De combinatie van Peripheral Nerve enten en Matrix Modulation aan de benadeelde Rat Spinal Cord Repair

De voorbereiding voor het transplanteren van een perifere zenuw in een plek met een dwarslaesie begint met de predegeneratie van de PNG zeven tot 10 dagen vóór de transplantatie. De tak van de nervus tibialis van een donorrat wordt doorgesneden. Er wordt een hemisectie op cervical niveau vijf of C5 uitgevoerd door middel van aspiratie.

De PNG wordt verwijderd uit de donorrat, tegenover de rostrale wand van de laesieholte geplaatst en vastgezet door het aurum aan het dura mater te hechten. Drie weken later wordt een dorsale kwadrantlaesie gemaakt bij C7; gelfoam verzadigd met C-H-A-B-C wordt gedurende 15 minuten in de holte geplaatst om proteoglycanen van het gliale litteken te verteren. Twee dagen later wordt C-H-A-B-C micro-geïnjecteerd naast de laesieplaats en wordt het distale uiteinde van de PNG tegenover de dorsale kwadrantlaesie geplaatst.

Hallo, ik ben John Hula. Ik ben de directeur van het Spinal Cord Injury Research Center aan het Drexel University College of Medicine. Ik ben dr. Veronica Tom van het hula-lab en ik ben Martha mean.

Vanuit het hula-lab. Vandaag demonstreren we een procedure voor de transplantatie van een segment van een perifere zenuw in het beschadigde ruggenmerg van een volwassen rat. We gebruiken deze procedure in ons laboratorium om axonale regeneratie en het herstel van functies na ruggenmergletsel te bestuderen.

Oké, laten we beginnen. Om u voor te bereiden op de microscopische chirurgie, moet u het chirurgische station desinfecteren en alle chirurgische instrumenten autoclaveren. Bereid de thermische barrière en de kleine stukjes gelfoam van minder dan 2 mm³ voor voor microhemostase.

Leg wattenstaafjes, gaasjes en chirurgische instrumenten klaar. Plaats de geanestheseerde rat op de preparatietafel nadat met een teenknijp is bevestigd dat het dier volledig geanestheseerd is. Scheer een breed gebied met vacht weg van het beoogde chirurgische veld en was de operatielocatie volgens de aseptische scrubtechniek die wordt beschreven in het bijbehorende tekstprotocol.

Plaats de rat vervolgens op de thermische barrière, bedek de neus en mond met de inhalatiecone en verlaag het isofluorine naar 3% en de stroomsnelheid naar 0,2 liters per minuut. Dien de juiste dosis van het antibioticum ampicilline toe via een subcutane injectie en het analgeticum buprenorfine via een intramusculaire injectie. De perifere zenuw of PN wordt zeven tot 10 dagen vóór verwijdering getransecteerd om degeneratie te bevorderen, wat een omgeving creëert die geschikter is voor axonale groei dan een verse zenuwpreparaat.

Om te beginnen met de transectie van de pn, leg het dier op zijn zij. Stap over op steriele handschoenen en plaats een steriel chirurgisch afdekdoek rond de operatieplaats. Maak een rechte lijnincisie van de femurkop naar de knie, parallel en ongeveer drie millimeter van de femur, waarbij door de oppervlakkige biceps fems-spieren wordt gesneden langs dezelfde lijn als de huidincisie om de onderliggende musculus vastus lateralis bloot te leggen.

Zodra de musculus vastus lateralis is blootgelegd, gebruikt u een schaar om een kleine incisie te maken nabij de knie en breidt u deze uit in de richting van de femurkop. Scheid de musculus vastus lateralis voorzichtig met retractoren totdat de gecombineerde tibiale en perineale zenuwtakken van de nervus ischiadicus zichtbaar zijn, die parallel aan het femur lopen. Volg vervolgens deze zenuwtakken in de richting van de femurkop totdat de hoofdstam van de nervus ischiadicus is geïdentificeerd.

Gebruik vlak onder de splitsing van de nervus ischiadicus een fijne pincet om het bindweefsel of epineurium rond de tak van de nervus tibialis voorzichtig te scheiden. Dit is de grootste tak. Zodra de tak van de nervus tibialis is geïsoleerd, schuif een 6-0 zijden ligatuur eromheen en trek deze aan.

Gebruik microschaartjes om het zenuwstomp tot aan de ligatuur door te snijden. Haal de hechtdraad door de musculus vastus lateralis en maak een knoop. Dit dient als markering om het doorgesneden uiteinde van de nervus tibialis eenvoudig te kunnen lokaliseren.

Wanneer de zenuw is geoogst. Sluit vervolgens de musculus vastus lateralis met 6-0 zijden hechtingen. Sluit daarna de biceps femoris spier met 6-0 zijden hechtingen.

Sluit tot slot de huid met Michelle-wondclips. Zet de toevoer van isofluraan uit en verwijder de neuscone voor inhalatie. Plaats het dier in een kooi op een thermische barrière.

