelde behandeling bij 37 ° C voorafgaand aan de fixatie. </li></ol> Cel fixatie en kleuring Immunofluorescente: Let op: Kleuring tijd is ~ 2,5 uur na de fixatie. Sta niet toe dat bronnen om uit te drogen tussen de vlekken stappen. Aspiratie en bedeling van reagentia moeten worden uitgevoerd bij lage debieten aan een cel verlies als gevolg van vocht afschuiving verminderen. Alle aanbevolen &#39;per goed&#39; volumes verwijzen naar een well van een 96-wells microtiterplaat. Alle aanbevolen &#39;per 96-well plaat&#39; volumes onder meer 25% eigen risico voor liquid handling volume verlies. Alle vlekken stappen worden uitgevoerd bij kamertemperatuur (RT). Alle buffers en antilichaam-oplossingen zijn stabiel gedurende tenminste 24 uur bij RT. <ol start="4"><li> Aan het einde van de cultuur periode, pre-warm HCS Fixation Solution (2X) op kamertemperatuur (RT) of 37 º C, indien gewenst (12 mL/96-well plaat). In een chemische dampkap, voeg 100 ul / putje rechtstreeks aan cultuur media en laat fix voor 30 min bij RT. Verwijder fixatief / toxine bevattende media en verwijderen in overeenstemming met de regelgeving voor gevaarlijk afval (zie MSDS). Als procedure meteen voor vlekken, twee keer spoelen elk putje met 200 ul van HCS Immunofluorescentie Buffer. Als alternatief, als platen zijn te worden gemerkt op een later tijdstip, twee keer spoelen met 200 pi van Wash Buffer, dan laat seconden afspoelen volume in putten en op te slaan platen goed afgesloten bij 4 º C tot verkleuring. </li><li> Als vaste monsters zijn opgeslagen bij 4 º C vóór de kleuring, twee keer spoelen met 200 pi HCS Immunofluorescentie buffer voordat u verder gaat met kleuringsprotocol. </li><li> Bereid te werken oplossing van Rabbit Anti-βIII Tubuline / Mouse Anti-GFAP HCS Primaire antilichamen (6 mL/96-well plaat) als volgt: Voeg 60 ul van elk ontdooid primaire antilichaam tegen 5,88 mL van HCS Immunofluorescentie Buffer. Meng goed. Verwijder de vorige Immunofluorescentie Buffer spoelen. Voeg 50 ul van primaire antistof-oplossing in elk putje en incubeer 1 uur bij RT. </li><li> Verwijder primair antilichaamoplossing. Spoel drie keer met 200 pi HCS Immunofluorescentie Buffer. </li><li> Bereid te werken oplossing van HCS secundair antilichaam / Hoechst HCS Nuclear Stain (6 mL/96-well plaat) als volgt: 30 pi van elk ontdooid secundair antilichaam en 30 pi van de ontdooide Hoechst HCS Nuclear Stain tot 5,91 ml van HCS Immunofluorescentie Buffer. Meng goed, het beschermen van oplossing tegen licht. Verwijder de vorige HCS Immunofluorescentie Buffer spoelen. Voeg 50 ul van HCS secundair antilichaam / Hoechst HCS Nuclear Stain oplossing en incubeer gedurende 1 uur bij RT, beschermd tegen licht. </li><li> Verwijder de HCS secundair antilichaam / Hoechst HCS Nuclear Stain oplossing. Spoel tweemaal met 200 pi HCS Immunofluorescentie Buffer. </li><li> Verwijder de vorige HCS Immunofluorescentie Buffer spoelen. Spoel tweemaal met 200 pi van HCS Wash Buffer en laat seconden spoelen volume in putten. </li><li> Afdichting plaat en beeld direct, of op te slaan plaat staan ​​bij 4 º C beschermd tegen licht tot aan beeldvorming. </li></ol> Image Acquisition and Analysis: <ol start="12"><li> Beeldvorming en analyse van de gekleurde platen kunnen worden uitgevoerd op een verscheidenheid van beschikbare HCS platforms, waaronder de IN Cell Analyzer (GE Healthcare), ArrayScan (ThermoFisher Scientific) en Opera (Perkin Elmer). Enkele richtlijnen voor beeldvorming en analyse zijn in Tabel 1: </li></ol><table border="1" cellspacing="0" cellpadding="0"><tbody><tr><td style="background:#000000; color:#FFFFFF;" colspan="4"> HCS222 Image Acquisition Richtlijnen </td></tr><tr><td> Detectie Reagens </td><td> Doelstelling Lens </td><td> Excitatiefilter Range [piek / bandbreedte (nm)] </td><td> Emissie Filter Range [piek / bandbreedte (nm)] </td></tr><tr><td> Hoechst HCS Nuclear Stain </td><td> 20X </td><td> 360/40 </td><td> 460/40 (of 535/50 indien nodig) </td></tr><tr><td> HCS tweede antilichaam, FITC-Donkey anti-konijn IgG </td><td> 20X </td><td> 480/40 </td><td> 535/50 </td></tr><tr><td> HCS tweede antilichaam, Cy3-Donkey anti-muis IgG </td><td> 20X </td><td> 535/50 </td><td> 600/50 </td></tr></tbody></table> <table border="1" cellspacing="0" cellpadding="0"><tbody><tr><td style="background:#000000; color:#FFFFFF;" colspan="4" width="545"> HCS222 Image Analysis Richtlijnen </td></tr><tr><td> Cel Parameter </td><td> Opsporing </td><td> Segmentatie / meting </td><td> Motivering </td></tr><tr><td> Aantal cellen, Nucleaire Kenmerken </td><td> Hoechst HCS Nuclear Stain </td><td> Nucleair gebied (460 nm emissie kanaal). Tel het aantal kernen. DNA-inhoud (nucleaire intensiteit) of een nucleair gebied analyses zijn ook mogelijk. </td><td> Gebruik aantal cellen, de nucleaire kenmerken naar cel verlies, toxiciteit fenotypen, etc. vast