Name: Dendra2 Photoswitching door de borstklieren Imaging venster (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2009-06-05T00:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 12 s
Description: Leer intravitaal photoswitchen en volgen van Dendra2-gelabelde tumorcellen in de muis mammair vetkussen. Deze techniek maakt gedetailleerde observatie van metastatisch gedrag in specifieke tumormicro-omgevingen mogelijk.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dit werk werd ondersteund door het Amerikaanse Department of Defense (BC075554 naar BG en BC061403 naar DK), US National Institutes of Health (U54GM064346 naar JvR; CA100324 tot JC, JES en JW; CA77522 aan JES, U54CA126511 naar JC en BG). Wij danken D. Entenberg voor hulp bij microscopie, M. Rottenkolber voor hulp in de fabricage van de imaging-box en J. Pollard (Albert Einstein College of Medicine) voor de F4/80 antilichaam.

1. Generatie van fluorescente tumoren met behulp van injectie van tumorcellen in het uiervet pad: <ol><li> Grow een cellijn die Dendra2 eiwit (als een cytoplasmatisch marker) tot 40 - 80% confluentie. </li><li> Spoel schalen ten minste drie keer met PBS w / o Ca 2 + of Mg 2 +. </li><li> Voeg 3 ml trypsine per 10 cm schotel en incubeer bij 37 ° C tot het grootste deel van de cellen vervolgens los en druk op de schotel tegen een vlakke ondergrond om het te schudden. </li><li> Spoel alle cellen uit de schotel, en het gebruik van een schraper (rubber politieman) om matrix te verzamelen ook. Voeg de 5 ml PBS. Neem een ​​hoeveelheid te tellen tijdens het centrifugeren. </li><li> Centrifugeer bij 800 g gedurende 5 minuten. </li><li> Aspireren en resuspendeer in PBS tot een concentratie van 5 - 10x 10 6 / ml. Op te slaan op ijs tot geïnjecteerd (injecteren binnen 30 min). </li><li> Plaats een kooi met 4-5 week oude vrouwelijke immuun deficiënte muizen (bijvoorbeeld SCID) in een steriele kap. </li><li> Spray het gebied rond de 4e (buik) tepel met 70% ethanol. </li><li> Injecteer 0,1 ml in uiervet pad. Als een assistent kan worden gevonden, een persoon kan de muis zijn plaats te houden, terwijl de andere voegt de naald in de uiervet pad. Als u het injecteren zelf, zet de muis onder lichte verdoving met behulp van isofluraan. </li><li> Nadat de tumor is gegroeid tot 5-7 mm, moet de borstklieren Imaging Window (MIW) te worden opgenomen. Opmerking: Als alternatief, voor sommige toepassingen, het MIW kan worden geplaatst op de top van de gezonde uiervet pad en de cellen kunnen daarna geïnjecteerd worden. Die aanpak maakt het mogelijk beeldvorming van transient getransfecteerde cellen in een fysiologische omgeving. </li></ol> 2. Handmatige fabricage van de borstklier Imaging Window (MIW): <ol><li> MIWs (Figuur 1A) zijn gemaakt van weefsel grade plastic te biocompatibiliteit te garanderen. Voor de handmatige bouw, gebruiken we 5 of 10 cm schotels. </li><li> Zet latex handschoenen aan. </li><li> Verwarm een ​​tissue-cultuur schotel en creat een gebogen oppervlak door op een ronde, hard voorwerp tegen het verwarmde schotel (we gebruiken een 1-inch dremmel bit voor deze). </li><li> Knip het midden van de schotel met behulp van een verwarmde scheermesje. </li><li> Gebruik een kleine, kegelvormige dremmel bit om een ​​gat te maken in het midden van de koepel-vormige plastic basis (6-7mm in diameter). </li><li> Maak de randen van de kunststof bodem helemaal glad door schuren met de dremmel en verder het indienen van het. </li><li> Bestand de bovenkant van de plastic basis het maken van een vlakke ondergrond voor het glas dekglaasje aan. De diameter van de ingediende, vlakke ondergrond moet worden 9-10mm. </li><li> Lijm de 8mm ronde glazen dekglaasje (nummer 1) op de afgevlakte oppervlak met behulp van de secondenlijm (cyanoacrylaat lijm). </li><li> Wacht tot de lijm drogen (15 minuten). </li><li> Gebruik een verwarmd 26G naald om acht hechten gaatjes prikken van buitenaf (waar het glas is) aan de binnenzijde van de basis te maken. Gaten moeten gelijkmatig worden verdeeld over de hele dekglaasje, 0,5-1mm afstand van de rand van het dekglaasje. </li><li> Verbreed de gaten met behulp van een 5-0 hechten naald. </li><li> Prikken gaten in de plastic basis zal de binnenkant oneffen. Met behulp van schuurpapier, maken dit oppervlak volkomen glad. </li><li> Wijzig de handschoenen en borstel van kleine plastic deeltjes uit de MIW met een kleine borstel. </li><li> Was de MIW met gedeïoniseerd water. </li><li> Was de MIW met 70% ethanol. Gebruik een wattenstaafje om het glas te reinigen dus het is volledig transparant. Als er mistige plekken aanwezig zijn van de lijm damp, zorgvuldig gebruik van aceton met een Q-tip. </li><li> Steriliseer de MIW door UV-belichting voor 3 uur aan elke zijde. </li></ol> Semi-Manual fabricage van de borstklier Imaging Window (MIW): Met het oog op de plastic basis fabriceren, zijn we momenteel met behulp van siliconen rubber gietmallen gemaakt met de hand gemaakt MIWs. De mal bestaat uit twee delen van siliconen rubber, dat een exacte replica van zowel de voor-en