Plaats het dier terug in de thuiskooi. Zodra het dier alert en actief is, zeven tot 10 dagen later, is het PN-segment klaar om geoogst te worden. Om met de transplantatie te beginnen, wordt het geanestheseerde dier op de thermische barrière geplaatst.

Nadat is bevestigd dat het dier volledig is geanestheseerd, verwijdert u de wondclips en spreidt u de huidincisie. Het vooraf scheren van het gebied is mogelijk niet nodig, aangezien de huid gemakkelijk uit elkaar getrokken kan worden om contaminatie te voorkomen. Om het doorsnijden van vacht te vermijden, snijdt u door de hechting van de oppervlakkige spier om de vastus lateralis bloot te leggen en snijdt u vervolgens door de hechting in deze spier.

Volg de hechtdraadlijn tot aan het doorgesneden uiteinde van de nervus tibialis en verwijder de hechtdraad uit de zenuw. Gebruik fijne pincetten om het epineurium te dissekeren over een lengte van 15 millimeter van de nervus tibialis en snijd door dit distale uiteinde. Verwijder het zenuwsegment en dompel dit onder in steriele Hank's gebalanceerde zoutoplossing.

We zijn nu klaar voor de volgende stap, namelijk het induceren van een dwarslaesie voor de transplantatie van de PN; de transplantatie kan autoloog of heteroloog zijn. Plaats de geanestheseerde rat op de thermische barrière en dien antibiotica en analgetica toe zoals beschreven in de vorige sectie om een hemi-sectie van het ruggenmerg te induceren. Lokaliseer eerst de occipitale inkeping en het prominente T2 dorsale wervelproces.

Maak een incisie over de volledige lengte tussen deze externe referentiepunten. Snijd door de middellijn van de oppervlakkige musculus trapezius en scheid de onderliggende cervicale ardis-spieren. Plaats een spreider om de spieren uit elkaar te houden.

De diepe supraspinale spieren moeten worden losgesneden van de dorsale werveluitsteeksels van C4, C5 en C6. Voer met behulp van R-scharen een partiële laminectomie uit van C5 om de gehele rechterzijde en het mediale gedeelte van de linkerzijde van het ruggenmerg bloot te leggen. Gebruik de prominente dorsale vene als referentiepunt voor de middellijn van het ruggenmerg.

Gebruik vervolgens een microscalpelblad om de dura mater door te prikken en breid de incisie uit over het ruggenmerg op niveau C5. Maak met een getrokken glazen microcannule een kleine incisie in de onderliggende subarachnoïdale ruimte en de pia mater. Begin met het aspireren van de dorsale rechterzijde van het ruggenmerg door met zachte druk en microforceps het weefsel te scheiden en de verwijdering ervan te vergemakkelijken.

Ga verder door de intermediaire en ventrale delen van het ruggenmerg om een holte van twee millimeter lang te creëren die volledig loopt van dorsaal naar ventraal en van de middellijn naar de laterale meninges. Plaats met zoutoplossing verzadigd gel-schuim in de holte van de HEMI-sectielesie. Om hemostase te bereiken, wordt het eerder geoogste segment van de perifere zenuw uit de Hank-oplossing verwijderd.

Voel voorzichtig aan het epineurium van de proximale drie millimeter van het zenuwsegment en plaats dit uiteinde tegen de rostrale wand van de HEMI-sectie laesieholte. Bevestig het segment met 10-0 hechtingen door het epineurium aan de dura mater. Hecht vervolgens de dura gesloten over het geïmplanteerde uiteinde van het transplantaat en klem het transplantaat tussen twee stukken cellulair elastisch membraan.

Plaats het transplantaat langs de vertebrale processen van C6, C7 en T1. Plaats het distale zenuwuiteinde niet tegen het ruggenmerg of spierweefsel. Sluit de spieren in lagen met 4-0 hechtingen en sluit de huidincisie met wondclips.

Plaats het dier ten slotte in een kooi op een thermische barrière en breng het terug naar de thuiskooi. Zodra het dier alert en actief is, blijken geregenereerde axonen die het distale uiteinde van het PN-transplantaat bereiken vaak niet in staat om terug te groeien in het ruggenmerg. Daarom gebruiken we micro-injecties van chondroitinase ABC om het littekenweefsel rondom het letselgebied af te breken.

Deze procedure wordt 21 dagen na de PN-transplantatie uitgevoerd; bevestig eerst dat het dier volledig is geanestheseerd. Verwijder vervolgens de wondclips en dien antibiotica en analgetica toe zoals eerder beschreven. Knip met een fijne pincet en veerscharen door de oppervlakkige hechtingen om het elastische membraan rondom het zenuwtransplantaat bloot te leggen.

Bevrijd voorzichtig het zenuwsegment uit de elastische membranen. Verschuif de zenuw uit het operatieveld. Voer een partiële laminectomie uit aan de rechterzijde van het C7-wervelproces.

Doorboor de hersenvliezen met een microscalpelblad en bereid door aspiratie een dorsale kwadrantlaesieholte van één millimeter kubus voor in het C7-gedeelte van het ruggenmerg. Plaats met zoutoplossing gedrenkt gelfoam in de laesieholte om hemostase te bereiken. Vervang daarna het gelfoam door gelfoam dat gedrenkt is in chondroitinesulfaat.