te stellen kan &quot;filter&quot; kernen voor die in verband met βIII-tubuline of GFAP expressie te scheiden neuronale en astrocytaire celtellingen / karakteriseringen (sterk aanbevolen) te verkrijgen. </td></tr><tr><td> βIII-tubuline Expression, neurietuitgroei </td><td> HCS tweede antilichaam, FITC-geconjugeerd </td><td> Cytoplasmatische regio (535 nm emissie kanaal). FITC signaal kan worden gebruikt om de neuronale cellichamen onderscheiden van neurieten (bijvoorbeeld via minimum / gemiddelde cellichaam gebieden, minimum / maximum van neurieten lengtes en breedtes). Te bepalen parameters zoals het totale lengte van neurieten, neurieten telt / cel, etc. </td><td> Neurietuitgroei metingen kunnen gemoduleerd worden tijdens de neuronale differentiatie of als gevolg van chemische schade, ziekte staten, etc. Kan &quot;filter&quot; cellichamen voor die in verband met βIII-tubuline expressie aan verschillende neuronale karakterisering (sterk aanbevolen) te verkrijgen. </td></tr><tr><td> GFAP Expression, astrocyten omgeving </td><td> HCS tweede antilichaam, Cy3-geconjugeerd </td><td> Cytoplasmatische gebied (600 nm emissie kanaal). Cy3 signaal kan worden gebruikt om astrocytaire cytoplasmatische segmentatie te bepalen. Te bepalen parameters zoals de gemiddelde cytoplasmatische signaal intensiteit, cel oppervlakte, enz. </td><td> GFAP expressie en astrocyte cel-gebied kan gemoduleerd worden tijdens de astrocyten ontwikkeling of als gevolg van chemische schade, ziekte staten, etc. Kan &quot;filter&quot; cellichamen voor die in verband met GFAP expressie tot afzonderlijke astrocytaire karakterisering (sterk aanbevolen) te verkrijgen. </td></tr></tbody></table> . Tabel 1 Image Acquisition and Analysis Richtlijnen - HCS222 βIII-Tubulin/GFAP (Co-cultuur) Assay Representatieve resultaten: <img src="/files/ftp_upload/1173/figure31173.png" alt="Figuur 3" /> Figuur 1. βIII-tubuline en GFAP immunofluorescene van gemengde rat neurale celculturen. Co-culturen van primaire rat hippocampus astrocyten met zowel primaire rat hippocampale neuronen of rat PC12 cellen werden gegenereerd door pre-plating astrocyten voor enkele dagen in de cultuur, gevolgd door de neuronale zaaien. Primaire neuronen werden gekweekt voor een extra 11 dagen, terwijl de PC12s werden gekweekt voor een extra 2 dagen onder differentiatie omstandigheden (lage serum / NGF). Cel behandeling, fixatie en immunokleuring werden uitgevoerd volgens HCS222 test protocollen. Cellen werden afgebeeld op de GE IN Cell Analyzer 1000 (punt 3.3) op 20X (primaire neuronen) of 10X (PC12) objectieve vergroting en geanalyseerd met behulp van de GE-IN Cell Analyzer 1000 Workstation (3.4) neurietuitgroei en Multi Target-analyse algoritmes Top paneel.: Fused beelden van Hoechst HCS Nuclear Stain (blauw), βIII-tubuline (groen) en GFAP (rood) fluorescentie. Afzonderlijke analyse van de βIII-tubuline fluorescentie kanaal zorgt voor neurietuitgroei segmentatie (middelste paneel: cellichamen beschreven in blauwe (primaire neuronen) of geel (PC12), neurieten in groen (primaire neuronen) of lichtblauw (PC12)). Analyse van de GFAP-kanaal zorgt voor astrocyten segmentatie (onderste panel: kernen beschreven in het blauw, cytoplasma in het groen). GFAP segmentatie voor de primaire rat hippocampal neuron / astrocyten co-cultuur toont het vermogen om onderscheid te maken tussen de kernen / cellichamen die GFAP (+) (groen contouren) en degenen die GFAP (-) (rood), waardoor aparte cel telt voor neuronen en astrocyten in een gemengde cultuur setting. <img src="/files/ftp_upload/1173/figure41173.png" alt="Figuur 4" /> <img src="/files/ftp_upload/1173/figure4.51173.png" alt="Afbeelding 4 part2" /> Figuur 2. Dosis reacties van primaire rat hippocampal neuron / astrocyten co-culturen aan toxische stress. Primaire rat hippocampus astrocyten (P6) werden uitgeplaat op 96-well platen in groei media en gekweekt voor 6 dagen. Primaire rat hippocampale neuronen (rechtstreeks van dooi) werden vervolgens gezaaid op de top van pre-plated astrocyten en gekweekt in groeimedia voor 11 dagen. Cellen werden behandeld met seriële verdunningen van acrylamide of waterstofperoxide (max. concentraties = 100mm en 10mm, respectievelijk) voor de laatste 24 uur van de cultuur. Cel behandeling, fixatie en immunokleuring werden uitgevoerd volgens HCS222 test protocollen. Cellen werden afgebeeld op de GE IN Cell Analyzer 1000 (punt 3.3) op 20X (10 velden / goed) en geanalyseerd (nucleaire / cytoplasmatische / neurieten segmentatie) met behulp van het GE IN Cell Analyzer 1000 Workstation (3.4) neurietuitgroei en Multi Target-analyse algoritmen. Gepresenteerde gegevens zijn gemiddelde ± SEM, n = 3. Meerdere parameters (neurietuitgroei, GFAP intensiteit, astrocyten gebied en neuronale of astrocytische-cel-tellingen) werden onderzocht voor de dosis-afhankelijke trends.