achterzijde van het origineel wanneer gevuld met polyester hars en dan meteen met elkaar verbonden te maken. De vloeibare polyesterhars is samen 9:10 gemengd en resulteert in een harde structuur indien volledig genezen in 48h. Het plastic is UV beschermd en archivering, zonder te breken of te worden geel na verloop van tijd. Nadat de basis is genezen, stappen 2.8-2.16 worden op dezelfde manier gedaan als voor het handmatig gemaakt MIWs. 3. Insertie van het MIW: <ol><li> Het gebied rond de 4 e tepel moet een klein (5-7 mm diameter) tumor enkele dagen / weken na de injectie van tumorcellen, afhankelijk van het celtype (Figuur 1B). Hoeveel tijd is verstreken na de injectie van de cellen die Dendra2 photoswitchable eiwit of andere fluorescerende eiwitten afhankelijk van de gebruikte cellijn. De tumor mag niet worden zichtbaar necrotische, en moet een intacte huid met haar op de top van de tumor te hebben. Muizen met necrotische tumoren dienen te worden geëuthanaseerd. </li><li> Bereid de steriele ruimte voor de operatie-vast een stuk van steriele doek in een steriele kap. Leg een stukje van steriele gauze in het midden, en leg een paar MIWs en steriele instrumenten omheen: we gebruik maken van kleine standaard scharen, de lente schaar, pincet microdissecting, microdissecting tang, naaldhouder. Houden steriele Q-tips, een flesje van 70% ethanol en steriele handschoenen in de hoek van de motorkap. </li><li> De muis is verdoofd in de steriele kap met behulp van IP-injectie van 2,5% Avertin (20 ul / g) in HBSS of, als alternatief 10 ug / kg ketamine + 10 ug / g xylazine (neem contact op Animal Care Instituut voor goedkeuringen en bestellen). Let op: Avertin oplossing dient te worden voorbereid tweewekelijks, filter gesteriliseerd met behulp van een 0,22 um filter en opgeslagen als 500 ul aliquots bij 4 ° C (in het donker). </li><li> Verwijder de haren door het scheren het gebied boven de tumor met behulp van een klein dier scheerapparaat. </li><li> Verwijder de rest van het haar met behulp van Nair ontharingscrème (verkrijgbaar in elke drogist). Reinig de huid met behulp van ethanol-gedompeld Q-tips. </li><li> Breng het dier naar de steriele gaas en toe te passen oogzalf om de ogen te houden uitdrogen en infectie. </li><li> Steriliseer de huid met betadine en schoon met 70% ethanol. </li><li> Breng het dier op een steriele chirurgische doek in de steriele kap. </li><li> Trek de huid onmiddellijk mediaal van de tepel met behulp van pincet en knip ~ 2 mm incisie in de huid. </li><li> Gescheiden van de onderliggende uiervet pad van de huid met behulp van dissectie schaar en pincet. De huid en kontje op te rekken tijdens deze scheiding stap naar een formaat dat het inbrengen van de MIW zal plaats bieden. </li><li> Als per ongeluk een schip is geraakt tijdens het sugery, gebruik dan een steriele Q-tips om geen bloed, dat wordt geproduceerd op / om het bloeden te stoppen te groot te verwijderen. </li><li> Plaats de MIW zodanig dat er de huid op de top van de MIW basis en hechtdraad op zijn plaats met behulp van niet-resorbeerbare draad en omgekeerd snijden van de naald. </li><li> Gebruik weefsel lijm of cyanoacrylaat in te vullen hechten gaten en de MIW veilig voor de huid. </li><li> Voeg TMP-SMX antibiotica mix: (Sulfamethoxazol 0,6 mg / ml, Trimethoprim 0,12 mg / ml) in de kooi water fles voor 3 dagen voor en na de operatie. </li><li> Het dier blijft onder narcose voor een-4h na Avertin IP-injectie. Aangezien de ingreep meestal duurt ~ 45min, is het belangrijk om te helpen het dier daarna te herstellen: </li><li> Plaats een hand verwarming pad (37 ° C) (verkrijgbaar in drogisterijen) op de bodem van de kooi en dek deze af met gaas. </li><li> Houd het dier op de top van het pad totdat deze op zijn buik en begint te lopen. </li><li> Als het dier bewusteloos is voor meer dan 3 uur, injecteer 0,3 ml HBSS intraperitonaal voor rehydratatie. </li><li> Het dier is toegestaan ​​om te herstellen in de komende 3-4 dagen voor de eerste opnamesessie plaatsvindt. </li></ol> 4. Imaging Box Bouw De imaging box zorgt ervoor dat het MIW is vlak zit, recht boven de microscoop doelstelling. Het vergemakkelijkt ook de temperatuur en de anesthesie controle door middel van een constante luchtstroom van isofluraan. De box is gemaakt van plexiglas en aan elkaar gelijmd met behulp van plastic lassen. Het is geschikt voor de specifieke microscoop podium en dus de vorm van de bodem is afhankelijk van de microscoop gebruikt (Figuur 2 toont het schema van de doos gemonteerd Leica SP5 microscoop stadium). Afmetingen van de doos in centimeters zijn l = 11,4 cm, B = 7,6 cm, h = 4,4 cm (figuur 2A). De onderkant van de doos bestaat uit een holle plaat, 12.7x8.4 cm groot, die past in de Leica SP5 microscoop podium, en twee schuifdeuren &quot;deuren&quot;, 5,7 X 5,7 cm_each, die een ronde opening (formulier d = 2,22 cm ) gesloten. Het MIW past in deze opening. Het voorpand bevat de inlaat gat voor de anesthesietoediening terwijl een van de zijstukken bevat een afvoeropening die leidt tot het vacuüm. Merk op dat de condensor en de dia houder moet worden verwijderd voordat de beeldvorming box plaatsing. 