A BC.Behandel de plek van de laesie gedurende 15 minuten door elke vijf minuten een nieuw met chondroïtine gedrenkt gelfoam-stukje aan te brengen. Bedek de externe lengte van het zenuwgraft met een scholastisch membraan. Sluit de oppervlakkige spieren met 4-0 hechtingen en de huidincisie met wondclips.

Plaats het dier in een verblijfskooi op een thermische barrière en breng het terug naar de thuiskooi zodra het alert en actief is. Twee dagen later, 23 dagen na de PN-transplantatie, wordt er opnieuw een operatie bij het dier uitgevoerd om chondroïtine NA in het ruggenmerg te micro-injecteren. Zoals voorheen worden de wondklemmen bij het geanestheseerde dier verwijderd en worden antibiotica en analgetica toegediend.

Snijd door de oppervlakkige hechtingen om het elastische membraan rondom het zenuwgraft bloot te leggen. Leg de C seven graftplaats vrij zonder het graft te verstoren. Gebruik vervolgens een Hamilton-spuit met een getrokken glazen canule om 1 µL chondroitinase ABC micro-injecteerbaar in de rechterzijde van het ruggenmerg aan te brengen, ongeveer 1 mm distaal van de aansluiting van het graft op het ruggenmerg.

Pel het EUR voorzichtig van de distale twee millimeter van het zenuwsegment en breng dit uiteinde in contact met de C7-laesieholte. Zet het segment vast met 10-0 hechtingen door het epineurium aan de dura mater. Sluit de oppervlakkige spieren met 4-0 hechtingen en de huidincisie met wondklemmen.

Plaats het dier in een kooi op een thermische barrière en breng het terug naar de thuiskooi zodra het alert en actief is. Wanneer deze procedure is geoptimaliseerd, zal het segment van de perifere zenuw nauw integreren met het ruggenmerg van de gastheer om spinale axonen te visualiseren die regenereren in het transplantaat. We hebben het transplantaat door diffusie gevuld met biotinylated dextrin amine of BDA, zowel ascenderend als descenderend.

Ruggenmergaxonen zullen over het algemeen het transplantaat binnendringen, in een relatief rechte lijn parallel aan de lengte van het transplantaat groeien en zich uitstrekken tot het distale uiteinde van het transplantaat met een snelheid van ongeveer één millimeter per dag. Perifere zenuwaxonen zullen het aangrenzende ruggenmerg penetreren. Indien chondroïtine NACE is gebruikt om inhiberende proteoglycanen uit het omliggende littekenweefsel te verwijderen, strekken bij behandeling met het vehikel zeer weinig perifere zenuwaxonen zich uit in het gastheerweefsel nadat ze het distale uiteinde hebben bereikt.

Wanneer de distale interface echter met chondroïtine werd behandeld, kwamen er significant meer axonen uit het transplantaat om het ruggenmerg opnieuw te innerveren. Zoals hier te zien is in deze ene representatieve sectie van de 15 tot 20 secties per dier waarin axonale uitgroei is waargenomen, toont deze staafgrafiek een significante toename van de axonale uitgroei na conjoin nace A BC-behandeling. Immunochemische detectie van synaptische markers op neuronen in het ruggenmerg als reactie op elektrische stimulatie van de axonen binnen het transplantaat kan worden gebruikt om de functionele connectiviteit tussen het getransplanteerde transplantaat en het ruggenmerg van de gastheer te beoordelen.

Dit ruggenmerggebied dat de distale aanhechtingsplaats bevat, werd immunocytochemisch gekleurd voor zowel gebiotinyleerde dextrineamine in het groen als de synaptische marker synapsine in het rood; pijlpunten geven gebieden aan waarin colocalisatie van markers plaatsvond, wat aangeeft dat sommige vezels die vanuit het transplantaat regenereerden, functionele synaptische contacten vormden. Functionele connectiviteit tussen het transplantaat en de neuronen van het ruggenmerg werd ook aangetoond door een assay voor CFOs-expressie. Na synaptische stimulatie van gastneuronen voorbij de distale interface kan deze transsynaptische activatiemarker worden geïdentificeerd door veel CFOs-positieve neuronen in weefsel ipsilateraal aan de transplantatieplaats, en bij een hogere vergroting kunnen zeer weinig CFOs-positieve neuronen worden waargenomen in weefsel contralateraal aan het transplantaat.

We hebben zojuist laten zien hoe u een letselplaats in het ruggenmerg voorbereidt voor de transplantatie van een perifeer zenuwgraft om regeneratie na ruggenmergletsel te bevorderen. Bij het uitvoeren van deze procedure is het belangrijk om eraan te denken dat er voldoende zenuwlengte aanwezig is vóór het enten en dat het graft nauw aansluit op de letselplaats van het ruggenmerg. Dat is alles.

Bedankt voor het kijken en veel succes met uw experimenten.