<ol><li>Radio, N. M., Mundy, W. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Developmental+neurotoxicity+testing+in+vitro%3A+models+for+assessing+chemical+effects+on+neurite+outgrowth%5BTitle%5D)+AND+%22Neurotoxicology%22%5BJournal%5D)">Developmental neurotoxicity testing in vitro: models for assessing chemical effects on neurite outgrowth.</a> Neurotoxicology. 29, 361-376 (2008).</li>
<li>Richards, G. R., Smith, A. J., Parry, F., Platts, A., Chan, G. K., Leveridge, M., Kerby, J. E., Simpson, P. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+morphology-+and+kinetics-based+cascade+for+human+neural+cell+high+content+screening%5BTitle%5D)+AND+%22Assay+Drug+Dev+Technol%22%5BJournal%5D)">A morphology- and kinetics-based cascade for human neural cell high content screening.</a> Assay Drug Dev Technol. 4, 143-152 (2006).</li>
<li>Evans, N. A., Facci, L., Owen, D. E., Soden, P. E., Burbidge, S. A., Prinjha, R. K., Richardson, J. C., Skaper, S. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Abeta%281-42%29+reduces+synapse+number+and+inhibits+neurite+outgrowth+in+primary+cortical+and+hippocampal+neurons%3A+A+quantitative+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci+Methods%22%5BJournal%5D)">Abeta(1-42) reduces synapse number and inhibits neurite outgrowth in primary cortical and hippocampal neurons: A quantitative analysis.</a> J Neurosci Methods. 175, 96-103 (2008).</li>
<li>Breier, J. M., Radio, N. M., Mundy, W. R., Shafer, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+a+high-throughput+screening+assay+for+chemical+effects+on+proliferation+and+viability+of+immortalized+human+neural+progenitor+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Toxicol+Sci%22%5BJournal%5D)">Development of a high-throughput screening assay for chemical effects on proliferation and viability of immortalized human neural progenitor cells.</a> Toxicol Sci. 105, 119-133 (2008).</li>
<li>Radio, N. M., Breier, J. M., Shafer, T. J., Mundy, W. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assessment+of+chemical+effects+on+neurite+outgrowth+in+PC12+cells+using+high+content+screening%5BTitle%5D)+AND+%22Toxicol+Sci%22%5BJournal%5D)">Assessment of chemical effects on neurite outgrowth in PC12 cells using high content screening.</a> Toxicol Sci. 105, 106-118 (2008).</li>
<li>Harry, G. J., Tiffany-Castiglioni, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+neurotoxic+potential+by+use+of+in+vitro+systems%5BTitle%5D)+AND+%22Expert+Opin+Drug+Metab+Toxicol%22%5BJournal%5D)">Evaluation of neurotoxic potential by use of in vitro systems.</a> Expert Opin Drug Metab Toxicol. 1, 701-713 (2005).</li>
<li>Prockop, L. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+allegory+of+a+mountain%3A+an+environmental+introduction+to+neurotoxicology%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurol+Sci%22%5BJournal%5D)">The allegory of a mountain: an environmental introduction to neurotoxicology.</a> J Neurol Sci. 262, 7-14 (2007).</li>
<li>Woehrling, E. K., Hill, E. J., Coleman, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+a+neurotoxicity+test-system%2C+using+human+post-mitotic%2C+astrocytic+and+neuronal+cell+lines+in+co-culture%5BTitle%5D)+AND+%22Toxicol+In+Vitro%22%5BJournal%5D)">Development of a neurotoxicity test-system, using human post-mitotic, astrocytic and neuronal cell lines in co-culture.</a> Toxicol In Vitro. 21, 1241-1246 (2007).</li>
<li>Holden, L. J., Coleman, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assessment+of+the+astrogliotic+responses+of+three+human+astrocytoma+cell+lines+to+ethanol%2C+trimethyltin+chloride+and+acrylamide%5BTitle%5D)+AND+%22Toxicology%22%5BJournal%5D)">Assessment of the astrogliotic responses of three human astrocytoma cell lines to ethanol, trimethyltin chloride and acrylamide.</a> Toxicology. 241, 75-83 (2007).</li>
<li>Röhl, C., Lucius, R., Sievers, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+effect+of+activated+microglia+on+astrogliosis+parameters+in+astrocyte+cultures%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Res%22%5BJournal%5D)">The effect of activated microglia on astrogliosis parameters in astrocyte cultures.</a> Brain Res. 1129, 43-52 (2007).</li>