5. Imaging Box gebruik <ol><li> Plaats het dier onder narcose met isofluraan en toe te passen oogzalf voor de ogen. </li><li> Bevestig de isofluraan uitlaat van de narcose machine naar de beeldvorming box voorkant, aan de buitenkant van de inlaat gat (Figuur 2B). </li><li> Bevestig een tweede buis op de uitlaat gat van de imaging-box. Deze buis moet worden gehecht aan de gas-filter en vervolgens naar het vacuüm. </li><li> Open het deksel en open de doos deuren en plaats het dier, MIW zijde naar de bodem, en schuiven de deuren in de doos. </li><li> Houd de doos en pas de deuren in de bodem, zodat het MIW basis is gehouden en geïmmobiliseerd tussen hen. Het MIW basis moet op hetzelfde niveau als de beeldvorming box deuren, terwijl de MIW dekglaasje moet net een paar millimeter onder dit niveau. Zorg ervoor dat de positionering van het MIW tussen de onderkant schuifdeuren zorgt ervoor dat het dekglaasje (glas gedeelte van de MIW) plat ligt, parallel aan de deuren in de bodem van de doos. Dit zal zorgen voor een goede scherpstelling. </li><li> Laat de microscoop doelstelling, om ruimte te maken voor de plaatsing van het vak optop van de microscoop podium. </li><li> Plaats de doos op de microscoop podium, en pas het podium, zodat het MIW dekglaasje is boven de doelstelling. </li><li> Focus het doel en de start beeldvorming. </li><li> Tijdens het gebruik van isofluraan, moet het dier worden gecontroleerd door visuele inspectie van de ademhaling frequentie. Dit kan visueel worden gedaan, of door controle van de frequentie van de ademhaling artefacten verschijnen tijdens de beeldvorming collectie (deze kunnen interfereren met data-acquisitie). De MouseOx pulsoximetrie systeem (Starr Life Sciences Corp) is met succes gebruikt. Op die manier kunnen de gegevens continu worden verzameld zonder het draaien van de lichten op in de kamer om te controleren op het dier. Let op: Na elke sessie beeldvorming, dier herstel moet worden gefaciliteerd door het wikkelen van een kleine hand verwarming pad in gaas of kimwipes en zetten het onder het dier in de kooi. Opmerking: Als een immersie objectief wordt gebruikt om de afbeelding door het MIW, de onderdompeling medium (glycerol, water, olie) moet worden gereinigd uit de imaging-venster. De MIW moet worden gecontroleerd op eventuele scheuren of andere schade die zou kunnen hebben voorgedaan tijdens de beeldvorming. Dit is essentieel voor het verzamelen van gegevens gedurende meerdere beeldvorming sessies. </li></ol> 6. Photoswitching en beeldvorming van Dendra2-gemerkte cellen De procedure is beschreven voor de Leica SP5 confocale microscoop, het laservermogen op de focal plane, beschikbaar doelstellingen en software-opties variëren bij het gebruik van andere confocale microscopen of multifoton imaging opzetten, en dus het protocol hieronder beschreven moeten worden gebruikt als een leidraad voor het optimaliseren het experiment op uw microscoop. <ol><li> Door het observeren van de tumor door het oculair (10x) met de groene fluorescentie filter, zoek grote bloedvaten die zichtbaar zijn vloeiend en plat ligt in hetzelfde brandvlak worden geplaatst. </li><li> Plaats een van de schepen in het midden van het veld en schakel over naar PMT detectie. </li><li> Stel sequentiële imaging inzameling voor twee kanalen. Een van de kanalen gebruikt 488nm laser lijn (10% vermogen), en verzamelt verstrooiing van de extracellulaire matrix (480-495nm) en de emissies uit de groene vorm van Dendra2 (505-540nm). Het tweede kanaal maakt gebruik van de 543nm laser lijn (90% vermogen) en verzamelt emissie uit de rode vorm van Dendra2 (555-600 nm). Verzamel 3D-beelden pre-photoswitching. </li><li> Gebruik maken van de ROI scan optie om een ​​gekozen populatie van cellen met behulp van de 405 nm laser lijn (30% vermogen, 20-40 scans) photoswitch. Verzamel-emissie van de rode vorm van het eiwit aan het schakelen te controleren. </li><li> Met dezelfde sequentiële routine als in 6.3, het verzamelen van post-switching 3D-beelden. </li><li> Indien photoswitching meer dan een regio in de tumor, is het raadzaam om foto&#39;s te maken door middel van de lenzen met behulp van een digitale camera, zowel in groen en rood kanalen (Figuur 3A, B). Dit zal helpen bij de oriëntatie tijdens de daaropvolgende beeldvorming sessies. Opmerking: Ook bloedvaten kan tijdelijk worden geëtiketteerd met staart-ader injecteren van TL-dextran (Cascade Blue of Alexa Fluor 647, beide 10kDa). Een paar uur na de injectie zal dextranen laat de bloedvaten en permanent het etiket van de macrofagen. </li></ol> Representatieve resultaten: Figuur 3C toont een rechthoekig photoswitched regio (rood) gericht orthogonaal ten opzichte van het bloedvat (geen fluorescentie). Niet-photoswitched cellen zijn groen, terwijl de verstrooiing van de extracellulaire matrix is ​​paars. Beeld is een maximale intensiteit projectie van vier afbeeldingen langs de Z-as (20-50 micrometer diepte).