<li>Eng, L. F., Ghirnikar, R. S., Lee, Y. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glial+fibrillary+acidic+protein%3A+GFAP-thirty-one+years+%281969-2000%29%5BTitle%5D)+AND+%22Neurochem+Res%22%5BJournal%5D)">Glial fibrillary acidic protein: GFAP-thirty-one years (1969-2000).</a> Neurochem Res. 25, 1439-1451 (2000).</li>
<li>Gadea, A., Schinelli, S., Gallo, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endothelin-1+regulates+astrocyte+proliferation+and+reactive+gliosis+via+a+JNK%2Fc-Jun+signaling+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Endothelin-1 regulates astrocyte proliferation and reactive gliosis via a JNK/c-Jun signaling pathway.</a> J Neurosci. 28, 2394-2408 (2008).</li>
<li>O'Callaghan, J. P., Sriram, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glial+fibrillary+acidic+protein+and+related+glial+proteins+as+biomarkers+of+neurotoxicity%5BTitle%5D)+AND+%22Expert+Opin+Drug+Saf%22%5BJournal%5D)">Glial fibrillary acidic protein and related glial proteins as biomarkers of neurotoxicity.</a> Expert Opin Drug Saf. 4, 433-442 (2005).</li>
<li>Mead, C., Pentreath, V. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+toxicity+indicators+in+rat+primary+astrocytes%2C+C6+glioma+and+human+1321N1+astrocytoma+cells%3A+can+gliotoxicity+be+distinguished+from+cytotoxicity%3F%5BTitle%5D)+AND+%22Arch+Toxicol%22%5BJournal%5D)">Evaluation of toxicity indicators in rat primary astrocytes, C6 glioma and human 1321N1 astrocytoma cells: can gliotoxicity be distinguished from cytotoxicity?</a> Arch Toxicol. 72, 372-380 (1998).</li>
<li>Balls, M., Walum, E. Chapter 11: towards the acceptance of in vitro neurotoxicity tests. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aBalls%2C+M+%22Neurotoxicology+In+Vitro%22">Neurotoxicology In Vitro</a>. , Taylor and Francis. London. 269-283 (1999).</li>
<li>Yokosuka, M., Ohtani-Kaneko, R., Yamashita, K., Muraoka, D., Kuroda, Y., Watanabe, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Estrogen+and+environmental+estrogenic+chemicals+exert+developmental+effects+on+rat+hypothalamic+neurons+and+glias%5BTitle%5D)+AND+%22Toxicol+In+Vitro%22%5BJournal%5D)">Estrogen and environmental estrogenic chemicals exert developmental effects on rat hypothalamic neurons and glias.</a> Toxicol In Vitro. 22, 1-9 (2008).</li>
<li>Weible, M. W., Chan-Ling, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phenotypic+characterization+of+neural+stem+cells+from+human+fetal+spinal+cord%3A+synergistic+effect+of+LIF+and+BMP4+to+generate+astrocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Glia%22%5BJournal%5D)">Phenotypic characterization of neural stem cells from human fetal spinal cord: synergistic effect of LIF and BMP4 to generate astrocytes.</a> Glia. 55, 1156-1168 (2007).</li>
<li>Casulari, L. A., Melcangi, R. C., Piva, F., Martini, L., Maggi, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Factors+released+by+rat+type+1+astrocytes+exert+different+effects+on+the+proliferation+of+human+neuroblastoma+cells+%28SH-SY5Y%29+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Endocr+Relat+Cancer%22%5BJournal%5D)">Factors released by rat type 1 astrocytes exert different effects on the proliferation of human neuroblastoma cells (SH-SY5Y) in vitro.</a> Endocr Relat Cancer. 7, 63-71 (2000).</li>
<li>Dringen, R., Gutterer, J. M., Hirrlinger, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glutathione+metabolism+in+brain+metabolic+interaction+between+astrocytes+and+neurons+in+the+defense+against+reactive+oxygen+species%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+J+Biochem%22%5BJournal%5D)">Glutathione metabolism in brain metabolic interaction between astrocytes and neurons in the defense against reactive oxygen species.</a> Eur J Biochem. 267, 4912-4916 (2000).</li>
<li>Cristòfol, R. M., Gassó, S., Vílchez, D., Rodríguez-Farré, E., Sanfeliu, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neurotoxic+effects+of+trimethyltin+and+triethyltin+on+human+fetal+neuron+and+astrocyte+cultures%3A+a+comparative+study+with+rat+neuronal+cultures+and+human+cell+lines%5BTitle%5D)+AND+%22Toxicol+Lett%22%5BJournal%5D)">Neurotoxic effects of trimethyltin and triethyltin on human fetal neuron and astrocyte cultures: a comparative study with rat neuronal cultures and human cell lines.</a> Toxicol Lett. 152, 35-46 (2004).</li>
</ol>

De auteurs zijn alle medewerkers van Millipore Corporation.

Tot op heden hebben in vitro experimenten ontworpen om neurotoxiciteit risico-evaluatie met behulp van gemengde culturen van neuronen en astrocyten studie is beperkt. Het is goed aanvaard dat gliale cellen zijn integraal in het verstrekken van ruimtelijke en metabole ondersteuning aan neuronen, en spelen een cruciale rol bij het moduleren van verschillende neuronale functies, waaronder neuronale migratie, differentiatie en synaptische activiteit. Gliale astrocyten ook los cytokinen en andere oplosbare factoren die in staat zijn zowel induceren negatieve reacties in de omliggende neuronaal weefsel, alsmede de bevordering van neuronale tolerantie van de vele giftige stoffen. Demonstratie van de diepte van de neuronale-gliale interacties, in co-cultuur studies zijn astrocyten is aangetoond dat neuronen te beschermen tegen de toxiciteit van oxidatieve stress, terwijl de aantasting van astrocytaire functies, zoals het onderhoud van de anti-oxidant verdediging en cellulaire energie niveaus, is aangetoond dat kritisch invloed van neuronale overleving. Recente studies hebben gesuggereerd dat het gebruik van astrocyten in een in vitro neurotoxische test-systeem alleen kunnen blijken meer relevant zijn voor de mens centraal zenuwstelsel structuur en functie dan de neuronale cellen. Ondanks het groeiende bewustzijn van de fysiologische betekenis van de neuronale-astrocytaire interacties, is het eerder moeilijk om kwantitatieve analyses van deze interacties uit te voeren in intacte cellen. De komst van High Content Screening maakt de ontwikkeling van krachtige nieuwe assays aan te pakken dit. In deze studie hebben we aangetoond dat kwantitatieve analyses van meerdere neuronale en astrocytaire fenotypen in een enkele assay worden mogelijk gemaakt door HCA. Bij primaire neuronen we hebben uitgevoerd kwantitatieve metingen van neurotoxiciteit merkers zoals neuronale nummer, neurieten tellen en neurieten lengte. In astrocyten, reactief gliosis is een bekende biomarker van neurotoxiciteit, gekenmerkt door veranderingen in GFAP expressie, astrocyten nummer en astrocyte morfologie. We hebben aangetoond dat elk van deze eindpunten gemakkelijk kunnen worden beoordeeld via HCA. Deze studies ondersteunen het concept dat HCA van neurale-specifieke biomarkers kunnen worden gebruikt als onderdeel van een reeks van in vitro-tests om snel het scherm een groot aantal chemicaliën voor neurotoxische eindpunten. Millipore HCS222 Hoge Content Analysis kit voor co-cultuur van neuronen en astrocyten bestaat uit kwalitatief hoogwaardige detectie-reagentia en-protocollen voor het gelijktijdig profileren βIII-tubuline en gliale fibrillaire zuur eiwit (GFAP) in een breed scala van cellulaire modellen van neurotoxiciteit. De zeer-gevalideerde reagentia, die bij deze kit kan de gebruiker testen te standaardiseren, test-to-assay variabiliteit te minimaliseren, en reproduceerbaar te genereren beelden met een hoge signaal-achtergrond verhouding.