<ol><li>Farina, K. L., Wyckoff, J. B., Rivera, J., Lee, H., Segall, J. E., Condeelis, J. S., Jones, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+motility+of+tumor+cells+visualized+in+living+intact+primary+tumors+using+green+fluorescent+protein%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Cell motility of tumor cells visualized in living intact primary tumors using green fluorescent protein.</a> Cancer Res. 58, 2528-2532 (1998).</li>
<li>Naumov, G. N., Wilson, S. M., MacDonald, I., Schmidt, E. E., Morris, V. L., Groom, A. C., Hoffman, R. M., Chambers, A. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellular+expression+of+green+fluorescent+protein%2C+coupled+with+high-resolution+in+vivo+videomicroscopy%2C+to+monitor+steps+in+tumor+metastasis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Sci%22%5BJournal%5D)">Cellular expression of green fluorescent protein, coupled with high-resolution in vivo videomicroscopy, to monitor steps in tumor metastasis.</a> J Cell Sci. 112, 1835-1842 (1999).</li>
<li>Brown, E. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+measurement+of+gene+expression%2C+angiogenesis+and+physiological+function+in+tumors+using+multiphoton+laser+scanning+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Med%22%5BJournal%5D)">In vivo measurement of gene expression, angiogenesis and physiological function in tumors using multiphoton laser scanning microscopy.</a> Nature Med. 7, 864-868 (2001).</li>
<li>Wang, W., Wyckoff, J. B., Frohlich, V. C., Oleynikov, Y., Huttelmaier, S., Zavadil, J., Cermak, L., Bottinger, E. P., Singer, R. H., White, J. G., Segall, J. E., Condeelis, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single+cell+behavior+in+metastatic+primary+mammary+tumors+correlated+with+gene+expression+patterns+revealed+by+molecular+profiling%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Single cell behavior in metastatic primary mammary tumors correlated with gene expression patterns revealed by molecular profiling.</a> Cancer Res. 62, 6278-6288 (2002).</li>
<li>Sidani, M., Wyckoff, J., Xue, C., Segall, J. E., Condeelis, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Probing+the+microenvironment+of+mammary+tumors+using+multiphoton+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22J+Mammary+Gland+Biol+Neoplasia%22%5BJournal%5D)">Probing the microenvironment of mammary tumors using multiphoton microscopy.</a> J Mammary Gland Biol Neoplasia. 11, 151-163 (2006).</li>
<li>Wyckoff, J. B., Wang, Y., Lin, E. Y., Li, J. F., Goswami, S., Stanley, E. R., Segall, J. E., Pollard, J. W., Condeelis, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+visualization+of+macrophage-assisted+tumor+cell+intravasation+in+mammary+tumors%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Direct visualization of macrophage-assisted tumor cell intravasation in mammary tumors.</a> Cancer Res. 67, 2649-2656 (2007).</li>
<li>Egeblad, M., Ewald, A. J., Askautrud, H. A., Truitt, M. L., Welm, B. E., Bainbridge, E., Peeters, G., Krummel, M. F., Werb, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualizing+stromal+cell+dynamics+in+different+tumor+microenvironments+by+spinning+disk+confocal+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Dis+Model+Mech%22%5BJournal%5D)">Visualizing stromal cell dynamics in different tumor microenvironments by spinning disk confocal microscopy.</a> Dis Model Mech. 1, 155-167 (2008).</li>
<li>Mempel, T. R., Henrickson, S. E., von Adrian, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((T-cell+priming+by+dendritic+cells+in+lymph+nodes+occurs+in+three+distinct+phases%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">T-cell priming by dendritic cells in lymph nodes occurs in three distinct phases.</a> Nature. 427, 154-159 (2004).</li>
<li>Miller, M. J., Wei, S. H., Cahalan, M. D., Parker, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Autonomous+T+cell+trafficking+examined+in+vivo+with+intravital+two-photon+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+USA%22%5BJournal%5D)">Autonomous T cell trafficking examined in vivo with intravital two-photon microscopy.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 100, 2604-2609 (2003).</li>
<li>Kedrin, D., Gligorijevic, B., Wyckoff, J., Verkhusha, V. V., Condeelis, J., Segall, J. E., van Rheenen, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intravital+imaging+of+metastatic+behavior+through+a+mammary+imaging+window%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Methods%22%5BJournal%5D)">Intravital imaging of metastatic behavior through a mammary imaging window.</a> Nat. Methods. 5, 1019-1021 (2008).</li>
<li>Chudakov, D. M., Lukyanov, S., Lukyanov, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tracking+intracellular+protein+movements+using+photoswitchable+fluorescent+proteins+PS-CFP2+and+Dendra2%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Protocols%22%5BJournal%5D)">Tracking intracellular protein movements using photoswitchable fluorescent proteins PS-CFP2 and Dendra2.</a> Nat. Protocols. 2, 2024-2032 (2007).</li>
</ol>

<table><tbody><tr><td>PBS zonder Ca, Mg</td><td>GIBCO, by Life Technologies</td><td>14190-144</td><td></td></tr><tr><td>Trypsine</td><td>GIBCO, by Life Technologies</td><td>25300</td><td></td></tr><tr><td>HBSS</td><td>GIBCO, by Life Technologies</td><td>14025</td><td></td></tr><tr><td>DMEM-medium (MDA-MB-231 cellen)</td><td>GIBCO, by Life Technologies</td><td>11965</td><td></td></tr><tr><td>Isofluraan(Aerrane)</td><td>Baxter Internationl Inc.</td><td># NDC 10019-773-40</td><td></td></tr><tr><td>SCID-muis</td><td>National Cancer Institute</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Kweekschalen</td><td>BD Biosciences</td><td>353003</td><td>Maatwerkbestelling</td></tr><tr><td>Circulaire dekglasplaat 8 mm</td><td>Scientific, Inc.</td><td>8CIR-1-FIS</td><td></td></tr></tbody></table>

dendra2 photoswitching door de borstklieren imaging venster

Dendra2 Photoswitching through the Mammary Imaging Window

In het laatste decennium, intravitale microscopie van borsttumoren bij muizen en ratten op single-cell resolutie<sup&gt; 1-4</sup&gt; Heeft geleid tot belangrijke inzichten in de mechanismen van metastatische gedrag, zoals migratie, invasie en intravasation van tumorcellen<sup&gt; 5, 6</sup&gt;, Angiogenese<sup&gt; 3</sup&gt; En immuuncellen reactie<sup&gt; 7-9</sup&gt;. We hebben onlangs melding gemaakt van een techniek om de afbeelding orthotope mammacarcinomata over meerdere sessies intravitale imaging in levende muizen<sup&gt; 10</sup&gt;. Hiervoor hebben we een borstklieren Imaging Window (MIW) en geoptimaliseerd imaging parameters voor Dendra2<sup&gt; 11</sup&gt; Photoswitching en imaging<em&gt; In vivo</em&gt;. We beschrijven hier het protocol voor de productie van MIW, het inbrengen van de MIW op de top van een tumor en beeldvorming van de Dendra2-gemerkte tumorcellen met behulp van een custom-built imaging box. Dit protocol kan worden gebruikt om het imago van de metastatische gedrag van tumorcellen in verschillende micro-omgevingen in tumoren en zorgt voor de lange termijn in beeld brengen van de bloedvaten, tumorcellen en gastheercellen.

Intravitale photoswitching en het bijhouden van Dendra2-gemerkte tumorcellen door de borstklieren Imaging Window is een techniek die ons in staat stelt om het imago van de metastatische gedrag van tumorcellen in de gekozen tumor micro-omgevingen op een tijdschaal van dagen.

Dendra2 Photoswitching door de borstklieren Imaging venster

In het afgelopen decennium heeft intravitale microscopie van borsttumoren in muizen en ratten met resolutie op enkelcelniveau1-4 geleid tot belangrijke inzichten in ...