<table><tbody><tr><td>Konijn Anti-&amp;#946;III-Tubuline HCS primair antilichaam, 100X</td><td></td><td>Onderdeel nr. CS201672</td><td>1 vial bevattend 300 &amp;#x03BC;L&lt;br/&gt;Millipore HCS222 kit-component</td></tr><tr><td>HCS secundair antilichaam (donkey anti-rabbit IgG, FITC-conjugaat), 200X</td><td></td><td>Onderdeel nr. CS201649</td><td>1 vial bevattend 150 &amp;#x03BC;L&lt;br/&gt;Millipore HCS222 kit-component</td></tr><tr><td>Muis Anti-GFAP HCS primair antilichaam, 100X</td><td></td><td>Onderdeel nr. CS201671</td><td>1 vial bevattend 300 &amp;#x03BC;L&lt;br/&gt;Millipore HCS222 kit-component</td></tr><tr><td>HCS secundair antilichaam (donkey anti-mouse IgG, Cy3-conjugaat), 200X</td><td></td><td>Onderdeel nr. CS200437</td><td>1 vial bevattend 150 &amp;#x03BC;L&lt;br/&gt;Millipore HCS222 kit-component</td></tr><tr><td>H&amp;#8211;chst HCS kernkleuring, 200X</td><td></td><td>Onderdeel nr. CS200438</td><td>1 vial bevattend 150 &amp;#x03BC;L&lt;br/&gt;Millipore HCS222 kit-component</td></tr><tr><td>HCS fixatieoplossing met fenolrood, 2X</td><td></td><td>Onderdeel nr. CS200434</td><td>1 fles bevattend 100 mL&lt;br/&gt;Millipore HCS222 kit-component</td></tr><tr><td>HCS immunofluorescentiebuffer, 1X</td><td></td><td>Onderdeel nr. CS200435</td><td>1 fles bevattend 1000 mL&lt;br/&gt;Millipore HCS222 kit-component</td></tr><tr><td>HCS wasbuffer, 1X</td><td></td><td>Onderdeel nr. 2007643</td><td>1 fles bevattend 500 mL&lt;br/&gt;Millipore HCS222 kit-componenten</td></tr><tr><td>Acrylamide (controleverbinding), 10X</td><td></td><td>Onderdeel nr. CS201679</td><td>1 vial bevattend 500 &amp;#x03BC;L van 1M acrylamide in dH&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O&lt;br/&gt;Millipore HCS222 kit-component</td></tr><tr><td>Waterstofperoxide (controleverbinding), 10X</td><td></td><td>Onderdeel nr. CS201730</td><td>1 vial bevattend 500 &amp;#x03BC;L van 100 mM waterstofperoxide in dH&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O&lt;br/&gt;Millipore HCS222 kit-componenten</td></tr><tr><td>K-252a (controleverbinding), 250X</td><td></td><td>Onderdeel nr. CS201741</td><td>1 vial bevattend 100 &amp;#x03BC;L van 250 &amp;#x03BC;M K-252a in DMSO&lt;br/&gt;Millipore HCS222 kit-component</td></tr><tr><td>DMSO voor seriële verdunning van verbindingen</td><td></td><td>Onderdeel nr. CS200441</td><td>1 fles bevattend 10 mL&lt;br/&gt;Millipore HCS222 kit-component</td></tr><tr><td>Buffer voor verdunning van verbindingen</td><td></td><td>Onderdeel nr. CS200442</td><td>1 fles bevattend 25 mL&lt;br/&gt;Millipore HCS222 kit-component</td></tr><tr><td>Platensealers</td><td></td><td>Onderdeel nr. CS200443</td><td>10 stuks&lt;br/&gt;Millipore HCS222 kit-componenten</td></tr><tr><td>weefselkweek-behandelde microplaten met zwarte/doorzichtige bodem</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>HCS imaging/analysesysteem</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