Deze video illustreert een protocol dat begint met de injectie van een fluorescent eiwit-expresserende tumorcellijn in het mammaire vetkussen van de muis. Er wordt een gespecialiseerde kamer voor in vivo beeldvorming geconstrueerd en vervolgens chirurgisch geïmplanteerd in het dier, waarna beeldvormingsgegevens kunnen worden verzameld. Hallo, ik ben Dr. Vic van het laboratorium van Dr. John Condi en Dr. Jeffrey Siegel van het Biophotonics Center aan het Albert Einstein College of Medicine.Vandaag laten we u een procedure zien voor intravitale photoswitching en imaging van met DRA2 gelabelde kankercellen via het memory imaging window. Wij gebruiken deze procedure in ons laboratorium om de invloed van de tumoromgeving op de motiliteit van tumorcellen te bestuderen. Laten we beginnen, terwijl we latex handschoenen dragen.Begin de fabricage van het borstbeeldvormingsvenster, of MIW, door een weefselkweekschaal van vijf tot 10 centimeter te verhitten en een gebogen oppervlak te creëren door een afgerond hard object, zoals een Dremel-bit van één inch, tegen de schaal te drukken. Snijd het midden van de schaal uit met een verhit scheermesje. Gebruik nu een kleine kegelvormige Dremel-bit om een gat met een diameter van zes tot zeven millimeter in het midden van de koepelvormige plastic basis te maken.Maak de randen van de plastic basis volledig glad door deze met de Dremel te schuren en verder te vijlen. Vijl de bovenkant van de plastic basis om een vlak oppervlak te creëren voor het glazen dekglas. De diameter van het platgevijlde oppervlak moet 9 tot 10 millimeter zijn.Lijm vervolgens het cirkelvormige glazen dekglas van acht millimeter vast. Schuif dit op het vlakke oppervlak met secondelijm en laat het 15 minuten drogen. Maak met een verhitte 26 G naald acht hechtgaten door van buiten naar binnen door de basis te prikken; de gaten moeten gelijkmatig over het dekglas verdeeld zijn.Schuif het dekglas 0,5 tot 1 millimeter vanaf de rand van het dekglas. Was het MIW met gedeïoniseerd water en daarna opnieuw met 70% ethanol. Gebruik een wattenstaafje om het glas te reinigen tot het volledig transparant is.Gebruik aceton om eventuele resterende waasplekken van de lijmdamp te verwijderen. Steriliseer tot slot het MIW door het aan beide zijden gedurende drie uur bloot te stellen aan ultraviolet licht. Voordat het MIW wordt ingebracht, moet er rond de vierde tepel een kleine tumor met een diameter van vijf tot zeven millimeter zijn ontstaan als gevolg van de injectie van tumorcellen.Controleer in deel één of de tumor niet zichtbaar necrotisch is. Er moet intacte huid met haar aanwezig zijn op het gebied eromheen. Begin met het voorbereiden van een steriele ruimte voor de operatie door een stuk steriel doek in een steriele hood neer te leggen.Plaats een stuk steriel gaas in het midden en verzamel de benodigdheden voor de operatie. U heeft een klein en een groot dissectieschaartje, veerscharen, micro-dissectie pincetten en forceps, en een naaldhouder nodig. Na het anesthetiseren van de muis met 2,5% averting, gebruikt u een scheermachine voor kleine dieren om het gebied boven de tumor te scheren. Gebruik ontharingscrème om de resterende haren te verwijderen en reinig de huid.Gebruik wattenstaafjes gedoopt in ethanol. Verplaats het dier naar het steriele gaas en breng oogzalf aan op de ogen om uitdroging en infecties te voorkomen. Steriliseer de huid met Betadine en reinig deze vervolgens met 70% ethanol.Trek met het jaarlijkse en steriele chirurgische doek de huid direct mediaal van de tepel met een pincet strak en maak een incisie van ongeveer twee millimeter. Scheid het onderliggende mammaire vetkussen van de huid met behulp van dissectie, een schaar en een pincet. Wanneer deze zijn gescheiden, rekken de huid en het gat zich uit tot een grootte die het inbrengen van de MIW mogelijk maakt.Plaats het MIW zodanig dat er huid boven de basis van het MIW ligt en hecht het op zijn plaats. Gebruik weefsellijm of cyanoacrylaat om de hechtinggaten op te vullen