een neuronale en astrocyte co-cultuur assay voor high content analysis van neurotoxiciteit

A Neuronal and Astrocyte Co-Culture Assay for High Content Analysis of Neurotoxicity

Hoge Content Analysis (HCA) assays combineren cellen en detectie reagentia met geautomatiseerde beeldvorming en krachtige beeldanalyse algoritmen, waardoor de meting van meerdere cellulaire fenotypes binnen een enkele assay. In deze studie hebben we gebruik gemaakt HCA om een ​​nieuwe test voor neurotoxiciteit te ontwikkelen. Neurotoxiciteit assessment is een belangrijk onderdeel van de Drug Safety Evaluation, maar ook als een belangrijk aandachtspunt van de bescherming van het milieu inspanningen. Bovendien, neurotoxiciteit is ook een goed geaccepteerde<em&gt; In vitro</em&gt; Marker van de ontwikkeling van neurodegeneratieve ziekten zoals Alzheimer en de ziekte van Parkinson. Onlangs heeft de toepassing van de HCA tot neuronale screening gemeld. Door middel van etikettering neuronale cellen met βIII-tubuline, kan HCA testen leveren high-throughput, niet-subjectieve, kwantitatieve metingen van parameters zoals het aantal neuronale, neurieten tellen en de lengte van neurieten, die allemaal kunnen aangeven neurotoxische effecten. Toch blijft de rol van de astrocyten onontgonnen in deze modellen. Astrocyten hebben een integrale rol in het onderhoud van het centrale zenuwstelsel (CZS) homeostase, en worden geassocieerd met zowel de neuroprotectie en neurodegradation wanneer ze worden geactiveerd als reactie op giftige stoffen of ziekte staten. GFAP is een intermediair filament eiwit voornamelijk tot uiting in de astrocyten van het CZS. Astrocytische activering (gliosis) leidt tot de opregulatie van GFAP, vaak vergezeld door astrocyten proliferatie en hypertrofie. Dit proces van reactieve gliosis is voorgesteld als een vroege marker van beschadiging van het zenuwstelsel. De traditionele methode voor het GFAP kwantificering is door immunoassay. Deze benadering is beperkt door een onvermogen om informatie over de cellulaire lokalisatie, morfologie en mobiele nummer te geven. We hebben vastgesteld dat HCA kunnen worden gebruikt om deze beperkingen te overwinnen en tegelijkertijd te meten met meerdere functies die samenhangen met gliosis - veranderingen in de GFAP expressie, astrocyten hypertrofie en astrocyte proliferatie - binnen een enkele assay. In co-cultuur studies zijn astrocyten is aangetoond dat neuronen te beschermen tegen verschillende types van toxische belediging en kritisch te beïnvloeden neuronale overleving. Recente studies hebben gesuggereerd dat het gebruik van astrocyten in een<em&gt; In vitro</em&gt; Neurotoxiciteit testsysteem kunnen blijken meer relevant zijn voor het menselijk CNS structuur en functie dan de neuronale cellen alleen. Daarom hebben we een HCA test voor co-cultuur van neuronen en astrocyten, bestaande uit protocollen en gevalideerd target-specifieke detectie reagentia voor het profileren van βIII-tubuline en gliale fibrillaire zuur eiwit (GFAP). Deze test maakt gelijktijdige analyse van neurotoxiciteit, neurietuitgroei, gliosis, neuronale en astrocytaire morfologie en neuronale en astrocytaire ontwikkeling in een breed scala van cellulaire modellen, wat neerkomt op een nieuwe, niet-subjectieve, high-throughput assay voor neurotoxiciteit beoordeling. De test biedt veel mogelijkheden voor een verbeterde detectie van neurotoxiciteit en verbeterde productiviteit in de neurowetenschappen onderzoek en drug discovery.

Dit artikel beschrijft een nieuw protocol en reagensset ontworpen voor de gevoelige meting van de neurotoxische effecten van verbindingen en behandelingen op co-culturen van neuronen en astrocyten met behulp van hoge inhoudsanalyse. Resultaten tonen aan dat de hoge inhoudelijke analyse een spannende nieuwe technologie voor neurotoxiciteit assessment vertegenwoordigt.

Een Neuronale en astrocyte co-cultuur assay voor High Content Analysis van neurotoxiciteit

High Content Analysis (HCA)-assays combineren cellen en detectiereagentia met geautomatiseerde beeldvorming en krachtige algoritmen voor beeldanalyse, waardoor ...

<a class="grey_button" href="/video/1498">
Japans
</a>

a-neuronal-astrocyte-co-culture-assay-for-high-content-analysis

Research

JoVE Journal

Biology

Biologie

We ontwikkelden een nieuw meerdere compartimenten neuron co-cultuur microsysteem platform voor in-vitro CNS axon-glia interactie onderzoek. Het platform is in staat het uitvoeren van maximaal zes onafhankelijke experimenten in parallel en werd vervaardigd met behulp van een nieuw ontwikkelde macro / micro hybrid fabricage methode.

Een Multi-compartimenten CNS Neuron-glia Co-cultuur Microfluïdische Platform

Deze studie beschrijft de procedures van het opzetten van een nieuwe neuronale axon en (astro) glia co-cultuur platform. In deze co-cultuur systeem, manipulatie van directe interactie tussen een axon (en single gliale cel) wordt het mogelijk, waardoor mechanistische analyse van de wederzijdse neuron naar gliale signalering.

Imaging Analyse van de Neuron tot Glia Interactie in Microfluïdische Cultuur Platform (MCP)-gebaseerde Neuronale Axon en Glia Co-cultuur systeem

This video illustrates a method for establishing an indirect neuron-astrocyte co-culture using a compartmentalized approach. In this setup, neurons and astrocytes are spatially separated but share a conditioned medium. Neurotrophic factors released by astrocytes promote neuron differentiation and the formation of synaptic connections, suggesting neuron-glia interactions.

An Indirect Neuron-Astrocyte Co-Culture Technique for Studying Neuron-Glia Interactions

This video demonstrates establishing a neuron-astrocyte co-culture for recording neuronal network activity. Upon establishing the co-culture of motor neurons and astrocytes on a multi-electrode array (MEA) plate, the synchronous rhythmic electrical activity of the neuronal network was recorded extracellularly using the MEA.

Recording Electrophysiological Activity of the Neuronal Network in a Neuron-Astrocyte Co-culture

This video demonstrates the assessment of neuronal electrical activity in a co-culture of hiPSC-derived cortical glutamatergic neurons and glioma cells using a microfluidic device with multielectrode arrays.

Assessing Glutamatergic Neurons and Glioma Cells Interactions in a Co-Culture

Dit protocol beschrijft de indirecte neuron-astrocyten co-cultuur voor verzuilde analyse van neuron-glia interacties.

De indirecte Neuron-astrocyten Coculture Assay: An<em&gt; In Vitro</em&gt; Set-up voor het gedetailleerd onderzoek van het neuron-glia interacties

Menselijke geïnduceerde pluripotente stamcellen (hiPSCs) worden beschouwd als een krachtig instrument voor drugs- en chemische screening en voor de ontwikkeling van nieuwe in vitro modellen voor toxiciteitsonderzoek, inclusief neurotoxiciteit. Hier wordt een gedetailleerd protocol voor de differentiatie van hiPSCs in neuronen en glia beschreven.

Protocol voor de differentiatie van humane geïnduceerde pluripotente stamcellen in gemengde culturen van neuronen en glia voor het testen van neurotoxiciteit

Neuronale prikkelbaarheid kan worden gedifferentieerd door middel van een dynamisch proces van endo- en exocytose van excitatory ionotropic glutamaat receptoren. Hier beschreven is een toegankelijke, hoge-inhoud assay voor het kwantificeren van de groepen van de bevolking van de oppervlakte en interne receptor.

Een High-inhoud Assay voor het toezicht op AMPA Receptor mensenhandel

Het gepresenteerde protocol beschrijft een methode voor een neuriet ontgroeiingstest en neurotoxiciteitsbeoordeling van kleine moleculen.

Een Neurite Outgrowth Assay and Neurotoxicity Assessment met Human Neural Progenitor Cell-Derived Neurons

Hier presenteren we een eenvoudige aanpak met behulp van specifieke cultuurmedia die de oprichting van neuron- en astrocytenverrijkte culturen, of neuron-glia culturen uit de embryonale cortex, met hoge opbrengst en reproduceerbaarheid mogelijk maakt.

Een cel cultuur model voor het bestuderen van de rol van Neuron-Glia Interacties in Ischemie

Leer een gevoelige methode voor neurotoxiciteitsanalyse met neuron-astrocyt co-culturen en high content screening. Dit protocol gebruikt de GE InCell Analyzer voor kwantitatieve beoordeling van celmorfologie en toxiciteit.

Een Neuronale en astrocyte co-cultuur assay voor High Content Analysis van neurotoxiciteit

Meer video's verkennen