en het MIW aan de huid te fixeren. Het dier moet nu drie tot vier dagen rusten om te herstellen voordat de eerste beeldsessie plaatsvindt.Ter voorbereiding op de beeldvormingssessie beschrijven we de beeldvormingsbox om deze optimaal te kunnen gebruiken. Anestheseer eerst het dier met isofluoraan en breng oogzalf aan op de ogen. Bevestig de isofluoraan-afvoer van het anesthesieapparaat aan de voorzijde van de beeldvormingsbox.Aan de buitenkant van het inlaatgat. Bevestig een tweede slang aan het uitlaatgat van de beeldvormingsbox. Deze slang moet worden aangesloten op het gasfilter en vervolgens op het vacuüm.Plaats het dier vervolgens neer zodat het MIW naar onderen is gericht. Houd de box vast en stel de onderste deuren zo in dat de basis van het MIW tussen hen in wordt vastgehouden en geïmmobiliseerd. De basis van het MIW moet zich op hetzelfde niveau bevinden als de deuren van de imaging box.Hoewel het MIW-dekglaasje slechts enkele millimeters onder dit niveau moet liggen, moet u ervoor zorgen dat de positionering van het MIW tussen de onderste schuifdeuren garandeert dat het dekglaasje plat en parallel aan de onderste deuren van de doos ligt. Dit maakt een correcte focussering mogelijk; verlaag het microscoopobjectief om ruimte te creëren om de doos op de tafel van de microscoop te plaatsen. Stel de tafel zo in dat het MIW-dekglaasje zich boven het objectief bevindt.We kunnen nu het objectief scherpstellen en beginnen met het maken van beelden. De hier beschreven beeldgevingsprocedure is bedoeld voor de Leica SP five confocale microscoop en dient als richtlijn om het experiment te optimaliseren voor de specifieke microscoop die wordt gebruikt. Begin met het observeren van de tumor door het oculair met een groen fluorescent filter.Lokaliseer grote bloedvaten die zichtbaar stromen en plat in hetzelfde brandvlak liggen. Positioneer een van de vaten in het midden van het gezichtsveld en schakel over naar PMT-detectie. We zullen sequentiële beeldacquisitie instellen voor twee kanalen.Eén kanaal maakt gebruik van de 488 nanometer laserlijn en verzamelt verstrooiing van de extracellulaire matrix en emissie van de groene vorm van dendra twee. Het tweede kanaal maakt gebruik van de 543 nanometer laserlijn en verzamelt emissie van de rode vorm van dendra twee. Verzamel 3D-beelden vóór het photoswitchen.Gebruik vervolgens de optie voor het scannen van het interessegebied om een gekozen populatie cellen te photoswitchen met de 405 nanometer laserlijn. Verzamel de emissie van de rode vorm van het eiwit om het switchen te monitoren. Verzamel nu na het switchen 3D-beelden op dezelfde wijze als de beelden vóór het switchen zijn verzameld.Gebruik vervolgens 20% laservermogen in het UV-kanaal om dit gebied, of meerdere regio's in de tumor, om te zetten naar een photoswitch; maak via de oculairs foto's met een digitale camera in zowel het groene als het rode kanaal. Dit helpt bij de oriëntatie tijdens opeenvolgende beeldsessies. Op deze afbeelding is een rechthoekige photoswitch-regio waarneembaar, orthogonaal georiënteerd ten opzichte van het bloedvat, die geen fluorescentie vertoont.Niet-fotoswitchbare cellen lijken groen, terwijl de verstrooiing van de extracellulaire matrix paars is. De afbeelding is een maximumintensiteitsprojectie van vier afbeeldingen over de Z-as. We hebben zojuist aangetoond hoe u RA tool-gelabelde cellen kunt fotoswitchen en afbeelden via het memory imaging-venster.Het gebruik van deze procedure is belangrijk om het gedrag van tumorcellen in verschillende gebieden van de tumor over meerdere dagen te vergelijken. Dat is alles. Bedankt voor het kijken en veel succes met uw experiment.

dendra2-photoswitching-through-the-mammary-imaging-window

Research

JoVE Journal

Biology

Biologie

In this video, we perform intravital imaging of pre-injected cancer cells in a mouse model via an implanted cranial window. This high-resolution time-lapse imaging technique enables the study of dynamic behavior of cancer cells in the live mouse.

Cranial Window-based Intravital Imaging in a Mouse Model: An Imaging Technique to Study the Behavior of Pre-injected Cancer Cells in the Brain of a Murine Model

Hier beschrijven we een techniek voor de gelokaliseerde toediening van reagentia aan de borstklier van konijnen via een intraductale injectie. Daarnaast beschrijven we een protocol voor visualisatie en bevestiging van de toediening door middel van hoogwaardige echografie met contrastmiddelen.

Intraductale Levering aan de Rabbit borstklier

Hier wordt een benadering gepresenteerd voor intravitale beeldvorming op lange termijn met behulp van optisch heldere, siliconen vensters die rechtstreeks op het weefsel / orgaan van belang en de huid kunnen worden gelijmd. Deze ramen zijn goedkoper en veelzijdiger dan andere die momenteel in het veld worden gebruikt, en de chirurgische inbrenging veroorzaakt beperkte ontsteking en leed voor de dieren.

Longitudinale intravitale beeldvorming door heldere siliconenvensters

Dit protocol beschrijft een nieuw mammabeeldvormingsvenster met een vervangbaar deksel (R.MIW). Intravitale microscopie na implantatie van de R.MIW maakt longitudinale en meerdaagse beeldvorming van de gezonde en zieke borstklier mogelijk met een cellulaire resolutie tijdens de verschillende ontwikkelingsstadia.

Longitudinale intravitale microscopie met behulp van een mammabeeldvormingsvenster met vervangbaar deksel

De hier beschreven intravitale beeldvormingsmethode maakt gebruik van collageen tweede harmonische generatie en endogene fluorescentie van de metabole co-factor NAD (P) H om een niet-invasieve tumormicro-omgeving te segmenteren in tumor-, stromale en vasculaire compartimenten voor diepgaande analyse van 4D intravitale beelden.

Een labelvrije segmentatiebenadering voor intravitale beeldvorming van de micro-omgeving van borsttumoren

Het huidige protocol beschrijft een eenvoudige techniek voor de intravitale beeldvorming van de borstklier van de zogende muis door middel van laserscanning, confocale en multifotonenmicroscopie.

Intravitale subcellulaire microscopie van de borstklier

We presenteren een protocol voor de chirurgische implantatie van een gestabiliseerd inwonend optisch venster voor subcellulaire beeldvorming van de alvleesklier van muizen, waardoor seriële en longitudinale studies van de gezonde en zieke alvleesklier mogelijk zijn.

Gestabiliseerd venster voor intravitale beeldvorming van de alvleesklier van muizen

Corticale doorbloeding dynamiek kan worden bestudeerd in vivo door beeldvorming fluorescente kleurstoffen dextran geïnjecteerd in de staartader van knaagdieren met twee-foton microscopie. Deze video laat zien hoe u foto doorbloeding dynamiek in neocortex van muizen door middel van een met glas overdekt craniale venster voorbereiding.

Een methode voor 2-Photon Imaging van de bloedstroom in de neocortex door middel van een Cranial Window

Het licht microscoop is een basisinstrument voor de celbioloog, die moet een grondig begrip van hoe het werkt, hoe het dient te worden aangepast voor verschillende toepassingen, en hoe het moet worden gehandhaafd als nodig is om een ​​maximale beeld-vorming van de capaciteit en de resolutie te verkrijgen. De onderdelen van de microscoop worden in detail beschreven hier.

Belangrijke componenten van de lichtmicroscoop

Mammatumor cellen die luciferase worden subcutaan geïmplanteerd in muizen en gevisualiseerd met behulp van optische beeldvorming om tumoren groei en ontwikkeling niet-invasief in een longitudinale studie monitor.

In vivo Bioluminescent Imaging van borsttumoren gebruik van IVIS Spectrum

Leer intravitaal photoswitchen en volgen van Dendra2-gelabelde tumorcellen in de muis mammair vetkussen. Deze techniek maakt gedetailleerde observatie van metastatisch gedrag in specifieke tumormicro-omgevingen mogelijk.

Dendra2 Photoswitching door de borstklieren Imaging venster

Meer video's verkennen